ứng dụng của chất xúc tác sinh học trong việc sản xuất hóa chất có độ tinh khiết cao

Lên menTrong vài năm, sự tổng hợp của acid ascorbic vitamin C và D-ephedrine đã giữ các mẫuđược phân lập của việc sử dụng đươc kiểm soát của xúc tác sinh học bên ngoài các quátrình lên m

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH-CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG 6: ỨNG DỤNG CỦA CHẤT XÚC TÁC SINH HỌC TRONG VIỆC SẢN XUẤT HÓA CHẤT CÓ ĐỘ TINH KHIẾT CAO

II Lên men

Trong vài năm, sự tổng hợp của acid ascorbic (vitamin C) và D-ephedrine đã giữ các mẫuđược phân lập của việc sử dụng đươc kiểm soát của xúc tác sinh học bên ngoài các quátrình lên men chủng hoang dã (“wild-type” fermentation) Nó không chỉ là các quá trìnhcông nghiệp quan trọng cho việc sản xuất hóa chất thương phẩm mà nó còn là một phầncủa concept phân biệt sự chuyển đổi lên men của rượu thành acid acetic trong sản xuấtgiấm hay việc sản xuất ethanol từ glucose, sự chuyển đổi D-glucitol thành L-sorbosetrong việc sản xuất acid ascorbic Trong sự chuyển đổi lên men chủng hoang dã với

Gluconobacter sp Để sản xuất acid acetic hoặc với Saccharosemyces cerevisiae để sản

xuất ethanol, các chủng được phép sinh trưởng trong cơ chất trước khi chuyển ssang các

quá trình chuyển đổi thích hợp Tương tự như vậy, trong ví dụ sau, Acetobactor suboxydans được phép tăng trưởng trong D-glucitol trước khi chuyển sang quá trình oxi

hoá của nó, trong đó L-sorbitol là là sản phẩm

Ascorbic acid D-ephedrin

1 Dung môi hữu cơ

Mặc dù hiệu quả của việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu hóa dầu, nhiều việc sảnxuất trên thế giới dựa trên quy trình lên men Trong 75 năm qua ở nước Mỹ, nơi mà tổngsản suất hằng năm hiện tại đứng ở mức dưới 4 triệu tấn Nguồn nguyên liệu hóa học cơbản biến động từ lên men sang hóa dầu và quay trở ngược lại (Bảng 1) Nguồn Cacboncho lên men là từ glucose lấy từ tinh bột Một lượng lớn hơn, khoảng 9.5 triệu tấn đượcsản xuất mỗi năm ở Brazil từ mía đường Ngày nay, nguồn tiêu thụ chủ yếu là động cơ ô

1963 197

7

1982

1911

Ở thế kỷ XIX, với một số quốc gia, việc bán thức uống có cồn phải chịu một mức thuếlớn Vì thế để tránh khỏi việc chịu mức thuế này ở ethanol dùng làm nhiên liệu, ethanolphải được biến tính “denatured” hoặc phải được thêm hóa chất để chúng trở nên không ănđược Ethanol sẽ được methyl hóa bằng cách bổ sung một lượng nhỏ methanol đủ để làmchúng trở nên độc và không thể uống được Việc sử dụng methanol là vì chúng có điểmsôi gần như ethanol nên rất khó để chưng cất hoặc loại bỏ Thêm vào đó, nếu được ănphải, methanol sẽ chuyển thành chất độc, chất không được bài tiết ra bên ngoài một cách

dễ dàng nên rất nguy hiểm cho sự tiêu thụ của con người Vào thế kỷ XX, sức ép về chínhtrị và xã hội đã cho phép lên men để cạnh tranh hiệu quả với hóa dầu như là một quá trìnhsản xuất Các thành tựu kỹ thuật trong hóa học, sinh học, và kỹ thuật đã làm thuận tiệnhơn cho việc chuyển đổi giữa cacbohydrate và dầu như là một nguyên liệu cho quy trình.Việc sản xuất acetone cho thấy những tác động khác nhau Nguồn nguyên liệu của nótrong thế kỷ XIX là cây gỗ Sự chưng cất phá hủy cấu trúc gỗ đã sản xuất ra cả acetone vàmethanol (Sơ đồ 1) Trong đó, gỗ nên được để khô trong không khí 12 – 18 tháng trước

3

chất dễ bay hơi (acetone)

chất rắn (calcium carbonate)

khi chưng cất Sau đó gỗ sẽ được cung cấp nhiệt để thành pyroligneous acid (hay còn gọi

là dấm gỗ) là một dung dịch màu sậm khi gỗ được nung nóng ở điều kiện kỵ khí để hìnhthành than gỗ Dấm gỗ chứa 80 – 90% nước của cây cùng với 200 hợp chất hữu cơ Dấm

gỗ sau đó được thêm chanh và tiếp nhiệt để thu các dung môi dễ bay hơi là acetone và

methanol

Ở vương quốc Anh, gỗ được nhập khẩu từ Úc, và sự cung cấp này đã bị cắt trong thểchiến thứ I Sau đó, Weizmann đã phát triển quy trình lên men dựa trên sự phát triển của

Clostridium acetobutilicum (sau đó gọi là Baciillus macerans) tên tinh bột và không có

oxy Sản phẩm là một hỗn hợp acetone, butan-1-ol, và ethanol tỷ lệ 6:3:1 về khối lượng,

ba dung môi này có điểm sôi khác nhau nên cho phép phân tách hiệu quả chúng bằngchưng cất Sự phát triển tiếp theo dẫn đến một loạt các quy trình, với các dòng Clostridiasản xuất acetone, butan-1-ol và propan-2-ol cũng như là việc phân tách sản phẩm Cácquy trình này làm cho việc sử dụng hiệu quả cacbohydrate đầu vào ít hơn cho lên menethanol, sản lượng của dung môi là khoảng 60% là tối đa (theo lý thuyết) so với khoảng80% cho ethanol

Sơ đồ 1 Chưng cất phá hủy cấu trúc gỗ

Nhiệt

Nhiệtadd limeNhiệt

Hình 1 Con đường lên men acetone – butanol – ethanol (ABE) bởi Clostridia

Quy trình này có liên quan đến quy trình lên men ở nấm men để sản xuất rượu, bia nhưng

sự lên men ABE được thực hiện trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt

Phương pháp vi sinh đã sớm tự tìm thấy trong sự cạnh tranh với sự phát triển của côngnghiệp hóa dầu, và ở UK, việc sử dụng lên men để sản xuất acetone đã được dừng lại vàonăm 1957 Tuy nhiên, phương pháp này vẫn được sử dụng ở một số nơi trên thế giới, đặcbiệt là Trung Quốc nơi mà dầu cung cấp ít Căn cứ vào ưu thế vượt trội hiện tại của lênmen trong thị trường ethanol ở US, sẽ không ngạc nhiên để thấy vài nhu cầu hiện tại của

họ cho việc sản xuất acteton, butan-1-ol và propan-2-ol

2 Acid carboxylic

Các quá trình lên men là nguồn tạo ra nhiều acid carboxylic, trong đó sản phẩm kíchthước lớn nhất là acid citric (5) và các amino acid L-glutamate (6) và L-lysine (7) Sự sảnxuất acid citric hằng năm của thế giới hiện nay trên 0.5 triệu tấn Thật vậy, con số này rất

có thể thấp hơn ước tính sản phẩm đầu ra ở Far East (các nước Đông và Đông Nam Á).Đặc biệt ở một số nước như Trung Quốc, nơi được ước tính sản xuất ở mức cao 0.9 triệutấn, thể hiện cho sự phát triển hằng năm được duy trì trên 8.5% trong vòng 60 năm qua

5

Citric acid L-glutamate L-lysine

Mặc dù acid citric là một phân tử đối xứng (achiral) đơn giản tương đối gồm 6 nguyên tửcacbon, việc sản xuất chúng là không hiệu quả khi tổng hợp hóa học nhưng có thể thựchiện ở quy mô lớn với lên men Thậm chí quy mô của tự lên men là lớn với thùng dungtích 500 m3 hiện nay được sử dụng Mức độ sử dụng rộng rãi của acid citric (các quy trình

đa dạng như điều chỉnh độ acid trong thực phẩm, làm sạch bề mặt kim loại, thay thế gốcphosphate trong chất tẩy hoặc là nhân tố để điều khiển đô sệt của bùn đã được sử dụngtrong việc khoan dầu) rất có thể là bởi vì quy trình lên men hiệu quả

Một số amino acid được sản xuất với số lượng lớn (Bảng 2) Chúng được sử dụng hầu hếtnhư là nguyên liệu thực phẩm, ví dụ để cung cấp thức ăn chăn nuôi Bởi vì D-enatiomersđược chuyển thành dạng có hoạt tính L-enatiomer trong cơ thể động vật, racemate đượcsản xuất hóa học có thể thường xuyên thay thế đồng phân tự nhiên có nguồn gốc từ quytrình lên men Sự lựa chọn con đường có thể thực hiện chủ yếu dựa trên cơ sở kinh tế.Ngược lại, việc cung cấp các nguyên liệu ban đầu cho các hợp chất khác như là chất làmngọt có hàm lượng calo thấp Aspartame (8) hoặc imipenem kháng sinh β-lactam(thienamycin) (9), cần đầu vào bất đối xứng (chiral input) Sự tổng hợp hóa học được sửdụng để sản xuất DL-methionine (10) và glycerin, nhưng rất nhiều amino acid giá trị khác

là sản phẩm của sự lên men hay là sản xuất phụ thuộc vào việc sử dụng enzyme

Bảng 2 Một số amino acid được sản xuất với số lượng lớn

Amino acid Phương pháp sản xuất Sản lượng hằng năm (tấn)

Aspartame Imipenem

3 Kháng sinh

Sau khi khám phá ra penicillin, ngành công nghiệp kháng sinh đã có ảnh hưởng chủ yếuđến việc phát triển của quy trình lên men Hơn một trăm hợp chất đã được lên men dựatrên cơ sở thương mại, hầu hết được sử dụng trong con người, thú y và trong nông nghiệp,nhưng yêu cầu cho những nguyên liệu này là không lớn như acid citric và amino acid.Nhiều nguyên liệu được chuẩn bị như sản phẩm kích thước thô, đặc biệt là kanamycin(11) hoặc blasticidin (12), được sử dụng trong nông nghiệp Nói chung giá trị của chúngnhư là các thực thể hóa học, đặc biệt là cho ngành công nghiệp dược phẩm, không nằm ởsản phẩm tự lên men nhưng nằm ở các hợp chất được tạo ra bởi chúng Từ vi khuẩn,25.000 tấn penicillin được sản xuất mỗi năm đặc biệt có giá tri Trong bối cảnh đó, giá trịcủa chúng như là sản phẩm lên men chỉ được cạnh tranh bởi các protein tái tổ hợp

Sự khảo sát các sản phẩm lên men nên minh họa là: (a) quy mô sản xuất, để có thể cạnhtranh với công nghiệp hóa chất số lượng lớn, (b) phạm vi của các đơn vị hóa học, từethanol cho tới kháng sinh và (c) giá trị của ngành công nghiệp đặc biệt là cung cấpnguyên liệu ban đầu cho tổng hợp hóa học

III Steroids

Steroids là hormone động vật Tuy nhiên, tiềm năng về sản xuất dược phẩm không thểđược khai thác do sản xuất phụ thuộc vào phương thức tách chiết estrone (13) từ urine củathai ngựa cái Cholesterol và mật acid là nguồn tốt hơn nhưng một trong những bước khởiđầu cần thiết cho chuyển hóa có liên quan đến sự oxi hóa Crom III, quá trình chuyển hóa

7

này không hiệu quả, Cho đến khi vào đầu năm 1940 Marker nhận ra rằng progesterone(15) và testosterone (16) có thể được tổng hợp từ diosgenin (17), là steroid thu được từ họ

khoai tây (Dioscorea mexicana ) phát triển ở Mexico, dùng trong phát triển hóa chất tổng

có chức năng cho sự chuyển hóa nguyên tử cacbon kế cận là C-11 Tuy nhiên cần 6 bướchóa học để chuyển oxy từ C-12 thành -orientation tại C-11, nhằm thay đổi thành cấu trúccủa thuốc kháng viêm, ví dụ như beclomethasone (20)

testosterone (16)progesterone (15)

estrone(13)

hecogenin (19)diosgenin (17)

hydrocortisone (21)

Quy trình trên được đơn giản hóa vào năm 1952 khi Petersen và Murray mô tả sự hydro

hóa tại C-11 được xúc tác bởi nấm Rhizopus arrhizus Mặc dù sự oxy hóa tạo ra

11-hydroxysteroid nhưng sự nghịch đảo cấu hình của nhóm hydroxyl tương đối đơn giản.Quy trình có thể trở nên hợp lý với sự hoạt hóa lại trong ứng dụng của xúc tác sinh học và

nó có ảnh hưởng đáng kể đến sự sản xuất steroid trong tương lai

Mặc dù phản ứng 11-hydroxylation có thể ứng dụng trong quy trình thương mại nhưng nókhông được hiệu quả Quy trình có tính chọn lọc cao nhưng cường độ xúc tác chậm Nấm

sẽ phát triển đầu tiên trong điều kiện lên men bình thường Steroid được thêm vào nhằmphân tán nồng độ cuối giữa 0.1 % và 1% nhưng kém hòa tan trong môi trường lên menlỏng Xúc tác cho phản ứng trên là cytochrome P-450 mono-oxygenase gắn với màng nộibào Đây là enzyme phức tạp đòi hỏi co-factor NADPH để khử 1 nguyên tử của phân tửoxygen thành nước trong khi nguyên tử oxy khác kết hợp vào steroid

Sự phân hủy của chất nền được chuyển vào tế bào và chuyển sản phẩm ra khỏi sự xúc tácchậm, quy trình có thể diễn ra trong vài ngày NADP+ bị khử thành NADPH bên ngoài tếbào Một vị trí khác trên steroid bị khử, đặc biệt là vị trí 6x nếu steroid quá dài trong tiếpxúc với tế bào

Sự xử lý steroid nhờ vi sinh vật Curvularia iunata được giới thiệu là nhóm 11-hydroxyl,

đây là quy trình xúc tác thương mại phổ biến từ vi sinh vật thông qua biến đổi acetoxyl-11-deoxycortisol thành cortisol (hydrocortisone) (21) Phản ứng cần chú ý trongđiều khiển sự khử 11-hydroxylation vì nguyên tố cacbon khác trong steroid có thể bị oxyhóa đặc biệt là dẫn xuất 9-OH và 14-OH Vi sinh vật có khả năng hydro hóa hầu hết các vịtrí trên steroid nhưng chỉ có sự oxy hóa tại vị trí C-16 là được sử dụng trong quy trình sản

17-xuất, ví dụ 9-fluoro-16-hydroxycortisol trong phản ứng xúc tác bởi Streptomyces roseochromogenes.

∆-dehydrogenation được xúc tác bởi Arthrobacter simplex Phản ứng này được sử dụng

trong sản xuất hương liệu A-ring trong 19-norsteroids như là estrone (13) hay mestranol(22), và một số ít nhóm 19-methyl Đây là phản ứng thích hợp với sự hiện diện của các

9

mestranol (22)

chất hữu cơ không tan Nó cung cấp pha lỏng thứ cấp trong sự tan của steroid Trong

trường hợp tế bào của A simplex cho phép sự hiện diện của toluene với số lượng thích

hợp được thêm vào phản ứng

Hai lợi ích khác từ sự chuyển hóa từ vi sinh vật minh họa làm thế nào các yếu tố bênngoài ảnh hưởng đến quy trình sản xuất hóa chất công nghiệp Đến năm 1970, chính phủMexico bắt đầu kiểm soát các củ hoang dã có khả năng chiết xuất diosgenin, và cho đếnnăm 1976 giá của nó tăng hơn 20-fold tới 5600 $ 1 tấn Điều này dẫn tới các nghiên cứunhằm tìm ra các nguồn cung cấp khác Stigmasterol (23) thu từ đậu nành được xem như 1phương pháp thay thế và mạch 17b của sterol được biến đổi từ đơn vị cacbon củaprogesterone (15) Tuy nhiên, stigmasterol trong tự nhiên có sự pha trộn nhiều b-sitosterol(24), không thể sử dụng đối với mạch no và b-sitosterol tích lỹ các sản phẩm không mongmuốn trong sản xuất stigmasterol thay thế diosgenin

Nghiên cứu các vi sinh vật bắt buộc sử dụng steroid, như -sitosterol, đối với khuôncacbon cho thấy chúng thường bắt đầu oxi hóa mạch thẳng của nhân steroid, tạo thành sảnphẩm 17-keto steroid Sự hydro hóa tại tại C-9 và ∆-dehydrogenation tại C-1 Những quátrình trên có thể bị ức chế bằng việc bổ sung kim loại nặng vào môi trường chuyển hóahoặc kiềm hãm sự phân hủy sắt với -dipyridyl Một vài dòng vi sinh vật chứa 2 enzyme

có hại được phân lập.Quá trình chuyển hóa với sự oxi hóa b-sitosterol từ androstenedione(25) là vật liệu có ích để tổng hợp thuốc tránh thai Kết quả là các chất thải được tích lũy

b-sitosterol (24)Stigmasterol (23)

nor-gestrol (26)androstenedione (25)

từ sử dụng stigmasterol trở thành nguồn tài nguyên có giá trị và được gọi là “sitosterolmine”.

Giá trị của diosgenin tăng cao làm kích thích những nghiên cứu về tổng hợp hóa học củasterois Chiến lược đạt được nhiều thuận lợi, một trong số đó là việc có sẵn những thànhphần dựa vào 18-methyl-19-norsteroid cũng như nor-gestrol (26), không có từ tự nhiên.Một phần của quy trình tổng hợp prochiral cyclopenta-1,3-diones được làm làm giảm bởiRhizopus arrhizus hoặc Sacchromyces uvarum Đây là chiến lược nhằm đóng vòng C củasteroid với đúng hóa học lập thể tại C-17

IV Sản xuất các amino acid

Có nhiều con đường tổng hợp amino acid bất đối xứng (chiral amino acids) Hầu hết đượcgiải quyết thông qua việc chuẩn bị hỗn hợp racemic, nhưng cũng có những cách tổng hợptrực tiếp từ những tiền thân đối xứng (achiral) Hỗn hợp racemic (racemic mixture) là hỗnhợp không có tính chất quang học với 50% đồng phân quay phải và 50% đồng phân quaytrái (tỉ lệ đồng phân D (R) và L (S) là 50:50) Sự biến đổi một dạng đối quang tinh khiếtcủa một chất quang hoạt thành hỗn hợp racemic tương ứng gọi là sự racemic hóa(racemisation) xảy ra dưới ảnh hưởng của nhiệt, ánh sáng hoặc hóa chất Trong quy môlớn, cả hai phương pháp đều được mô tả, mặc dù một số quy trình phức tạp có thể chỉ là

sự minh họa ở một số nhà máy hơn là được áp dụng rộng rãi trong sản xuất

1 L- methionine

Phương pháp sử dụng enzyme để xử lý DL-methionine được giới thiệu từ những năm

1950 Bắt đầu với hỗn hợp đồng phân DL-methionine, thực hiện phản ứng N-acetyl hóagắn gốc acetyl (CH3CO) vào phân tử methionine tại vị trí của N, thu được hỗn hợp N-acyl-DL-methionine Sau đó thực hiện phản ứng deacetyl hóa với enzyme aminoacylase

Tế bào nấm mốc Aspergillus oryzae sản sinh enzyme acylase được sử dụng để thủy phân

N-acyl-DL-methionine Mặc dù hầu hết nấm mốc đều có thể sản xuất acylase nhiều hay

ít, nhưng hoạt tính cao nhất là ở Aspergillus và Penicillium, trong đó Aspergillus oryzae

No 9 là dòng thích hợp nhất Enzyme acylase đặc hiệu cho sự tạo thành đồng phân L, sảnphẩm sau quá trình thủy phân gồm L-methionine và N-acyl-D-methionine Sau khi loại bỏ

tế bào nấm mốc, pH của dịch lọc sẽ được điều chỉnh để làm kết tủa L-methionine tại điểmđẳng điện của nó (pI khoảng 5.74), trong dung dịch còn lại N-acyl amino acid Dung dịchđược xử lý hóa học tạo hỗn hợp racemic và được đưa trở lại vào phản ứng thủy phân.Phản ứng thủy phân và racemic hóa là những chiến lược cơ bản trong tổng hợp aminoacids

11

Sơ đồ 2 Sản xuất L-methionine

Việc sử dụng cả tế bào của A oryzae để làm nguồn enzyme xúc tác là không tiện lợi và

việc sử dụng chúng cũng gặp một số bất lợi như khó tinh chế sản phẩm, sản lượng thuđược thấp, và khó có thể sử dụng lại nguồn tế bào Tế bào nấm mốc được nuôi cấy và thunhận sau đó cho vào hỗn hợp cần chuyển đổi Những tế bào này không chỉ có enzyme xúctác cho quá trình thủy phân mà còn chứa nhiều enzyme khác, một số trong đó có thể oxyhóa phân tử methionine mới được tạo thành, hoặc xúc tác sự giải phóng những chất tankhác trong tế bào Tất cả những tạp chất này có thể làm nhiễm hỗn hợp phản ứng và khóthu nhận sản phẩm Sau khi sử dụng, tế bào nấm mốc có thể được thu nhận lại và sử dụngcho lần tiếp theo, nhưng hoạt tính xúc tác của chúng giảm rất nhanh chóng bởi vì tế bào

đã bắt đầu bị ly giải và phân hủy

Xử lý methionine bằng phương pháp enzyme cố định có thể là một trong những quá trìnhsản xuất đầu tiên giải quyết những vấn đề nêu trên Enzyme được tách chiết từ tế bào nấmmốc và cố định trên cột trao đổi ion Phương pháp cố định này dựa trên lực tương tác iongiữa enzyme mang điện tích (-) và các hạt resin mang điện tích (+) Ưu điểm của phươngpháp này là đơn giản, dễ thực hiện, ít ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Nhược điểmchủ yếu là enzyme dễ hòa tan trở lại trong quá trình sử dụng lặp lại nhiều lần, độ liên kếtlỏng lẻo do phụ thuộc nhiều vào pH và lực ion Enzyme vẫn giữ được hoạt tính khi bámvào các hạt nhựa resin, nơi quá trình xúc tác diễn ra như là ở trong pha rắn Hỗn hợp phảnứng sẽ được đổ vào và chảy qua cột Khi phản ứng thủy phân diễn ra, sẽ sinh ra acidcarboxylic làm pH của dung dịch giảm và cần phải được điều chỉnh để ngăn ngừamethinonine kết tủa Nếu nó thể kiểm soát được pH, sự phân giải sẽ được chuyển quanhững bước tiếp theo Đây là một quy trình tiện lợi và vệ sinh hơn so với quy trình cũ là

sử dụng toàn bộ sinh khối tế bào A oryaze Tuy nhiên, đây không phải là quy trình sản

xuất với quy mô lớn, với chỉ 150 tấn L-methionine được sản xuất mỗi năm

2 4-hydroxy-L-phenylglycine

Những hệ thống tương tự như đã mô tả ở phần 6.4.1 được sử dụng để xử lí hỗn hợp

racemic của những dẫn xuất amino acid khác Sản xuất L-amino acids để tổng hợp khángsinh là một ví dụ Phenylglycine (có đồng phân L là một moiety trong ampicillin bán tổnghợp và cephalexin) được tổng hợp theo cách cổ điển như là một muối diastereomic, trongkhi dẫn xuất của nó, 4-hydroxyphenylglycine (tiền thân của amoxicillin) được thu nhận từquy trình xử lý bằng enzyme Có nhiều cách tổng hợp đã được công bố, một trong số đó

là cách phân giải hydantoin tương ứng Hydantoin hay glycolylurea là một hợp chất hữu

13

Hình 2 Hệ thống sản xuất L-methionine

cơ vòng 6C với công thức phân tử là CH2C(O)NHC(O)NH, là một chất rắn không màutạo ra từ phản ứng của glycolic acid và urea Các dẫn xuất chứa hydantoin trong phân tửđược dùng như những chất trung gian trong sản xuất amino acid tương ứng Ở quy trìnhnày, phân giải dẫn xuất hydantoin tương ứng tạo ra N-carbamoyl-4-hydroxy-phenylglycine Dẫn xuất của hydantoin được chuyển thành hỗn hợp racemic ở pH kiềmtrong khi dẫn xuất N-carbamoyl thì không Vì thế sẽ chuyển đổi được một lượng đáng kể

từ hỗn hợp racemic ban đầu và sản phẩm dễ dàng được chuyển đổi thành amino acidtương ứng khi sử dụng nitrous acid

Hydantoinases là những enzyme đặc biệt hữu ích vì hydantoins là những chất trung giantrong quá trình tổng hợp của nhiều amino acid Những enzyme có thể đặc hiệu cho cả

đồng phân D và L Enzyme từ Pseudomonas striata có hoạt tính cao nhất chống lại

dihydrouracil Những chất hoạt động nhất trong hydantoins được tạo thành từ amino acidsbéo trung tính, nhưng nhiều chất tương tự phenylglycine cũng vẫn bị phân giải

Có những cách sản xuất 4-hydroxyphenylglycine khác đã được công cố, một trong số đóliên đến quá trình phân giải ethyl ester nhờ enzyme xúc tác Vì chất này đã bị khóa hoàn

Hình 3 Hoat động trong embrane reactor

toàn ở chức năng của nhóm amino và nhóm carboxylate nên nó rất khó tan trong nước vàchỉ tan trong dung môi hữu cơ Quá trình thủy phân đặc biệt của ester được xúc tác bởienzyme nằm giữa pha nước và pha dung môi, sinh ra acid carboxylic tan trong nước và sẽđược chuyển vào pha nước Điều kiện của phản ứng vì thế sẽ ảnh hưởng đến quá trìnhthủy giải ester và khả năng dễ dàng tách sản phẩm Trong thực tế, enzyme được cố địnhtrên một màng ưa nước nằm ở giữa hai pha nước và dung môi hữu cơ Membrane reactorgồm có một bó lớn những sợi ống rỗng, mỗi sợi có đường kính bên ngoài khoảng 300m

mà bề dày khoảng 50m Pha nước chảy qua trong lõi sợi, trong khi pha hữu cơ chảy ngoài

bề mặt sợi Hai đầu của mỗi sợi là các hạt resin giúp cho nước không trộn lẫn với dungmôi hữu ở vị trí hai đầu Sự thủy phân xảy ra khi hỗn hợp racemic ester được đưa vàotrong pha dung môi Khi ester thấm tới tấm màng chứa enzyme, chúng sẽ bị enzyme phângiải, tạo thành L-acid tan trong nước và chảy vào pha nước ở lõi và được đưa ra ngoài D-eter còn lại không tan trong nước nên vẫn nằm trong pha dung môi và cũng được đưa rangoài, thực hiện phản ứng racemic hóa tạo hỗn hợp racemic để lại đưa vào phải ứng Quátrình này, được phát triển bởi Sepracor Inc., có thể không phải là quá trình hoàn toànmang tính thương mại, nhưng nó đại diện cho sự sáng tạo trong việc sử dụng enzymetrong phản ứng mà cơ chất khó tan trong nước Mặt khác, công ty Kanegafuchi đã sửdụng enzyme hydantoinase để sản xuất 1200 tấn amino acid cần thiết cho sản xuất ra

2800 tấn amoxicillin mỗi năm

3 L-cysteine

Phần lớn cysteine trên Thế giới được tách chiết từ keratin, một protein chủ yếu được thunhận từ tóc Quá trình sản xuất dựa trên phản ứng thủy phân trong môi trường acid củaprotein, tạo ra mùi hôi và sản phẩm thải ra rất khó xử lí Hiện tại nó đã được thay thế bằngviệc tổng hợp enzyme mà một lần nữa lại có sự kết hợp của phân giải đồng phân lập thể

và phản ứng racemic hóa Methyl-2-chloroacrylate được chuyển đổi thành delta-2-thiazoline-4-carboxylate, và cả hai đồng phân của quá trình trung gian này sau đó

DL-amino-đều được thủy phân bởi enzyme từ Pseudomonas thiazolinophilum hay Sarcina lutea một

cách trực tiếp thành L-cysteine Quá trình racemisation cần thiết xảy ra một cách tự nhiêntrong suốt phản ứng

15

4 L-aspartate

Nhu cầu về L-phenylalanine và L-aspartate ngày càng tăng vì chúng là những nguyên liệuđầu vào cho sự tổng hợp chất làm ngọt có hàm lượng calo thấp Aspartame Những aminoacids trước đó là sản phẩm của lên men, trong khi sau này được sản xuất bằng quá trìnhxúc tác enzyme từ fumaric acid và ammonia Một phản ứng ngược được phát hiện đầu

tiên vào năm 1926, trong đó những tế bào chưa hoạt hóa của E coli thực hiện phản ứng

khử amin L-aspartate thành fumarate Vào những năm 1950, người ta đã phát hiện rằngnhững tế bào đang phát triển của E coli sẽ tích trữ L-aspartate khi bổ sung thêm fumarate

và ion ammonium vào môi trường nuôi cấy Enzyme chị trách nhiệm cho phản ứng thuậnnghịch này là L-aspartate ammonia lyase, thường đường gọi là fumarase

Tổng hợp chọn lọc những đồng phân yêu cầu từ những tiền thân đối xứng đơn giản nhưalkene là con đường được ưa thích cho mọi sản phẩm bất đối xứng Thậm chí nếu việc tạohỗn hợp racemic, như khi tổng hợp của L-methionine và L-cysteine, là cần thiết, thì vẫn

có ít bước hơn với quy trình tổng hợp từ những hợp chất đối xứng đã được lựa chọn cẩnthận Việc sản xuất trong trường hợp này đạt hiệu quả cao Nó được xúc tác bởi toàn bộ tếbào E coli hoặc bởi enzyme tách chiết ra từ tế bào Trong cả hai trường hợp, chất xúc tácđều được cố định, ví dụ như cố định tế bào trong những hạt poly-acrylamide gel gắn lêncột Chất phản ứng được đổ vào cột như quá trình đã được mô tả trong sản xuất L-methionine ở trên L-aspartic tạo thành được thu lại từ dòng chảy khi làm acid hóa ở pH2.8 Hiệu suất của sản phẩm đạt 90%

Sơ đồ 3 Sản xuất L-cysteine

V Beta-lactam antibiotics

Beta-latam antibiotics là một họ kháng sinh gồm nhiều loại kháng sinh phổ biến hiện naynhư penicillins, cephalosporins, carbapenems và monobactams, với cấu trúc lõi có chứavòng beta-lactam

Vòng beta-lactam cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh Trong các phân tửkháng sinh, beta-lactam nằm trong lõi, kết hợp với các nhóm khác sẽ loại bỏ sự bền vữngcủa liên kết cộng hóa trị trong vòng, làm cho vòng hoạt động hơn Hầu hết beta-lactamantibiotics hoạt động dựa trên sự ức chế tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn làm cho vikhuẩn không thể nhân lên Vòng beta-lactam ức chế những enzyme liên quan đến lắp rápvách tế bào ở bước cuối như transpeptidase và carboxypeptidase Tuy nhiên trong tựnhiên có những vi khuẩn kháng lại beta-lactam antibiotics Chúng biểu hiện gen mã hóacho beta-lactamase là một loại enzyme có thể phân giải vòng beta-lactam Vì thế, đối vớinhững loại vi khuẩn có enzyme này, việc điều trị bằng beta-lactam antibiotics sẽ khônghiệu quả

17

Hình 4 Vòng beta-lactam

Hình 5 Beta-lactamase phá hủy vòng beta-lactam

Mặc dù penicillins tự nhiên, như benzyl penicillin (G) và phenoxyl methyl penicillin (V),

là những kháng sinh hữu hiệu, sự phát triển của chúng để trở thành dược phẩm thiết yếu

bị giới hạn cho đến khi tìm ra được một phương pháp thuận tiện để biến đổi 6-amido ởchuỗi bên Chuỗi bên mới tăng cường hoạt tính kháng sinh của vòng beta-lactam và cảithiện khả năng kháng lại enzyme beta-lactamases của vi khuẩn Đặc điểm cải thiện nàytạo nên đặc tính thương mại đáng giá cho sản phẩm

Vùng nhân của beta-lactam không ổn định khi pH nhỏ hơn 2 hoặc lớn hơn 9, cho phépquá trình thủy phân đơn giản với xúc tác acid hoặc base để giải phóng lõi beta-lactam 6-APA (6-aminopenicillanic acid) Mặc dù hợp chất này chỉ là một thành phần nhỏ trong lên

men Penicillium acremonium thương mại để sản xuất penicillins tự nhiên thì đây vẫn

không phải là phương pháp thích hợp để sản xuất sản phẩm Một bước đột phá lớn trongnhững năm 1960 khi nhiều nhóm nghiên cứu cho thấy rằng có nhiều vi sinh vật có thểphân giải những liên kết exo-cyclic amide một cách đặc hiệu, mà không phá hủy vòngbeta-lactam

En

zyme có nguồn gốc từ E coli sẽ phân giải penicillin G thành 6-APA, và phản ứng này

nhanh chóng được đưa vào quy trình sản xuất Vài chục năm sau, một quá trình tương tựcho thủy phân penicillin V được phát triển, dựa vào enzyme từ một loại nấm lớn

(basidiomycete), Pleurotus oestratus Phản ứng thường được thực hiện ở pH 8, và hiệu

suất thu được 6-APA vào khoảng 90%

Một quy trình hóa học được phát triển ngay sau đó với việc sử dụng PCl5 để phá vỡ liênkết amide Một phần vì bản quyền sáng chế, một phần bởi vì quy trình này thuộc về hóahọc nhiều hơn là enzyme học, con đường hóa học này trở nên cạnh tranh với phương phápxúc tác enzyme trong vài năm Nó chỉ đúng cho phân giải peninillin V, ở những nơi màđôi khi những enzyme thích hợp không có sẵn Tuy nhiên, hầu như tất cả 16 000 tấnpenicillin mà hiện nay được chuyển đổi thành 6-APA là dựa vào enzyme xúc tác

Mặc dù ở nồng độ cao (khoảng trên 50g.l-1) cân bằng của phản ứng xúc tác bởi enzyme ở

pH 8 thay đổi đáng kể so với lúc thủy phân hoàn toàn, và ở pH 5 sẽ chuyển về phía tổnghợp amide, sự thay đổi này vẫn không phải là một phương pháp hiệu quả để tổng hợp lại

Sơ đồ 4 Enzyme phân giải penicillin thành 6-aminopenicillanic acid (6-APA)

amide Giá trị thương mại của 6-APA là khoảng $75/1 kg, và một số những phân tử đãthay đổi chuỗi bên khác cũng có giá trị như thế Nếu việc tổng hợp amide không đạt đượcsản lượng cao, quá trình sản xuất penicillin mới dường như không khả thi Những sảnlượng từ con đường xúc tác enzyme này đã không được ghi nhận lại, và cho đến khichúng được chú ý tới, phương pháp hóa học vẫn được duy trì như là phương pháp chuẩntrong xử lí với chuỗi bên mới

Cephalosporin C là một dạng quan trọng khác của beta-lactam antibiotics tự nhiên, được

tách chiết từ quá trình lên men Acremonium chrysogenum Chúng liên quan tới penicillin

G, và sự tổng hợp của chúng cũng bắt nguồn từ cùng một chất chuyển hóa trung gian,isopenicillin N Không giống như penicillins, dạng tự nhiên của cephalosorin không được

sử dụng trong điều trị, và việc sản xuất của tất cả cephalosporins hữu ích đều cần bỏ đichuỗi bên 7-aminoadipyl để tạo nên 7-ACA (7-aminocephalosporanic acid) Đây vẫn làmột quá trình hóa học trong đó NOCl hoặc PCl5 được dùng để phá vỡ liên kết exo-cyclicamide Quy trình hóa học kết hợp với enzyme sản xuất 7-ACA gồm hai bước phức tạpđược thực hiện ở -400 đến -600C trong thời gian dài Hơn nữa, quá trình sử dụng nhữnghóa chất nguy hiểm như phosphorous pentachloride, nitrosyl chloride và pyridine Sự loại

bỏ tạp chất khi tinh chế sản phẩm gặp khó khăn

19

Sơ đồ 5 Quy trình hóa học kết hợp với enzyme sản xuất 7-ACA