1. Sản phẩm protein và kỹ thuật protein
Quy trình kỹ thuật gene có thể biến đổi sự tổng hợp protein ở hầu hết vi sinh vật hoặc một vài tế bào khác trong lên men. Các protein tái tổ hợp có giá trị thương mại như là insulin, erythropoietin và interferon được quan tâm đáng kể. Nguồn enzyme protease đặc hiệu trong tự nhiên được sử dụng sản xuất phô mai là từ dạ dày bê. Quy trình sản xuất này được gia tăng bằng sự chuyển đổi của sinh vật tái tổ hợp và mỗi năm Pfizer tiêu thụ hơn 2 tấn của Chymax.
Sự xúc tác sinh học quan trọng là tinh khiết, tuy nhiên hạn chế là nhiều xúc tác sinh học có ích thường thu được từ các nguồn tự nhiên, những sản phẩm thu được từ sự biến đổi của sinh vật tái tổ hợp có thể cung cấp lượng hợp lý theo nhu cầu. Công nghệ này ngày càng có triển vọng phát triển trong tương lai.
Hoạt động của enzyme phụ thuộc vào cấu trúc ba chiều của nó và sự gấp nếp trong trình tự sơ cấp của amino acid trong chuỗi peptide. Tính đặc trưng và chọn lọc của xúc tác do sự tương tác của chất nền với vị trí của amino acid trên mạch trong protein. Phân tích sự tương tác thường dựa vào tinh thể học tia X.
Tinh thể học tia X xác định sự sắp xếp của các nguyên tử bên trong một tinh thể dựa vào dữ liệu về sự phân tán của các tia X sau khi chiếu vào các electron của tinh thể. Sau khi xây dựng được hình ảnh 3 chiều của mật độ các electron bên trong tinh thể, vị trí của nguyên tử tính trung bình, các liên kết hóa học... có thể được thu thập.
Bước quan trọng trong tinh thể học tia X là sự nhiễu xạ tia X từ tinh thể. Một tinh thể là một vật rắn với các nguyên tử bên trong có trật tự cố định và được lặp đi lặp lại dọc theo 3 hướng chính gọi là vector cơ sở hay vector lưới (bais hay lattice). Nhiều chất có thể chuyển về dạng tinh thể như muối, kim loại, khoáng chất, chất bán dẫn, cũng như các phân tử vô cơ, hữu cơ hay sinh học khác.
Sau khi thu được dạng tinh thể của một chất, nó sẽ được treo lên máy đo góc (goniometer) và được bắn tia X vào, tạo ra các mẫu nhiễu xạ của các điểm gọi là điểm phản xạ. Tiếp theo, tinh thể sẽ được xoay tròn từ từ (theo một độ dời góc nhất định) và cứ mỗi lần xoay ta lại thu thập một mẫu nhiễu xạ mới. Tập hợp các ảnh 2D này sẽ được chuyển thành một mô hình 3D về mật độ của các electron bên trong tinh thể nhờ phương pháp toán học biến đổi Fourier và dữ liệu hóa học của mẫu (tức là ta đã biết thành phần hóa học của chất). Từ đó, có thể suy ra vị trí của các nhân nguyên tử mật độ electron và dữ liệu hóa học.
Có một vài quy tắc về sự gấp cuộn của protein. Các khuôn mẫu thường được bảo tồn trong các enzyme có liên quan, thay vì những thay đổi trong trình tự amino acid sơ cấp.
Toàn bộ đặc trưng của trung tâm xúc tác được mô tả bằng cấu trúc X-ray, và bản chất chung của xúc tác thường được mô tả khi các thông tin về cấu trúc được kết hợp với dữ liệu từ phản ứng động học và những ứng dụng kỹ thuật gene để thay thế amino acid.
Không may, một vài đặc trưng quan trọng của sự xúc tác dựa vào vị trí chính xác của tương tác, đây là hạn chế của X-ray.
Sự trao đổi của amino acid dễ bị oxy hóa (tủa methionine) có thể cải thiện tính ổn định của enzyme nhưng thường hao phí hoạt động xúc tác ở mức thấp. Sự kết hợp của các cầu nối disunfit có thể làm tăng tính ổn định nhưng thường không có sẵn ở các enzyme tự nhiên trong điều kiện thích hợp. Những thay đổi trong vị trí hoạt động của amino acid có thể ảnh hưởng đến tính chất xúc tác, những thay đổi trên có thể đạt được bằng biến đổi hóa học hoặc đột biến tự nhiên và chọn lọc
Việc loại bỏ những ảnh hưởng không thực tế cung cấp nhiều thông tin về cơ chế hóa học của xúc tác enzyme. Những quy tắc cơ bản được hiểu rõ hứa hẹn đem đến triển vọng tái thiết kế hợp lý các enzyme.
2. Kỹ thuật chuyển hóa và sản xuất acid ascorbic
Phương pháp thích hợp đối với xúc tác sinh học trong công nghiệp là sử dụng kỹ thuật gen để tạo thành protein mới trong tế bào. Các sản phẩm thương mại như insulin, chymosin không ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của tế bào, đây là sản phẩm cuối cùng của quá trình. Mặt khác, tế bào bị biến đổi tạo thành những enzyme mới tham gia vào hoạt động chuyển hóa trong tế bào, nó bắt đầu mở rộng con đường chuyển hóa trong tế bởi một hoặc hai bước mong muốn, hoạt động trên không thể đạt được bằng quy trình đột biến hay chọn lọc bình thường mà chỉ có thể đạt được thông qua bổ sung enzyme. Khái niệm trên được ứng dụng trong nhiều quy trình thương mại, một trong số đó là sản xuất acid ascorbic.
Những năm gần đây, có nhiều nỗ lực nhằm đơn giản hóa tổng hợp Reichstein (chapter 1) sản xuất khoảng 50000 tấn acid ascorbic mỗi năm. Đầu tiên là những nổ lực dựa trên sự oxi hóa glucose của vi sinh vật từ 5-ketogluconate nhờ Acetobacter xylinum được phát hiện bởi Brown. Những vi sinh vật khác bao gồm Acetobacter sp và Erwinia sp có thể oxi hóa glucose từ 2,5-diketo-D-gluconate. Sự khử hóa học khi kết hợp giữa 2-keto-D- gluconate và 2-keto-L-gluconate phụ thuộc vào tính chọn lọc của sự khử nhóm cacbon, nhưng sự khử ở các vi sinh vật khác như Brevibacterium sp hoặc với Corynebacterium sp bao gồm regiospecific và stereoselective thu được sản phẩm nhanh và tốt. Đây là chất trung gian trong quá trình ascorbate trong tổng hợp Reichstein. Hai quá trình oxi hóa và sự khử xảy ra đồng thời trong lên men. Đột biến trình tự Acetobacter và Corynebacterium làm biến đổi hơn 80% glucose từ 2-keto-L-glunonate, đây là giới hạn đạt được của vi sinh vật được giới thiệu trong kỹ thuật gene.
Công ty công nghệ sinh học Genentech Inc đã sử dụng công nghệ mới này. 2,5-diketo-D- gluconate được tinh chế từ Corynebacterium và từ những hiểu biết về trình tự amino acid đã đem lại nhiều lợi ích, chúng dò và thu gene từ enzyme này. Sau đó biến đổi gene
Erwinia herbicola nhằm biến đổi enzyme oxi hóa 2,5-diketo-D-gluconate. Vi sinh vật tái
tổ hợp có thể biến đổi trực tiếp 2-keto-L-gluconate thành glucose nhằm tạo sự đơn giản hóa cho quy trình Reichstein. Trong quy trình, glucose cung cấp ascorbate như vậy khung carbon định hướng bị so sánh đảo ngược nhằm định hướng sự hợp nhất trong tổng hợp Reichtein, một biểu hiện của xúc tác sinh học. Nồng độ cuối cùng thu được của 20 g/l-1
thu được sau 72h lên men dưới 50% sinh khối dựa vào lượng glucose tạo thành.
37
Tiềm năng xa hơn của công nghệ là điều khiển sinh tổng hợp của cephalosporin C. Hai enzyme cần chuyển 7-aminoadipyl của mạch chuyển hóa từ A.chrysogenum sau đó kỹ thuật tạo dòng sẽ tạo thành 7-ACA.
Hoạt động xúc tác cao của enzyme thường được bù đắp bởi cường độ thấp, ít phản ứng và nồng độ các chất phản ứng cao. Sự oxi hóa của D-glucitol thành L-sorbose là 1 ngoại lệ. hơn nữa D-glucitol là một sản phẩm quan trọng với sản lượng hàng năm khoảng 0.6 triệu tấn, 70m3 lên men được khử hydro liên tục của glucose và chlorine để oxy hóa sản phẩm phụ điacetone của L-sorbose được tạo thành bởi điện phân NaCl, cuối cùng sản phẩm phụ của 2-keto-L-gulonate dễ dàng được thu hồi. Ngược lại, sự tổng hợp trực tiếp của vi sinh vật đòi hỏi nồng độ đường thấp (khoảng 40g/l-1); 2-keto-L-gulonate không dễ thu hồi. Vấn đề phổ biến có ảnh hưởng tới sản xuất 7-ACA của dòng tái tổ hợp từ A. chrysogenum như điều kiện mới cho lên men và thu hồi quy trình nên được phát triển. Nó thường gặp khó khăn trong sự thay đổi quy trình mới, điều này tốt hơn trong nổ lực đơn giản hóa sự tổng hợp như một ví dụ cho một chiến lược mới đầy hứa hẹn. Một số sản phẩm mới được tạo thành từ những phương pháp không có sẵn. Điều này sớm thúc đẩy tiến bộ công nghệ, nó có thể hiểu rõ về xúc tác sinh học với quy mô lớn dùng enzyme và vi sinh vật tái tổ hợp.