công nghệ sản xuất xanthan gum

 Tình hình sử dụng một số loại polysaccharideCó rất nhiều loại polysaccharide được sinh tổng hợp bởi vi sinh vật nhưalginate, curlane, dextran, gellan, glucan, pullulan và xanthan.. Tro

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÔN: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT XANTHAN GUM

GVHD: NGUYỄN THỊ THU SANG

TP.HCM, Ngày 14 Tháng 05 Năm 2015

LỜI MỞ ĐẦU

Có rất nhiều loại polysaccharide được sinh tổng hợp bởi vi sinh vật như alginate,curlane, dextran, gellan, glucan, pullulan và xanthan Trong số những loại này thìxanthan gum có vai trò vượt trội hơn bởi nó có tính định hướng, ứng dụng nhiều.Trong công nghiệp polysaccharide thì xanthan gum là một trong những đại diện pháttriển nhanh nhất

Đối với ngành thực phẩm, những nhu cầu về gum tự nhiên đang có xu hướnggiảm xuống, trong khi đó xanthan lại có xu hướng tăng lên Đây là một điểm đến hứahẹn cho những nhà kĩ sư thực phẩm tương lai

Để hiểu biết thêm về loại phụ gia thực phẩm này, nhóm chúng em đã cố gắng tìmhiểu và thu thập tài tiệu Trong quá trình thực hiện bài tiểu luận còn rất nhiều thiếu sót,rất mong nhận được sự góp ý của cô và các bạn đọc

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ XANTHAN GUM

1 Định nghĩa

Xanthan gum là một polysaccharide được sử dụng như là một phụ gia thựcphẩm và chất điều chỉnh lưu biến Là sản phẩm lên men của glucose và saccharose bởi

vi khuẩn Xanthomonas campestris.

Xanthomonas campestris là loại vi khuẩn gây ra bệnh mục đen trên cải, hoa lơ

so với các loại gum tan trong nước được sản xuất bằng phương pháp tự nhiên

Đầu những năm 1960, xanthan trở thành sản phẩm thương mại bởi công tyKelco với tên thương mại là Kelzan (theo Whistler) nhưng không thích hợp chothương mại mãi đến năm 1964

Năm 1969, xanthan đã được tổ chức FDA (the American Food and DrugAdministration) cho phép sử dụng làm phụ gia thực phẩm sau những nghiên cứu vàthử nghiệm trên động vật Nó được phép sử dụng ở các nước: Hoa Kỳ, Canada, Châu

Âu (1982) Số kí hiệu là E415

Các công ty sản xuất xanthan nổi tiếng: Merck, Pfizer và Kelco của Mĩ, RhônePoulenc và Sanofi-Elf của Pháp, Jungbunzlauer của Úc

 Tình hình sử dụng một số loại polysaccharide

Có rất nhiều loại polysaccharide được sinh tổng hợp bởi vi sinh vật nhưalginate, curlane, dextran, gellan, glucan, pullulan và xanthan Trong số những loạinày thì xanthan có vai trò vượt trội hơn bởi dễ dàng sản xuất và được ứng dụng nhiều.Thực vậy, nó đang dần được sử dụng nhiều trong thực phẩm và trong việc tạo ra chấtđộn cho mỹ phẩm Trong công nghiệp polysaccharide thì xanthan là một trong nhữngđại diện phát triển nhanh nhất Đối với ngành thực phẩm, những nhu cầu về gum tựnhiên đang có xu hướng giảm xuống, trong khi đó xanthan lại có xu hướng tăng lên.Khoảng 20.000 tấn xanthan được sản xuất theo phương pháp công nghiệp từ giống vi

khuẩn X campestris mỗi năm Nhu cầu tiêu thụ xanthan trên toàn thế giới là khoảng

23 triệu kg/ năm và được dự đoán là sẽ tiếp tục tăng lên 5-10% theo hằng năm

3 Cấu tạo

1 Cấu tạo phân tử

Xanthan gum bao gồm những cụm 5 gốc đường được lặp lại, mỗi cụm gồm 2gốc đường D -glucose, 2 gốc đường D -mannose, 1 gốc đường D -glucoronate và cácgốc acetate, pyruvate với số lượng thay đổi

Mỗi cụm đơn vị của mạch chính trong chuỗi polysaccharide bao gồm các gốc ß-D -glucose, liên kết với nhau bằng liên kết ß-1, 4 glycoside Yếu tố này giống với cấutrúc của cellulose

Mạch nhánh gồm 1 gốc glucoronate nằm ở giữa liên kết với 2 gốc mannose Vịtrí thứ nhất của gốc D-glucoronate liên kết với vị trí thứ hai của 1 gốc D -mannose, còn

vị trí thứ tư của gốc D-glucoronate liên kết với vị trí thứ nhất của một gốc mannosekhác

Mạch nhánh liên kết với mạch chính tại vị trí thứ 3 trên gốc cellulose của mạchchính và vị trí thứ nhất trên gốc mannose của mạch nhánh

Khoảng một nửa số gốc mannose ở cuối có nhóm acid pyruvic liên kết do nhómketal tạo vòng tại vị trí 4 -6trên gốc mannose

Gốc mannose còn lại liên kết với một acetyl tại vị trí thứ 6

Xanthan gum cũng chứa các ion dương hóa trị một như là Na, K

Mạch nhánh và mạch thẳng xoắn chặt với nhau tạo thành hình dạng bền chặt

Hình Cấu trúc của một đơn vị của xanthan gum

2 Khối lượng phân tử

Khối lượng phân tử có thể từ 0.9 triệu đến 1.6 triêu Dalton , nó phụ thuộc vàonguồn vi sinh vật và điều kiện thực hiện quá trình lên men

Đôi khi khối lượng phân tử xanthan gum có thể lên đến 13 đến 50 triệu Dalton

Hình Cấu tạo của xanthan gum

3 Trạng thái phân tử

Xanthan là phân tử sinh học xoắn đôi nhưng không đối xứng nhau

Mạch nhánh và mạch thẳng đối xứng nhau tạo thành hình dạng bền chặt

Các phân tử có thể co lại hình xoắn ốc kép hình thành nên cấu trúc đặc quánh,khi gặp một số điều kiện sẽ bị duỗi mạch làm thay đổi tính chất

Mạch chính được mạch bên bảo vệ làm cho xanthan gum tương đối bền vớiacid, kiềm và enzyme

4 Thành phần cấu tạo

Acid pyruvic là một thành phần rất quan trọng do nó tác động đến khả năng hòatan trong nước của polymer Thành phần acid pyruvic trong xanthan khác nhau phụthuộc vào chủng Xanthomonas campestris (có những chủng sản xuất ra hàm lượngacid pyruvic rất cao, có những chủng lại sản xuất ra với hàm lượng rất thấp), điều kiệnlên men và điều kiện thu hồi sản phẩm

Bảng: thành phần % của D-glucose, D – mannose, D – glucuronic acid, pyruvate, acetate trong polysaccharide do một số chủng vi khuẩn khác nhau tạo

Vi khuẩn D-Glucose D-Mannose D-GlucuronicAcid Pyruvate Acetate

Xanthan gum có độ nhớt cao Dung dịch có nồng độ khoảng 1% có độ nhớt xấp

xỉ 1000 cP khi đo ở 60 v/ph với thiết bị đo độ nhớt Brookfield model LVF ở 25oC

Ảnh hưởng của muối: độ nhớt không bị ảnh hưởng khi thêm một lượng lớnmuối, như trong 250 g/l dung dịch NaCl chỉ làm tăng không đáng kể độ nhớt của dungdịch xanthan

2 Tính tương hợp

 Với alcohol

Tuy xanthan không hòa tan trực tiếp được trong alcohol nhưng lại có khả năngtương thích với nó Những sản phẩm có chứa xanthan trong công thức thành phầnthường chiếm đến 60% dung môi alcohol như ethanol Ta có thể sử dụng tính chất này

để làm cho cocktail, rượu có mùi chocolate trở nên đặc hơn

 Với các loại enzyme

Hầu hết các dung dịch keo đều bị thoái hóa ở một giới hạn nào đó bới cácenzyme có mặt trong thực phẩm như cellulase, pectinase, amylase, protease Tuynhiên, xanthan không bị thoái hóa bới chúng Khả năng kháng lại tác động của enzyme

là do sự xắp xếp các nhánh chính và nhánh phụ, sự xắp xếp này chống lại tác động củaenzyme lên liên kết 1,4 trong nhánh chính Nhờ đó mà ngăn cản được sự ngưng trùng

3 Gel thuận nghịch về nhiệt độ

Gel tạo thành khi làm nguội các hỗn hợp Xanthan gum ở trạng thái keo có thểthực hiện sự chuyển đổi cấu hình xoắn ốc đôi thành chuỗi đơn bằng cách tôi luyện ởnhiệt độ 40 - 80C Ở cấu hình chuỗi đơn, mạng lưới liên kết yếu đi, hình thành nêntrạng thái giả dẻo (pseudoplastic) làm giảm độ nhớt của dung dịch Xanthan gum cókhả năng kết hợp được với nhiều chất tạo gel, tạo sệt khác nhau như locust bean gum,konjac, guar gum

4 Khả năng hydrate hóa

Sự hiện diện của những chuỗi tích điện âm trong phân tử xanthan gum làm tăngkhả năng hydrate hóa và tạo nên dung dịch xanthan trong nước lạnh

Xanthan gum là một chất háo nước, tan được trong nước nóng và nước lạnh

Điều kiện lạnh đông/rã đông: nhờ khả năng liên kết với nước nên dung dịchxanthan gum rất bền khi lạnh đông cũng như rã đông

5 Nguyên liệu sản xuất

1 Giống vi sinh vật lên men

Xanthan được sản xuất từ vi khuẩn Xanthomonas campestris được cô lập từ cây cải

bắp, nó chính là loại vi khuẩn gây ra bệnh nấm làm cho cây có màu đen

Vi khuẩn Xanthomonas campestris:

- Có dạng hình que đơn, thẳng Rộng 0,4 - 0,7 m, dài 0,7 – 1,8 m

- Vi khuẩn Gram âm

- Có khả năng di động nhờ có tiên mao mọc ở cực

- Là loại vi khuẩn dị dưỡng, hiếu khí bắt buộc

- Không có khả năng khử nitơ, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính

- Phát triển trên môi trường dinh dưỡng agar, bị ức chế bởi 0,1%triphenyltetrazolium chloride

Theo như cơ sở của sự phân loại, kích cỡ gene trung bình của Xanthomonas là

2.5 × 109 Da Phần trăm G + C (guanine + cytosine) có chứa trong chuỗi AND là 63 71%

-Tính không ổn định thuộc về di truyền của vi khuẩn X campestris sẽ ảnh

hưởng đến chất lượng cũng như số lượng xanthan xuất hiện khi nuôi cấy nó Sự độtbiến gene có liên quan đến việc hình thành 2 dạng khác nhau: L (large) và S (small).Trong khi dạng L sản xuất ra một lượng lớn xanthan với những tính chất lưu biến họcmong muốn thì dạng S lại cho lượng sản phẩm ít và chất lượng thì kém

X.campestris là loại vi khuẩn sản xuất ra xanthan gum chủ yếu, tuy nhiên một

số loài khác như Xanthomonas phaseolis, Xanthomonas malvacearum, Xanthomonas carotae, Xanthomonas manihotis và Xanthomonas jugandlis cũng được biết đến là có

khả năng sản xuất ra polysaccharide ngoại bào tốt Nhưng do sự đa dạng về dinh

dưỡng của X campestris nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp

Tiêu chí chọn giống:

- Không có khả năng sinh độc tố

- Do cần thu nhận sản phẩm trao đổi chất ngoại bào của vi khuẩn nên phải chọngiống có khả năng sinh tổng hợp xanthan cao, số lượng lớn không quan tâm đếncác sản phẩm khác

- Giống được chọn phải có khả năng thích nghi và tốc độ sinh trưởng nhanh, lấn

át được vi sinh vật tạp nhiễm

- Môi trường nuôi cấy dễ kiếm, rẻ tiền

- Hoạt tính trao đổi chất của giống được chọn phải ổn định, lâu thoái hóa

2 Nguyên liệu khác

 Nguồn carbon

Trong tiến trình sản xuất công nghiệp, tinh bột và glucose được sử dụng ở mức

độ thương mại làm nguồn carbon Saccharose và dịch whey cũng được sử dụng Hàmlượng glucose lên khoảng 5% được coi là môi trường cho chất lượng sản phẩm tốt

nhất, nếu hàm lượng glucose cao hơn mức này thì chất lượng của xanthan lại giảm đi.Trên thực tế, hàm lượng glucose cao nhất bị giới hạn bởi tính chất lưu biến học củacanh trường lên men.

Ở châu Âu người ta dùng syrup bắp để làm nguồn nguyên liệu sản xuất xanthan.Syrup bắp còn được gọi là high fructose corn syrup (HFCS) do có hàm lượng fructoserất cao, được sử dụng phổ biến trong các loại kẹo và đồ uống Syrup bắp không phải làloại đường tự nhiên như đường mía hay đường củ cải Vì HFCS có được sau quá trình

xử lý công nghiệp phức tạp Người ta sử dụng 3 loại enzyme là - amylase, glucoseamylase thủy phân tinh bột bắp thành đường glucose và enzyme isomerase chuyển hóaglucose thành fructose, tăng độ ngọt và khả năng hòa tan Sau đó, glucose tinh khiếtđược thêm vào hỗn hợp tạo ra HFCS Giá trị tỉ lệ fructose : glucose trong HFCS là

90 : 10, 42 : 43 hoặc 55 : 45

 Nguồn nitơ

Đối với nguồn nitơ, ta có thể dùng nước ngâm hạt ngũ cốc, dịch thủy phâncasein,dịch chiết nấm men, dịch chiết từ đậu nành, tuy nhiên nguồn nitơ thường đượcdùng nhất là muối amoni Xanthan được sản xuất có chất lượng tốt nếu như X.campestris được nuôi dưỡng trong một môi trường tổng hợp đơn giản bao gồm NH4Cl,glucose và muối Nhóm khoa học Letisse đã đưa ra một mô hình lên men xanthan với:

- Nguồn cacbon là saccharose - Nguồn nitơ là NH4Cl hoặc NaNO3 - Tốc độ pháttriển tương ứng của tế bào là 0,13 h-1 và 0,07h-1 - Tốc độ hình thành xanthan tươngứng là 0,52 mmol/h.g tế bào và 0,79 mmol/h.g tế bào - Lượng acid hữu cơ bên trongxanthan (acetate và pyruvate) là 6% và 4,6% Điều này cho thấy rằng ion amoni là cơchất thích hợp cho việc tích lũy sinh khối còn nitrat thì thích hợp cho sản lượngxanthan tạo thành Nếu thiếu nguồn nitơ vô cơ, ta có thể thay thế bằng nguồn nitơ hữu

cơ như sản phẩm thuỷ phân đậu nành

 Các nguyên tố vi lượng

Bên cạnh nguồn carbon và nitơ, sự sinh tổng hợp xanthan đòi hỏi phải có mộtvài nguyên tố vi lượng như kali, sắt, muối calci… Lợi ích của việc sử dụng môi trườngtổng hợp tăng lên gấp đôi vì ta có thể điều khiển được tính không ổn định của genecũng như cải tiến được chất lượng của sản phẩm Mặc dù cấu trúc của sự tổng hợpxanthan về cơ bản độc lập với môi trường nuôi cấy, nhưng có một vài điểm khác biệt

về nhóm thế acyl, đặc tính lưu biến học và cả lượng của sản phẩm đạt được

CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT XANTHAN GUM

1. Sơ đồ quy trình công nghệ

Thanh trùng

Tách nước Kết tủa Tách vi sinh vật Thanh trùng Lên men

2. Giải thích quy trình

2.1. Nhân giống

• Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men

Quá trình nhân giống nhằm mục tiêu thu nhân được số tế bào cao hay nóicách khác sản phẩm của quá trình là sinh khối (thường tính là tổng số lượng

tế bào/ml) Nó còn có mục đích là chuẩn bị cho quá trình lên men được diễn

ra tốt hơn

• Biến đổi:

- Hóa sinh: trong quá trình nhân giống xảy ra rất nhiều phản ứng hóa sinh bêntrong và bên ngoài tế bào làm xuất hiện nhiều sản phẩm trao đổi chất, góp phầnlàm thành phần hóa học của môi trường này thay đổi liên tục theo thời gian sấy

- Hóa lý: trong quá trình nhân giống xảy ra những biến đổi về pha Việc nhângiống được thực hiện trong điều kiện hiếu khí nên việc sục không khí vào canhtrường sẽ làm tăng nồng độ oxi hòa tan trong pha lỏng

- Vật lý: trong quá trình sinh trưởng, một phần năng lượng sẽ tỏa ra ngoài dướidạng nhiệt năng Hiện tượng này có thể làm tăng nhiệt độ canh trường khi nhângiống vi sinh vật ở uy mô lớn Do đó cần chú ý hiệu chỉnh nhiệt độ của canhtrường trong suốt quá trình nhân giống

- Sinh học: các tế bào vi sinh vật sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất và sản sinh

ra nhiều thế hệ tế bào mới

• Thiết bị: Trong sản xuất, tùy thuộc vào thể tích làm việc của thiết bị lên men

mà lượng giống vi sinh vật cần cấy sẽ thay đổi ít nhiều Do đó, số cấp nhângiống cũng sẽ thay đổi để các nhà sản xuất thu được đúng lượng giống cần

sử dụng Nếu thể tích bình lên men càng lớn thì lượng giống cấy càng lớn.Nhân giống được chia làm hai gia đoạn:

- Nhân giống ở phòng thí nghiệm: sử dụng các ống nghiệm (cấp 1), bình tam giácerlen (cấp 2 và 3), bình nuôi cấy (cấp 4)

- Nhân giống ở phân xưởng: sử dụng các bình lên men cho môi trường lỏng Bìnhlên men dùng để nuôi cấy giống VSV có cấu tạo tương tự như những bình lênmen dùng để nuôi cấy VSV đễ thu nhận các sản phẩm trao đổi chất Thiết bị códạng hình trụ đứng, bên trong có cánh khuấy và bộ phân sục khí Nhiệt độ môitrường trong quá trình nhân giống có thể hiệu chỉnh được nhờ lớp vỏ áo xungquanh thân trụ thiết bị Ngoài ra thiết bị còn có các cảm ứng nhiệt độ, pH, oxi,

…để giúp cho các nhà sản xuất dễ dàng theo dõi và điều khiển quá trình nhângiống theo phương pháp tự động nhờ sự hỗ trợ của các phần mền

Hình 2.1 Thiết bị nhân giống

• Thông số công nghệ:

- Nhiệt độ: tối ưu là 28 – 30 oC

- pH trung tính là tối ưu

• Môi trường nhân giống: dịch men trong ống thạch nghiêng chứa:

+ 10g/l glucose

+ 5g/l peptone

+ 3g/l dịch chiết nấm men

+ 20 g/l agar

+ Bảo quản ở điều kiện 4oC

Cấy chuyền 2 tuần 1 lần để đảm bảo tính ổn định cho sản phẩm xanthan gum.2.2. Chuẩn bị môi trường lên men

• Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men

• Dưới đây là môi trường dinh dưỡng trong lên men tĩnh:

+ ZnO: 0,006 g/l+ Dịch chiết nấm men: 0,75 g/l+ Peptone: 0,34 g/l

+ Chất chống bọt: 0.06 g/l+ HCl: 0,16 g/l

+ pH ban đầu: 7,0 0,1Lên men tĩnh được thực hiện trong bình erlen 500ml có chứa 100ml môi trường lên men được cấy chuyền từ môi trường 10% (v/v) trước nuôi cấy 24h

Sau đó canh trường được ủ ở 30oC trong thiết bị khuấy với tốc độ 200 v/ph trong 96h.Mẫu sẽ được lấy ra thường xuyên để kiểm tra sinh khối, nồng độ xanthan và đườngsót

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy bao gồm nhiều giai đoạn với những yêu cầu khác nhau.Canh trường nhân giống ban đầu là 10L, sau đó nâng lên 100m3 để đưa vào sản xuất Ở

2 cấp nhân giống liên tiếp, thể tích của môi trường sẽ được nâng lên 10 lần

2.3. Thanh trùng môi trường len men

• Mục đích: Chuẩn bị, đảm bảo về mặt vi sinh của môi trường trước khi đem đi lên men

• Biến đổi: Chủ yếu là biến đổi sinh học: ức chế, tiêu diệt các vi sinh vật nhiễm

• Thiết bị: sử dụng thiết bị thanh trùng bản mỏng

Bộ phận chính của thiết bị là những tấm bảng hình chữ nhật rất mỏng, làm bằng thépkhông rỉ Mỗi tấm bảng có 4 lỗ tại 4 góc và hệ thống các đường rãnh trên khắp bề mặt

để tạo sự chảy rối và tăng diện tích truyền nhiệt

Khi ghép các tấm bảng mỏng lại với nhau trên một khung của thiết bị sẽ hình thànhnên những hệ thống đường vào và ra cho chất lỏng cần thanh trùng và chất tải nhiệt

• Hóa lý: Độ nhớt tăng lên do polysaccharide tạo ra ngày càng nhiều

• Hóa sinh: vi khuẩn Xanthomonas campestris sử dụng cơ chất để sinh tổng hợp ra

xanthan gum, là một loại polysaccharide ngoại bào Quá trình sinh tổng hợp xanthangum diễn ra như sau:

Tương tự như thực vật bậc cao, vi sinh vật cũng có khả năng tổng hợp ra cácoligosaccharide và polysaccharide Lượng oligosaccharide và polysaccharide nội bàochiếm đến 60% khối lượng khô của tế bào, còn polysaccharide ngoại bào thì vượtnhiều lần khối lượng của tế bào

Tất cả các oligosaccharide và polysaccharide đều được tổng hợp bằng cách kéodài chuỗi saccharide có trước nhờ việc thêm đơn vị monosaccharide Đơn vị này sẽtham gia phản ứng ở dạng nucleotide - monosaccharide đã được hoạt hoá, thường làdẫn xuất của uridin - diphosphate nhưng đôi khi cùng với nucleotide purin và pirimidinkhác

Bước đầu tiên của quá trình sinh tổng hợp xanthan là sự hấp thụ carbonhydrate.Tiếp theo sau đó là quá trình phosphoryl cơ chất bằng enzyme hexokinase để có thể sửdụng adenosine 5’- triphosphat Sự sinh tổng hợp có liên quan đến sự chuyển đổi của

cơ chất được phosphoryl hoá thành các loại nucleotide đường khác nhau mà đòi hỏicần phải có sự tham gia của enzyme UDP- Glc pyrophosphorylase để kéo dài chuỗipolysaccharide Trong X campestris, chu trình Entner–Doudoroff cùng với chu trìnhtricarboxylic acid là 2 cơ chế chủ yếu cho sự dị hóa đường glucose Ngoài ra, mộtlượng nhỏ đường glucose đi theo con đường pentose phosphate Cuối cùng, hai hệthống riêng biêt trên lại gặp nhau, chuẩn bị cho sự hấp thu glucose Sự sinh tổng hợpxanthan, giống như hầu hết các loại vi khuẩn sản sinh ra polysaccharide, sử dụng nhiềunguồn carbonhydrate hoạt hóa khác nhau để tổng hợp nên polymer

Hình 3.2: Con đường Entner–Doudoroff

Hình 3.3: Chu trình tricarboxylic

Xanthan được tổng hơp bằng cách thêm lần lượt monossacharide vào chuỗioligosacharide từ đường nucleotide diphosphate cho đến khi tạo thành phân tử chấtcho isoprenoid lipid Mạch chính của xanthan được hình thành từ sự thêm vào của D –