Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ HƯƠNG GIANG Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu nitơ vào thuốc Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)” THÁI NGUYÊN 2014 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Công nghệ sinh học tạo trồng chuyển gen sinh trưởng nhanh 1.1.1 Vai trò nitơ thực vật .6 1.1.2 Cây chuyển gen tăng cường đồng hóa nitơ, sinh trưởng nhanh 1.2 Giới thiệu gen tăng cường sử dụng hiệu nitơ (GS1) .9 1.3 Giới thiệu chung thuốc Bạch đàn Urô 11 1.3.1 Cây thuốc mô hình cho nghiên cứu chuyển gen 11 1.3.2 Giới thiệu bạch đàn urô 12 Chương 13 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị sử dụng .13 2.1.1 Vật liệu 13 2.1.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 14 2.2 Địa điểm thời gian 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu chuyển gen vào thuốc .18 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu tạo dòng Bạch đàn urô 21 Chương 30 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Tạo dòng thuốc chuyển gen GS1 đánh giá sinh trưởng phạm vi phòng thí nghiệm 30 3.1.1 Kết chuyển cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc K326 30 3.1.2 Kiểm tra dòng thuốc chuyển gen GS1 PCR .34 3.1.3 Phân tích, đánh giá sinh trưởng dòng thuốc chuyển gen 35 3.2 Kết tạo dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 37 3.2.1 Kết chuyển cấu trúc gen GS1 vào Bạch đàn urô 37 Bảng 3.3 Kết chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô 43 3.2.2 Kiểm tra dòng Bạch đàn urô chuyển gen phương pháp PCR 46 Bảng 3.4 Hàm lượng độ mẫu DNA tổng số 48 3.2.3 Kiểm tra dòng Bạch đàn chuyển gen kỹ thuật lai southern 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Bùi Văn Thắng- Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt thời gian thực hoàn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Chu Hoàng Hà- Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho hoàn thành tốt trình học tập, thực nghiên cứu đề tài hoàn chỉnh luận văn Tôi muốn bày tỏ biết ơn tới TS Phạm Bích Ngọc- Phó Trưởng phòng Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi, ủng hộ giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Phương Thảo CN Nguyễn Văn Đoài- Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cộng tác giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình toàn thể cán Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học suốt trình làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán thuộc sở đào tạo Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, giảng dạy tạo điều kiện cho hoàn thành khóa học Cuối biết ơn người thân gia đình bên động viên, quan tâm tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 26 tháng 12 năm 2015 Học viên Trần Thị Hương Giang MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AS Acetosyringone ADP Adenosine diphosphat ATP Adenosine triphosphat BAP Benzyl Amino Purine Cs Cộng CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations IBA Indol-3-Butyric Acid Knop Môi trường Sachs & Knop (1860) Kb kilo base kDa kilo Dalton LB Môi trường nuôi cấy Luria and Betani MS Môi trường Murashige Skoog (1962) NAA Naphthyl Acetic Acid OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction Bp Bazo pair RNA Ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulfate DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 15 Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy thuốc 15 Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy Bạch đàn 16 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra chuyển gen 20 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 20 Bảng 3.1 Tỷ lệ tái sinh/ sống sót mẫu biến nạp qua giai đoạn (%)33 Bảng 3.2 Bảng so sánh chiều cao đối chứng chuyển gen GS1 36 Bảng 3.3 Kết chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô 43 Bảng 3.4 Hàm lượng độ mẫu DNA tổng số 48 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Kết trồng khảo nghiệm dòng Dương lai chuyển gen gs1 Hình 2.1 Sơ đồ vector chuyển gen pBI121:GS1 14 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 17 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chuyển gen GS1 vào thuốc K326 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 31 Hình 3.2 Chủng vi khuẩn A tumefaciens 32 Hình 3.3 Biến nạp đồng nuôi cấy 32 Hình 3.4 Mảnh môi trường chọn lọc sau tuần 34 Hình 3.5 Cây thuốc chuyển gen GS1 môi trường chọn lọc CL-TL50 34 Hình 3.6 Sản phẩm PCR nhân gen GS1 35 Hình 3.7 Cây thuốc K326 trồng giá thể 36 Hình 3.8 Cây thuốc K326, tháng tuổi 37 Hình 3.9 Tạo nguồn vật liệu chuyển gen 38 Hình 3.10 Thân mầm mầm môi trường tiền nuôi cấy 39 Hình 3.11 Thân mầm mầm môi trường đồng nuôi cấy 41 Hình 3.12 Mẫu bạch đàn môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn42 Hình 3.13 Quá trình sàng lọc thể nhận gen đoạn thân mầm 43 Hình 3.14 Quá trình sàng lọc thể nhận gen mảnh mầm 44 Hình 3.15 Chồi tái sinh môi trường chọn lọc từ mẫu thân mầm mầm sau tuần nuôi cấy 45 Hình 3.16 Chồi Bạch đàn urô sau tuần nuôi cấy môi trường rễ 45 Hình 3.17 Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng chậu đất tuần tuổi 46 Hình 3.18 Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng chậu đất tháng tuổi 46 Hình 3.19a DNA tổng số tách chiết từ mẫu Bạch đàn urô chuyển gen GS1, điện di gel agarose 0,8% 47 Hình 3.19b DNA tổng số tách chiết từ mẫu Bạch đàn urô chuyển gen GS1, điện di gel agarose 0,8% 47 Hình 3.20 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ dòng Bạch đàn urô chuyển gen 50 Hình 3.21 Sản phẩm PCR nhân gen nptII từ dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen 51 Hình 3.22 Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter từ dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen 52 Hình 3.23 Sản phẩm PCR nhân đoạn NOS-T từ dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen 54 Hình 3.24 Kết Southern blot mẫu bạch đàn chuyển gen GS1 nptII 55 MỞ ĐẦU Nitơ nguyên tố cần thiết đóng vai trò quan trọng cho trình sinh trưởng phát triển thực vật, nhân tố cấu trúc nên phân tử axít nucleic protein tế bào Trong cây, nitơ đồng hóa tái sử dụng thông qua chế đồng hoá nitơ từ môi trường nitơ giải phóng từ trình quang hô hấp trình trao đổi chất khác trình sinh tổng hợp phenyl propanoid huy động nitơ vài protein Glutamine synthetase (GS, EC 6.3.1.2) xúc tác cho phản ứng chuyển hóa axít glutamic thành glutamine phụ thuộc vào ATP, dùng amoniac chất (Miflin Lea, 1980) có tác dụng làm biến đổi tất nitrogen dạng vô tích hợp vào hợp chất hữu như: protein axít nucleic, chất diệp lục, cytochrome, phytochrome.v.v (Stephanie cs, 2009) Có hai dạng glutamine synthetase tế bào chất (GS1), tìm thấy tế bào chất tổ chức không quang hợp glutamine synthetase lục lạp (GS2) có lục lạp mô tham gia vào trình quang hợp plastid rễ Trong đó, GS1 có vai trò đặc biệt quan trọng việc đồng hóa tái sử dụng nitơ (Dubois cs, 1996; Cren Hirel, 1999; Stephanie cs, 2009) GS1 octamer protein/enzyme bao gồm tiểu đơn vị nhỏ hơn, có khối lượng phân tử khoảng 38 - 41kDa phụ thuộc vào loài khác Trong số loài, thuốc lá, cà chua, thông,v.v GS1 cấu tạo từ dạng tiểu đơn vị có kích thước giống nhau, đối tượng khác, ví dụ đậu nành phân tử GS1 cấu tạo hai tiểu đơn vị có kích thước khác (Becker cs, 1992; Canton cs, 1999; Dubois cs, 1996) Thêm vào đó, thí nghiệm phân tích điện di hai chiều xác định đậu Pháp, phân tử GS1 tạo thành từ hai chuỗi polypeptid khác Tuy nhiên, điều đáng ý khác liên quan đến hoạt động enzyme chức sinh lý chúng Những khảo sát xa mối quan hệ cấu trúc chức polypeptid GS1, nghiên cứu sử dụng đột biến gen ống nghiệm tiến hành xác nhận vai trò quan trọng axít amin chìa khoá tính chất xúc tác enzyme (Clemente Marquez, 1999) Tăng cường hoạt động GS1 giúp sử dụng hiệu nguồn nitơ vốn nhu cầu thiết yếu cho sinh trưởng Nhiều kết nghiên cứu cho thấy, gen GS1 hoạt động mạnh trồng điều kiện đầy đủ nghèo nguồn nitơ có khả sinh trưởng nhanh (Stephanie cs, 2009) Một kết nghiên cứu chuyển gen GS1 vào lâm nghiệp tiêu biểu là: Gallardo cs (1999) nghiên cứu chuyển cấu trúc gen GS1 điều khiển promoter 35S vào Dương lai (Populus tremula x P.alba 7171), kết cho thấy chuyển gen sinh trưởng nhanh so với đối chứng 76% (cây tháng tuổi) 21,3% (cây tháng tuổi) Các dòng Dương lai chuyển gen GS1 trồng khảo nghiệm từ năm 2000 tỉnh Granada Tây Ban Nha, kết dòng chuyển gen GS1 có mức độ biểu enzyme glutamine synthetase cao có tốc độ sinh trưởng nhanh so với giống gốc không chuyển gen (chiều cao chuyển gen tăng so với không chuyển gen 21% trồng năm tuổi, 36% trồng năm tuổi 41% trồng năm tuổi) (Zhong cs, 2004) Bạch đàn urô (Eucayltus urophylla) loài Bạch đàn trồng chủ yếu Việt Nam Đây loài chủ lực dự án trồng triệu hecta rừng triển khai nước giai đoạn 1998 2010 Các nghiên cứu tỷ trọng gỗ, hàm lượng xenlulozo, chiều dài sợi gỗ, v.v thực hiện, kết thu cho thấy tính trạng sinh trưởng chất lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất bột giấy cho ngành công nghiệp giấy Các đánh giá sinh trưởng Bạch đàn urô Việt Nam cho thấy tỷ lệ sinh trưởng Bạch đàn urô Việt Nam chậm so với nước khác Trung Quốc, Brazil (Nguyễn Đức Kiên, 2009) Vì vậy, chương trình chọn giống bạch đàn Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng khả sinh trưởng, cải thiện chất lượng gỗ tăng sức chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi Thuốc loại mô hình sử dụng hiệu cho chuyển gen, kiểm tra biểu gen ngoại lai phục vụ cho mục đích chuyển gen vào mục tiêu Trong khuôn khổ đề tài tiến hành thí nghiệm chuyển gen GS1 vào thuốc để đánh giá hoạt động gen chuyển, tạo sở cho việc chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô có khả sử dụng hiệu nguồn nitơ để sinh trưởng nhanh phục vụ cho công tác cải thiện giống trồng Xuất phát từ sở khoa học nhu cầu ứng dụng vào thực tiễn, thực đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu nitơ vào thuốc Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)” Mục đích nghiên cứu Tạo dòng thuốc K326 dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu nitơ Nhiệm vụ nghiên cứu 2.1 Chuyển cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc K326 phân tích, đánh giá sinh trưởng phạm vi phòng thí nghiệm Biến nạp cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc K326; Kiểm tra có mặt gen GS1 dòng thuốc chuyển gen phương pháp PCR Đánh giá hình thái, sinh trưởng dòng thuốc chuyển gen GS1 tăng cường khả tổng hợp nitơ so với thuốc đối chứng không chuyển gen (WT) 2.2 Tạo dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 Biến nạp cấu trúc gen GS1vào Bạch đàn Urô Kiểm tra có mặt gen GS1 dòng Bạch đàn urô chuyển gen phương pháp PCR phương pháp southern blot Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector chuyển gen pBI121-35S/GS1 có kích thước khoảng 13kb chứa gen GS1 điều khiển promoter 35S gen nptII điều khiển NOS-promoter Phòng Công nghệ tế bào thực vật -Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cung cấp đoạn DNA nhỏ đứt gãy Tuy nhiên, chất lượng DNA thu đảm bảo đủ tiêu chuẩn để thực phản ứng PCR nhân gen Bảng 3.4 Hàm lượng độ mẫu DNA tổng số Stt Tên mẫu Hàm Tỷ lệ lượng OD260nm/ (ng/µl) OD280nm Stt Tên mẫu Hàm Tỷ lệ lượng OD260nm/ (ng/µl) OD280nm wt 524 1,86 22 E-X21 456 1,90 E-X1 427 1,82 23 E-X22 578 1,86 E-X2 623 1,90 24 E-X23 409 1,89 E-X3 615 1,91 25 E-X24 520 1,88 E-X4 619 1,94 26 E-X25 630 1,90 E-X5 578 1,86 27 E-X26 617 1,88 E-X6 592 1,89 28 E-X27 578 1,82 E-X7 713 1,85 29 E-X28 546 1,81 E-X8 675 1,82 30 E-X29 705 1,94 10 E-X9 498 1,80 31 E-X30 528 1,95 11 E-X10 597 1,96 32 E-X31 552 1,88 12 E-X11 598 1,82 33 E-X32 559 1,82 13 E-X12 646 1,90 34 E-X33 560 1,88 14 E-X13 466 1,87 35 E-X34 565 1,85 15 E-X14 497 1,98 36 E-X35 610 1,99 16 E-X15 520 1,92 37 E-X36 399 1,92 17 E-X16 488 1,87 38 E-X37 409 1,93 18 E-X17 625 1,85 39 E-X38 456 1,90 19 E-X18 467 1,90 40 E-X39 567 1,85 20 E-X19 510 1,90 41 E-X40 654 1,85 21 E-X20 592 1,89 Tiếp theo mẫu DNA tách chiết xác định nồng độ độ tinh máy Nanodrop2000: OD260nm OD280nm; tỷ lệ OD260nm/OD280nm có giá trị 1,8 – 2,0; mẫu DNA xem sạch, tỷ số nhỏ 1,8 lớn 48 2,0 cho biết DNA tách chiết bị nhiễm tạp protein Kết đo mẫu DNA tách chiết trình bày cụ thể bảng 3.4 Kết bảng 3.4 cho thấy 42 mẫu DNA tổng số tách chiết từ bạch đàn có hàm lượng cao, giao động từ 399 đến 713 ng/µl Tỷ lệ OD260nm/OD280nm 16 mẫu DNA tổng số nằm khoảng 1,8 – 2,0, điều cho thấy mẫu DNA protein đảm bảo chất lượng để thực phản ứng PCR nhân gen với mồi đặc hiệu Các mẫu DNA tổng số, sau đo hàm lượng DNA, tiến hành pha loãng mẫu nồng độ 100 ng/µl nước đề ion bảo quản mẫu tủ - 20oC 3.2.2.2 PCR nhân đoạn gen GS1 dòng bạch đàn urô chuyển gen Các mẫu DNA tổng số tách chiết từ dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen (ký hiệu: E-X1 – E-X41) đối chứng không chuyển gen (ký hiệu: wt) sử dụng làm khuôn DNA phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen gs1 có kích thước 408 bp (GS1-tF:5’- G A T G A A G A G A C A T G G T A C G G G-3’ GS1-tR: 5’-G G A C T T G G T G C T G T A A T T T G T G -3’) Thành phần chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR mô tả phần phương pháp 49 Hình 3.20 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ dòng Bạch đàn urô chuyển gen Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100bp; (+) đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1); wt – không chuyển gen; đường chạy từ 1-36 tương ứng với mẫu E-X1 đến E-X36 Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5%; kết thu cho thấy rằng: Trong 41 dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen phân tích có dòng (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) xuất băng DNA có kích thước khoảng 408bp bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, rõ nét, với mẫu đối chứng dương (+) Các dòng lại mẫu wt đối chứng âm (cây không chuyển gen) xuất băng DNA Kết này, bước đầu cho thấy dòng Bạch đàn urô phân tích dòng chuyển gen GS1 3.2.2.3 PCR nhân gen nptII dòng Bạch đàn urô chuyển gen DNA tổng số dòng Bạch đàn urô chuyển gen dương tính với đoạn gen GS1 dòng wt sử dụng làm khuôn để phân tích có mặt gen chọn lọc (gen nptII) dòng Bạch đàn urô chuyển gen kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen nptII có kích thước 700 bp (NPTII-F: 5’-G A G G C T A T T C G G C T A T G A C T G-3’; NPTII-R: 5’-A T C G G G A G C G G C G A T A C C G T A-3’) tham khảo Tadeusz Wroblewski cộng (2007) Thành phần chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR mô tả phần phương pháp 50 Hình 3.21 Sản phẩm PCR nhân gen nptII từ dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100bp; (+) đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1); wt – không chuyển gen; đường chạy từ 1-7 tương ứng với mẫu E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32 Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1%; kết thu hình 6.3 Kết cho thấy dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen có ký hiệu (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) xuất băng DNA có kích thước khoảng 700bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, rõ nét, với mẫu đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1), mẫu wt đối chứng âm (cây không chuyển gen) xuất băng DNA Kết lần khẳng định dòng Bạch đàn urô (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, EX25, E-X29, E-X32) phân tích dòng chuyển gen 51 3.2.2.4 PCR nhân đoạn trình tự khởi động – 35S Promoter Ngoài việc kiểm tra gen mục tiêu (gen GS1), gen chọn lọc (gen nptII), để khẳng định dòng Bạch đàn urô (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, EX29, E-X32) dòng chuyển gen Trong nghiên cứu này, sử dụng cặp mồi đặc hiệu p35S-cf3: 5’- C C A C G T C T T C A A A G C A A G T G G3’ p35S-cr4: 5’- T C C T C T C C A A A T G A A A T G A A C T T C C -3’ để nhân đoạn khởi động 35S-Promoter có kích thước khoảng 123 bp Tương tự trên, mẫu DNA tổng số tách chiết từ dòng Bạch đàn urô chuyển gen (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) đối chứng không chuyển gen (wt) sử dụng làm khuôn DNA phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (p35S-cf3 p35S-cr4) Thành phần chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR mô tả phần phương pháp Sản phẩm PCR điện di gel agarose 2%; kết thu hình 6.4 Kết cho thấy mẫu DNA tách chiết từ dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen xuất băng DNA có kích thước khoảng 123 bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, đậm, rõ nét với mẫu đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1) Trong đó, mẫu wt (cây không chuyển gen) xuất băng DNA Đoạn trình tự phân lập từ loại virút khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus), thực vật Vì vậy, dòng Bạch đàn urô PCR xuất băng DNA 35S Promoter, xem dòng chuyển gen ngoại lai M wt + M wt 123bp Hình 3.22 Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter từ dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100bp; (+) đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1); wt – không chuyển gen; đường chạy từ 17 tương ứng với mẫu E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32 52 3.2.2.5 PCR nhân đoạn trình tự kết thúc – NOS–Terminator Ngoài đoạn trình tự 35S Promoter, cassette chuyển gen (RB NOS-P/NPTII/NOS-T-35S-P/GS1/NOS-T - LB) vào Bạch đàn urô có đoạn DNA điều hòa kết thúc phiên mã NOS-Termanator (NOS-T) Do đó, nghiên cứu với việc kiểm tra có mặt đoạn trình tự 35S Promoter, tiến hành kiểm tra có mặt đoạn NOS-T dòng Bạch đàn urô chuyển gen NOS – Termanator phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dòng Bạch đàn urô xuất có mặt đoạn trình tự NOS – Termanator xem chuyển gen ngoại lại (vì thực vật đoạn trình tự này) Sử dụng cặp mồi đặc hiệu HA-nos-f: 5’-G C A T G A C G T T A T T T A T G A G A T G G G-3’ HA-nos-r: 5’-G A C A C C G C G C G C G A T A A T T T A T C C-3’ để nhân đoạn trình tự kết thúc NOS-T có kích thước khoảng 118 bp mẫu DNA tổng số tách chiết từ dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) đối chứng không chuyển gen (wt) sử dụng làm khuôn DNA phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (HA-nos-f HA-nos-r) Thành phần chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR mô tả phần phương pháp 53 Hình 3.23 Sản phẩm PCR nhân đoạn NOS-T từ dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 1Kb; (+) đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GA20); wt – không chuyển gen; đường chạy từ 1-7 tương ứng với mẫu E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32 Kết cho thấy mẫu DNA dòng Bạch đàn urô chuyển gen (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) xuất băng DNA có kích thước khoảng 118 bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, đậm, rõ nét với mẫu đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1) Ngược lại, mẫu wt (cây không chuyển gen) xuất băng DNA Một lần khẳng định dòng Bạch đàn urô chuyển cấu trúc gen ngoại lai (RB - NOS-P/NPTII/NOS-T-35S-P/GS1/NOS-T - LB) 3.2.3 Kiểm tra dòng Bạch đàn chuyển gen kỹ thuật lai southern Bảy dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 kiểm tra dương tích với phản ứng PCR tiếp tục phân tích kỹ thuật lai southern để kiểm tra có mặt gen genome số gen chuyển Do bạch đàn có họ gen GS1 nên phản ứng lai southern kiểm tra có mặt gen nptII mẫu dò Nếu dòng kiểm tra lai southern dương tính với gen nptII đồng nghĩa với dương tính với gen GS1 (2 gen chuyển đồng thời cấu trúc chuyển gen) Kết lai southern thu hình 3.25 cho thấy dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 gen nptII (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) phân tích có dòng (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X29) dương tính chứa copy gen chuyển genome Bạch đàn urô chuyển gen; dòng E-X25 E-X32 âm tính M P WT 54 Hình 3.24 Kết Southern blot mẫu bạch đàn chuyển gen GS1 nptII M: Marker 1kb, P: sản phẩm PCR gen nptII; wt: dòng bạch đàn urô không chuyển gen; giếng 1-7: dòng bạch đàn urô chuyển gen tương ứng E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Đã tạo 25 dòng thuốc chuyển gen GS1 dương tính với phản ứng PCR Đã thu 50 chồi rễ môi trường chọn lọc 75 mg/l kanamycin Đã thu dòng PCR dương tính với gen GS1, gen nptII, đoạn trình tự 35S-Promoter, đoạn trình tự NOST dương tính với phân tích lai Southern Các dòng dương tính mang gen chuyển genome Kiến nghị: Đánh giá mức độ biểu gen chuyển kỹ thuật RT-PCR lai Nothern Western Đánh giá mức độ ổn định gen chuyển qua hệ nhân giống dinh dưỡng Phân tích đánh giá tốc độ sinh trưởng đặc điểm lâm học dòng Bạch đàn urô chuyển gen nhà kính 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đặng Trọng Lương, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (2001a), "Nghiên cứu chuyển gen cryIA(c) kháng sâu vào số giống cải bắp (Brassica oleraceavar capitana) qua Agrobacterium", Kết nghiên cứu khoa học 1999-2000, Viện Di truyền Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà nội, tr 120-128 Dương Mộng Hùng (1993), Chọn trội nhân giống nuôi cấy mô tế bào cho hai loài bạch đàn E camadulensis E urophylla, Báo cáo đề tài, trường Đại Học Lâm nghiệp, Hà Tây Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Đức Kiên, Trần Hồ Quang, Gunnar Jansson, Chris Harwood, David Clapham, Sara von Arnold (2009), "Cellulose content as a selection trait in breeding for kraft pulp yield in Eucalyptus urophylla", Ann For Sci (66), tr 711-719 Nguyễn Hoàng Nghĩa (2000), Chọn giống bạch đàn Eucalyptus theo sinh trưởng kháng bệnh Việt Nam NXB Nông nghiệp Nguyễn Hoàng Nghĩa, Lê Đình Khá, Hoàng Chương (1993), Kết khảo nghiệm loài xuất xứ bạch đàn giai đoạn 1990-1992, Báo cáo khoa học, Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam 56 Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển (1999), Tạo thuốc (Nicotiana tabacum L.) kháng thuốc trừ cỏ basta chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà nội, tr 1297-1304 Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển (1999), Tạo thuốc (Nicotiana tabacum L.) kháng thuốc trừ cỏ basta chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà nội, tr 1297-1304 Nguyễn Luyện, "Tìm hiểu bạch đàn E urophylla", Tạp chí lâm nghiệp (số 10, tháng 10/1991) 10 Nguyễn Quang Thạch, (1995), Công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội 11 Nguyễn Quang Thạch, (2000), Giáo trình sinh lý thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 12 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 13 Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2003), "Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro Hông (Paulownia forturey) ảnh hưởng tác nhân chọn lọc để tạo chuyển gen", Báo cáo Khoa học hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2003, tr 866-869 14 Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2003), "Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro Hông (Paulownia forturey) ảnh hưởng tác nhân chọn lọc để tạo chuyển gen", Báo cáo Khoa học hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2003, tr 866-869 15 Phạm Thị Vân (2009), Nghiên cứu tạo thuốc kháng bệnh khảm kỹ thuật RNAi Luận văn Thạc sỹ sinh học 16 Phan Tố Phượng, Phạm Thu Hằng, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý, Lili C., Zhang S., Fauquet C M., Beachy R N (1998) Chuyển gen kháng 57 hygromycin, gen gus gen kháng bệnh bạc vào lúa súng bắn gen Tạp chí Nông nghiệp Công nghiệp thực phẩm, (2), tr 56-57 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17 Ahlandsberg S, Sathish P, Sun C, and Jansson C (1999) Green fluorescent protein as a reporter system in the transformation of barley cultivars Physiol Plant 107: 194–200 18 Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977) Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes Proc Natl Acad Sci 74: 5350–5354 19 Becker TW, Caboche M, Carrayol E and Hirel B (1992) Nucleotide sequence of a tobacco cDNA encoding plastidic glutamine synthetase and lightinducibility, organ specificity and diurnalrhythmicity in the expression of the corresponding genes of tobacco and tomato Plant Mol Biol 19: 367-379 20 Biesiadka J, Legocki AB (1997) Evolution of the glutamine synthetase gene in plants Plant Science 128: 51–58 21 BRECHLIN P., MÄCK G., BURBA M und TISCHNER R (1999) Changes in the isoform pattern and subunit composition of GS-1 in sugar beet leaves depent on leaf age Plant Physiol 155: 497-502 22 Brugiere N, Dubois F, Masclaux C, Sangwan R, Hirel B (2000) Immunolocalization of glutamine synthetase in senescing tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaves suggest that ammonia assimilation is progressively shifted to the mesophyll cytosol Planta 211:519–527 23 Cantón FR, Suarez MF, Jose-Estanyol M and Cánovas F (1999) Expression analysis of a cytosolic glutamine synthetase genein cotyledons of scots pine seedlings: Developmental regulationand spatial distribution of specific transcripts Plant Mol Biol 40: 623-634 24 Clemente MT and Marquez AJ (1999) Site-directed mutagenesis of Glu- 297 from the [alpha] – polypeptide of Phaseolus vulgaris glutamine synthetase alters kinetic and structural propertiesand confers risistance to L-methionine sulfoximine Plant Mol Biol 40: 835-845 58 25 Cren M and Hirel B (1999) Glutamine synthetase in higher phants: Regulation of gene and protein expression from theorgan to the cell Plant Cell Physiol 40: 1187-1193 26 DeBlock M, De Brower D, and Tenning P (1989) Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants Plant Physiol 91: 694–701 27 Dubois F, Brugière N, Sangwan RS and Hirel B (1996) Localisation of tobacco cytosolic glutamine synthetase enzymes and the corresponding transcripts show organ-and cell-specific patterns of protein synthesis and gene expression Plant Mol Biol 31: 803-817 28 FAO (2004) Priliminary review of biotechnology in forestry including genetic modification 29 Fraley RT, Rogers SG, Horsch RB (1983) Expression of bacterial genes in plant cells Proc Natl Acad Sci USA 80: 4803–4807 30 Fuentes SI, Allen DJ, Ortiz-Lopez A, Herna´ndez G (2001) Over- expression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and growth at low nitrogen concentrations J Exp Bot 52: 1071–1081 31 Gallardo F, Fu J, Cantón FR, García-Gutiérrez A, Cánovas FM and Kirby EG (1999) Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic poplar Planta 210: 19-26 32 Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W and Xiangning J (2003) "Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco", Plant Growth Regul, 41: 279-286 33 Hiei Y, Ohta S, Komari T, and Kumashiro T (1994) Efficient transformation of rice (Oriza sativa) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA The Plant Journal 6: 271-282 34 Hirel B and Cren M (1987) Glutamine synthetase in higher phants: Regulation of gene and protein expression from theorgan to the cell Plant Cell Physiol 40: 1187-1193 59 35 Ireland RJ, Lea PJ.( 1999) The enzymes of glutamine, glutamate, asparagine, and aspartate metabolism In: Singh BK, editor Plant Amino Acids, Biochemistry and Biotechnology New York: Marcel Dekker; 49–109 36 Jefferson RA (1987) “Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system” Plant Mol Biol Rep 5: 387–405 37 Kevil, C G., L Walsh, F S Laroux, T Kalogeris, M B Grishim, and J S Alexander (1997) An improved, rapid Northern protocol Biochemical and Biophysical Research Communications 238: 277- 279 38 Luo Jianzhong (2003) "Variation in growth and wood density of Eucalyptus urophylla In Eucalyptus in Asia", Proceeding of an international conference Turbull J.E edit, 94-100 39 Mathis R, Gamas P, Meyer Y, Cullimore JV (2000) The presence of GSI-like genes in higher plants: support for the paralogous evolution of GSI and GSII genes J Mol Evol 50: 116–122 40 Matsuoka T, Kuribara H, Akiyama H, Miura H, Goda Y, Kusakabe Y, Kenji I, Toyoda M, and Hino A (2001) A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize J Food Hyg Soc Japan 42, 24-32 41 Miflin BJ and Lea PJ (1980) Ammonia assimilation In: Miflin BJ, ed The biochemistry of plants, vol San Diego, CA, USA: Academic Press, 169– 202 42 Oliveira IC, Brears T, Knight TJ, Clark A and Coruzzi GM (2002) Overexpression of Cytosolic Glutamine Synthetase: Relation to Nitrogen, Light, and Photorespiration Plant Physiol 129: 1–11 43 Ow DW, Wood KV, DeLuca M, De Wet JR, Helinski DR, and Howell SH (1986) Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants Science 234: 856–859 44 Poke, F.S., R.E Vaillancourt, R.C Elliott & J.B Reid (2003) "Sequence variation in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD2)", Mol Breed, 12(2), 107-118 60 45 Rivera AL, Gómez-Lim M, Fernández F, Loske AM (2012) Physical methods for genetic plant transformation Physics of Life Reviews 9: 308–345 46 Sakurai N, Hayakawa T, Nakamura T, Yamaya T (1996) Changes in the cellular localization of cytosolic glutamine synthetase protein in vascular bundles of rice leaves at various stages of development Planta 200: 306–311 47 Santos, P.E.T (1990) "Potential for genetic improvement program, estimates of genetic parameters and genotype x environment interaction in Eucalyptus urophylla S.T.Blake stands", Scienctia Forestalis 43-44: 11-19 48 Schlamp K, A Weinmann, M Krupp, T Maass, PR Galle, and A Teufel (2008) BlotBase: a northern blot database Gene, 427(1-2): 47–50 49 Stéphanie M, Bernard and Dimah ZH (2009) The importance of cytosolic glutamine synthetase in nitrogen assimilation and recycling New Phytologist 182: 608–620 50 Waldron, C., Murphy, E.B., Roberts, J.L., Gustafson, G.D., Armour, S.L., and Malcolm, S.K (1985) Resistance to hygromycin B Plant Mol Biol 5:103–108 51 Wang K, Herrera-Estrella L, Van Montagu M, Zambryski P (1984) Right 25 bp terminus sequence of the nopaline T-DNA is essen tial for and determines direction of DNA transfer from Agrobacterium to the plant genome Cell 38:455-462 52 Wei X, Borralho N.M.G (1998a), "Genetic control of growth traits of Eucalyptus urophylla S.T Blake in Southest China", Silvae Genetica 47(2-3): 158-165 53 Zhong PJ, Gallardo F, Pascual MB, Sampalo R, Romero J, de Navarra AT and Cánovas FM (2004) Improved growth in a field trial of transgenic hybrid poplar overexpressing glutamine synthetase New Phytologist 164: 137– 145 54 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 61 62 ... cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu nitơ vào thuốc Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) Mục đích nghiên cứu Tạo dòng thuốc K326 dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu nitơ. .. dòng thuốc chuyển gen 35 3.2 Kết tạo dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 37 3.2.1 Kết chuyển cấu trúc gen GS1 vào Bạch đàn urô 37 Bảng 3.3 Kết chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô. .. đàn urô chuyển gen GS1 Biến nạp cấu trúc gen GS 1vào Bạch đàn Urô Kiểm tra có mặt gen GS1 dòng Bạch đàn urô chuyển gen phương pháp PCR phương pháp southern blot Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1