Trong 50 dòng ra rễ trên môi trường chọn lọc, chúng tôi đưa ra trồng được 41 dòng ở nhà kính, sau khi ra cây trồng được 3 tháng tuổi tiến hành thu mẫu lá non của các dòng Bạch đàn chuyển gen để tách chiết DNA tổng số. DNA tổng số được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. 3.2.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen GS1 và dòng đối chứng
Lấy mẫu 41 dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen GS1 (ký hiệu từ E- X1 đến E-X41) và 1 dòng cây không chuyển gen (ký hiệu: wt) làm đối chứng.
Mỗi dòng cắt khoảng 100 mg lá bánh tẻ làm mẫu tách chiết DNA tổng số. DNA tổng số được tách theo hướng dẫn kỹ thuật của Bộ kít (Plant DNA Isolation Kít, hãng Norgen - Canada).
DNA tổng số sau khi tách chiết được định tính bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá bánh tẻ Bạch đàn urô được thể hiện trên ảnh điện di đồ (hình 3.19 a,b) sau đây:
Hình 3.19a. DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen GS1, điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.19b. DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen GS1, điện di trên gel agarose 0,8%.
Trên ảnh điện di đồ, băng DNA tổng số thu được cho thấy một số mẫu chỉ có một phân đoạn duy nhất, đều, gọn, tập trung, không xuất hiện vệt sáng phía sau kéo dài, phân tử lượng cao (nằm gần giếng tra mẫu). Điều đó cho thấy các mẫu DNA tách chiết được không bị đứt gãy, có độ nguyên vẹn cao, không lẫn protein, các loại RNA và các tạp chất khác. Một số mẫu, ngoài việc thu được băng DNA có kích thước lớn nằm trên cùng, các mẫu DNA xuất hiện các
đoạn DNA nhỏ đứt gãy. Tuy nhiên, chất lượng DNA thu được đảm bảo đủ tiêu chuẩn để thực hiện phản ứng PCR nhân gen.
Bảng 3.4. Hàm lượng và độ sạch của các mẫu DNA tổng số.
Stt Tên mẫu Hàm lượng (ng/µl) Tỷ lệ OD260nm/ OD280nm Stt Tên mẫu Hàm lượng (ng/µl) Tỷ lệ OD260nm/ OD280nm 1 wt 524 1,86 22 E-X21 456 1,90 2 E-X1 427 1,82 23 E-X22 578 1,86 3 E-X2 623 1,90 24 E-X23 409 1,89 4 E-X3 615 1,91 25 E-X24 520 1,88 5 E-X4 619 1,94 26 E-X25 630 1,90 6 E-X5 578 1,86 27 E-X26 617 1,88 7 E-X6 592 1,89 28 E-X27 578 1,82 8 E-X7 713 1,85 29 E-X28 546 1,81 9 E-X8 675 1,82 30 E-X29 705 1,94 10 E-X9 498 1,80 31 E-X30 528 1,95 11 E-X10 597 1,96 32 E-X31 552 1,88 12 E-X11 598 1,82 33 E-X32 559 1,82 13 E-X12 646 1,90 34 E-X33 560 1,88 14 E-X13 466 1,87 35 E-X34 565 1,85 15 E-X14 497 1,98 36 E-X35 610 1,99 16 E-X15 520 1,92 37 E-X36 399 1,92 17 E-X16 488 1,87 38 E-X37 409 1,93 18 E-X17 625 1,85 39 E-X38 456 1,90 19 E-X18 467 1,90 40 E-X39 567 1,85 20 E-X19 510 1,90 41 E-X40 654 1,85 21 E-X20 592 1,89
Tiếp theo các mẫu DNA tách chiết được xác định nồng độ và độ tinh sạch trên máy Nanodrop2000: OD260nm và OD280nm; tỷ lệ OD260nm/OD280nm có giá trị 1,8 – 2,0; mẫu DNA được xem là sạch, còn tỷ số nhỏ hơn 1,8 và lớn hơn
2,0 cho biết DNA tách chiết còn bị nhiễm tạp protein. Kết quả đo các mẫu DNA tách chiết được trình bày cụ thể như bảng 3.4.
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy 42 mẫu DNA tổng số tách chiết từ lá bạch đàn đều có hàm lượng cao, giao động từ 399 đến 713 ng/µl. Tỷ lệ OD260nm/OD280nm của 16 mẫu DNA tổng số đều nằm trong khoảng 1,8 – 2,0, điều này cho thấy các mẫu DNA sạch protein đảm bảo chất lượng để thực hiện các phản ứng PCR nhân gen với mồi đặc hiệu. Các mẫu DNA tổng số, sau khi đo được hàm lượng DNA, tiến hành pha loãng các mẫu về cùng một nồng độ là 100 ng/µl bằng nước đề ion và bảo quản mẫu ở tủ - 20oC.
3.2.2.2. PCR nhân đoạn gen GS1 của các dòng bạch đàn urô chuyển gen
Các mẫu DNA tổng số tách chiết từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen (ký hiệu: E-X1 – E-X41) và cây đối chứng không chuyển gen (ký hiệu: wt) được sử dụng làm khuôn DNA trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân một đoạn gen gs1 có kích thước 408 bp (GS1-tF:5’- G A T G A A G A G A C A T G G T A C G G G-3’ và GS1-tR: 5’-G G A C T T G G T G C T G T A A T T T G T G -3’). Thành phần và chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR được mô tả như ở phần phương pháp.
Hình 3.20. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ các dòng Bạch đàn urô chuyển gen. Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100bp; (+) đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1); wt – cây không chuyển gen; đường chạy từ 1-36
tương ứng với mẫu E-X1 đến E-X36.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%; kết quả thu được cho thấy rằng: Trong 41 dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen phân tích có 7 dòng (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 408bp bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, rõ nét, bằng với mẫu đối chứng dương (+). Các dòng còn lại và mẫu wt đối chứng âm (cây không chuyển gen) không có xuất hiện băng DNA này. Kết quả này, bước đầu cho thấy 7 dòng Bạch đàn urô phân tích có thể là các dòng đã được chuyển gen GS1.
3.2.2.3. PCR nhân gen nptII của các dòng Bạch đàn urô chuyển gen
DNA tổng số của 7 dòng Bạch đàn urô chuyển gen dương tính với đoạn gen GS1 và dòng wt được sử dụng làm khuôn để phân tích sự có mặt của gen chọn lọc (gen nptII) trong các dòng Bạch đàn urô chuyển gen bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen nptII có kích thước 700 bp (NPTII-F: 5’-G A G G C T A T T C G G C T A T G A C T G-3’; NPTII-R: 5’-A T C G G G A G C G G C G A T A C C G T A-3’) tham khảo Tadeusz Wroblewski và cộng sự (2007). Thành phần và chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR được mô tả như ở phần phương pháp.
Hình 3.21. Sản phẩm PCR nhân gen nptII từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen. Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100bp; (+) đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1); wt – cây không chuyển gen; đường chạy từ 1-7
tương ứng với mẫu E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%; kết quả thu được như hình 6.3. Kết quả cho thấy vẫn 7 dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen có ký hiệu (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 700bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, rõ nét, bằng với mẫu đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1), mẫu wt đối chứng âm (cây không chuyển gen) không có xuất hiện băng DNA này. Kết quả này một lần nữa khẳng định 7 dòng Bạch đàn urô (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E- X25, E-X29, E-X32) phân tích có thể là các dòng đã được chuyển gen.
3.2.2.4. PCR nhân đoạn trình tự khởi động – 35S Promoter
Ngoài việc kiểm tra gen mục tiêu (gen GS1), gen chọn lọc (gen nptII), để khẳng định các dòng Bạch đàn urô (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E- X29, E-X32) là dòng chuyển gen. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu p35S-cf3: 5’- C C A C G T C T T C A A A G C A A G T G G- 3’ và p35S-cr4: 5’- T C C T C T C C A A A T G A A A T G A A C T T C C -3’ để nhân một đoạn khởi động 35S-Promoter có kích thước khoảng 123 bp.
Tương tự như trên, 7 mẫu DNA tổng số tách chiết từ các dòng Bạch đàn urô chuyển gen (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) và cây đối chứng không chuyển gen (wt) được sử dụng làm khuôn DNA trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (p35S-cf3 và p35S-cr4). Thành phần và chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR được mô tả như ở phần phương pháp.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%; kết quả thu được như hình 6.4. Kết quả cũng cho thấy 7 mẫu DNA tách chiết từ 7 dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 123 bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, đậm, rõ nét và bằng với mẫu đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1). Trong khi đó, mẫu wt (cây không chuyển gen) không có xuất hiện băng DNA này. Đoạn trình tự phân lập từ loại virút khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus), không có ở thực vật. Vì vậy, các dòng Bạch đàn urô khi PCR xuất hiện băng DNA của 35S Promoter, được xem là các dòng cây đã được chuyển gen ngoại lai.
Hình 3.22. Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen. Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100bp; (+) đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1); wt – cây không chuyển gen; đường chạy từ 1- 7 tương ứng với mẫu E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32.
M wt + 1 2 3 4 5 M wt 6 7
3.2.2.5. PCR nhân đoạn trình tự kết thúc – NOS–Terminator
Ngoài đoạn trình tự 35S Promoter, trong cassette chuyển gen (RB - NOS-P/NPTII/NOS-T-35S-P/GS1/NOS-T - LB) vào Bạch đàn urô còn có đoạn DNA điều hòa kết thúc phiên mã NOS-Termanator (NOS-T). Do đó, trong nghiên cứu này cùng với việc kiểm tra sự có mặt của đoạn trình tự 35S Promoter, chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra sự có mặt của đoạn NOS-T trong các dòng Bạch đàn urô chuyển gen. NOS – Termanator phân lập từ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens nếu dòng Bạch đàn urô nào xuất hiện có mặt của đoạn trình tự NOS – Termanator cũng được xem là đã chuyển gen ngoại lại (vì trong thực vật không có đoạn trình tự này).
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu HA-nos-f: 5’-G C A T G A C G T T A T T T A T G A G A T G G G-3’ và HA-nos-r: 5’-G A C A C C G C G C G C G A T A A T T T A T C C-3’ để nhân một đoạn trình tự kết thúc NOS-T có kích thước khoảng 118 bp. 7 mẫu DNA tổng số tách chiết từ 7 dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) và cây đối chứng không chuyển gen (wt) được sử dụng làm khuôn DNA trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (HA-nos-f và HA-nos-r). Thành phần và chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR được mô tả như ở phần phương pháp.
Hình 3.23. Sản phẩm PCR nhân đoạn NOS-T từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen. Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 1Kb; (+) đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GA20); wt – cây không chuyển gen; đường chạy từ 1-7 tương ứng
với mẫu E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32.
Kết quả cũng cho thấy 7 mẫu DNA của 7 dòng Bạch đàn urô chuyển gen (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) đều xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 118 bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, đậm, rõ nét và bằng với mẫu đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1). Ngược lại, mẫu wt (cây không chuyển gen) không có xuất hiện băng DNA này. Một lần nữa khẳng định các dòng Bạch đàn urô này có thể đã được chuyển cấu trúc gen ngoại lai (RB - NOS-P/NPTII/NOS-T-35S-P/GS1/NOS-T - LB).