Phương pháp chuyển gen thông qua A. Tumefaciens dựa trên cơ chế gây bệnh của A. Tumefaciens khi xâm nhiễm vào tế bào, gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u nên A. Tumefaciens được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn. Để khai thác và sử dụng Ti-plasmid của A. tumefaciens như một vector chuyển gen các nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine trong đoạn T-DNA và thay thế vào đó là các gen marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ của T- DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào nhờ các gen chvA, chB (giúp A. tumefaciens tiếp xúc được với tế bào thực vật bị tổn thương) và các protein của vùng vir (virE, virB, virG, virD-cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-
plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới thân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của tế bào nhận).
Chuyển gen GS1 vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
cũng là một bước quan trọng trong toàn bộ quá trình tạo được cây chuyển gen. Hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương đối đơn giản và thời gian tái sinh từ mô lá đến cây hoàn chỉnh ngắn (khoảng 3 tháng) và tỷ lệ tái sinh cao nên cây chúng tôi đã lựa chọn cây thuốc lá làm cây mô hình cho chuyển gen GS1.
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen GS1 vào thuốc lá K326 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn:
Chủng vi khuẩn A.tumefaciens tạo khuẩn lạc trên đĩa thạch để thành những dòng thuần riêng biệt. Sau khi chọn một khuẩn lạc để nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin 50 mg/l và rifamycin 50 mg/l, cần nuôi phục hồi từ 3-4 giờ ở điều kiện 220 vòng/phút ở 280C để khuẩn lạc ở pha log, ở pha này vi khuẩn A.tumefaciens đạt trạng thái khỏe nhất thuận lợi cho quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn vào đối tượng chuyển gen.
Hiệu suất của quá trình chuyển gen phụ thuộc phần lớn vào chất lượng của khuẩn, nếu khuẩn quá yếu OD600 quá thấp (0,1 đến 0,4) vi khuẩn không đủ khả năng xâm nhiễm vào mẫu cấy. Ngược lại, OD600 quá cao (lớn hơn 1) lúc
Vi khuẩn trên môi trường LB đặc
Dịch huyền phù vi khuẩn
Mảnh lá ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn
Tái sinh đa chồi
Ra rễ Ra cây bầu đất
Trồng cây trong bầu đất
này vi khuẩn đi vào trạng thái thoái già hóa và chết đi cũng không đủ khả năng xâm nhiễm mặc dù đã tối ưu các điều kiện khác.
Dịch huyền phù vi khuẩn thu được có giá trị đo OD600 = 0,5 đủ điều kiện để biến nạp vào thuốc lá (hình 3.2).
Hình 3.2. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens. A: A. tumefaciens trên môi trường LB đặc bổ sung kanamycin và rifamycin; B: A. tumefaciens sau khi nuôi phục hồi
trên môi trường LB lỏng. Giai đoạn biến nạp và đồng nuôi cấy:
Các mảnh lá được ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn (để tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào mô lá. Sau 10 - 15 phút lây nhiễm chuyển các mảnh lá lên giấy thấm đã khử trùng, thấm khô. Sau biến nạp, các mảnh lá được đồng nuôi cấy hai ngày trên môi trường Co và chuyển sang môi trường chọn lọc CL-TL50.
Hình 3.3. Biến nạp và đồng nuôi cấy. Giai đoạn chọn lọc sau biến nạp:
Cấu trúc gen chuyển pBI121-35S/GS1 (đoạn T-DNA mang gen GS1 dưới sự điều khiển biểu hiện của promoter 35S và gen nptII dưới sự điều khiển biểu hiện của NOS-promoter) nên gen GS1 và nptII được chuyển đồng thời vào cây chuyển gen. Gen ntpII (neomycin phosphotransferase II) – kháng kanamycin là gen có khả năng tạo ra sản phẩm ức chế tác động của kanamycin được bổ sung
trong môi trường chọn lọc nên trên môi trường chọn lọc CL-TL50 bổ sung kanamycin 50mg/l, những mảnh lá, cụm chồi, cây không mang cấu trúc gen chuyển GS1 cũng đồng thời không mang gen kháng kanamycin thì sẽ không thể tái sinh và phát triển được. Kanamycin tác động tới các tế bào không chuyển gen theo cơ chế liên kết với tiểu phần nhỏ của ribosome trong tế bào, ức chế quá trình sinh tổng hợp protein và các con đường sinh tổng hợp khác liên quan, trong đó có hoạt động của lục lạp. Mảnh lá, cụm chồi, cây mất khả năng hấp thụ dinh dưỡng, hoạt động của lục lạp bị rối loạn nên sẽ bị vàng và chết dần. Vì vậy, kanamycin được dùng rộng rãi như một chất chọn lọc các tế bào, mảnh lá, cây chuyển gen (Bevans và cs, 1983; Herrera-Estrlla và cs, 1983) qua các giai đoạn.
Sau đồng nuôi cấy các mảnh lá thuốc lá được chuyển sang môi trường CL-TL50, khoảng 2 -3 tuần các mảnh lá được cảm ứng tạo mô sẹo được tách và cấy chuyển sang môi trường chọn lọc CL-TL50 một lần nữa. Các chồi mọc tốt trên môi trường CL-TL50 được tách và cấy chuyển sang môi trường ra rễ RR để tạo thành cây hoàn chỉnh. Kết quả theo dõi quá trình tái sinh của các dòng qua các giai đoạn khác nhau thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1.Tỷ lệ tái sinh/ sống sót của các mẫu biến nạp qua các giai đoạn (%)
Ghi chú: Đ/C (-): mẫu thuốc lá không biến nạp gen.
Kết quả cho thấy rằng, từ 50 mảnh lá thuốc lá biến nạp gen thu được 35 mảnh lá cảm ứng tạo được cụm chồi trên môi trưởng bổ sung kanamycin, chiếm tỷ lệ 70%. Các cụm chồi được tách ra khỏi mảnh lá và cấy chuyển sang
Thí nghiệm Mảnh lá biến nạp Mảnh lá tạo cụm chồi Tỷ lệ (%) Số chồi phát triển trên CL- TL150 Số chồi ra rễ trên RR50 Tỷ lệ (%) Mẫu thuốc lá K326 chuyển gen GS1 50 35 70 38 32 84,21 Đ/C (-) 15 - - - - -
môi trường chọn lọc mới (CL-TL150) thu được 38 chồi phát triển tốt. Ngược lại, các mảnh lá thuốc lá không biến nạp gen - Đ/C (-), 100% mẫu bị vàng và chết không tạo được chồi trên môi trường bổ sung kháng sinh kanamycin (hình 3.4).
Hình 3.4. Mảnh lá trên môi trường chọn lọc sau 2 tuần. A: Mẫu lá biến nạp trên môi trường chọn lọc CL-TL50; B: Mẫu lá không biến nạp trên môi trường tái sinh TS; C: Mẫu lá không biến nạp trên môi trường chọn lọc CL-TL50
Một dòng chuyển gen hoàn chỉnh phải có khả năng ra rễ để phát triển thành một cây hoàn thiện trên môi trường chọn lọc. Những chồi không chuyển gen sẽ không có khả năng ra rễ, vàng và chết dần.
Hình 3.5. Cây thuốc lá chuyển gen GS1 trên môi trường chọn lọc CL-TL50
Qua các giai đoạn chọn lọc in vitro, từ 38 dòng đã thu được 32 dòng chuyển gen GS1 phát triển tốt, lá xanh đậm, chồi mập, bộ rễ dài (hình 3.5) trên môi trường ra rễ chọn lọc. Tỷ lệ ra rễ của các chồi chuyển gen GS1 (84,21%) trên môi trường chọn lọc ra rễ là tương đối cao.. Bước đầu có thể dự đoán 32 dòng thuốc lá thu được là các dòng chuyển gen GS1; Tuy nhiên để khẳng định chắc chắn các dòng này là dòng chuyển gen, chúng tôi ra đưa các dòng chuyển gen GS1 và dòng không chuyển gen (wt) ra trồng trong giá thể đất để thu lá phân tích bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu nhận gen GS1.