2.3.1.1. Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens
Chuyển gen vào thuốc lá được thực hiện theo phương pháp của Topping cải tiến (1998), sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens có chứa vector chuyển gen pBI121-35S/GS1 có kích thước khoảng 13kb chứa gen GS1dưới sự điều khiển của promoter 35S và gen nptII dưới sự điều khiển của NOS- promoter. Các bước được tiến hành như sau:
Bước 1: chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa gen quan tâm được bảo quản trong glycerol -800C được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc, nuôi tối ở 280C trong 2 ngày.
Bước 2: cây con in vitro phát triển 3-4 lá thật, chọn các lá bánh tẻ để tiến hành biến nạp. Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1 cm2.
Bước 3: một ngày trước khi biến nạp, chọn khuẩn lạc tròn đều, đứng độc lập nuôi lỏng trong 10 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi qua đêm (16h). Sau đó nuôi phục hồi thêm 4h trong 100 ml LB lỏng không bổ sung kháng sinh chọn lọc.
Bước 4:biến nạp:
-Khuẩn sau khi nuôi được đem đo OD650=0,5-0,7 thì sử dụng để biến nạp.
-Đem ly tâm thu cặn khuẩn, cặn khuẩn được hòa tan với dung dịch ½ MS để tạo dịch huyền phù vi khuẩn.
Các mảnh lá được chuyển sang bình tam giác có chứa dịch huyền phù vi khuẩn.
Bước 5: sau 10 phút chuyển các mảnh lá lên giấy thấm khử trùng, thấm khô và cấy lên môi trường CL-TL150
Bước 6: sau 2-3 tuần các mảnh lá bắt đầu được cảm ứng tạo mô sẹo, chuyển sang môi trường CL-TL150
Bước 7: sau 4-6 tuần các mảnh lá đã tạo chồi, các chồi phát triển tốt được chuyển sang môi trường tạo rễ RR50
Bước 8: cây con ra nhiều rễ, cao 5-7 cm thì được đưa ra bầu chứa giá thể đất: trấu: cát (1:1:1). Sau đó cho cây vào túi nilông, ghim phần trên và đưa vào
phòng nuôi cây có điều khiển nhiệt độ 25-280C, 2000 lux, 16h chiếu sáng trong 1 tuần.
Bước 9: đưa cây ra trong nhà kính.
Bước 10: sau 2 tuần cây ổn định, có độ đồng đều về kích thước đảm bảo phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.1.2. Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen bằng kĩ thuật PCR
Sau khi trồng ra bầu đất, cây phát triển ổn định, lá xanh tốt thì tiến hành lấy lá để phân tích cây chuyển gen.
a) Phương pháp tách triết DNA tổng số
Mẫu lá non của các dòng thuốc lá chuyển gen và các dòng thuốc lá đối chứng đem tách triết DNA theo quy trình (Michele và cs, 2002).
Quy trình tiến hành như sau:
Bước 1: nghiền 0,15g mẫu lá non bằng ống eppendort 2 ml trong nitơ lỏng để phá vỡ thành tế bào.
Bước 2: bổ sung 500 µl đệm triết SDS, trộn đều.
Bước 3: ủ trong bể ổn nhiệt 650C trong 5 phút, thỉnh thoảng đảo qua đảo lại để tăng khả năng biến tính các thành phần khác không phải DNA.
Bước 4: bổ sung tiếp 150 µl CH3COOK 5M, đảo đều, ủ ở trên đá 10 phút Bước 5: ly tâm 13 000 vòng, 10 phút, thu 500 µl dịch nổi cho vào ống mới
Bước 6: bổ sung 350 µl isopropanol lạnh, để trong 20-30 phút để tăng lượng tủa thu được, ly tâm 13 000 vòng, 10 phút, đổ bỏ phần dịch phía trên, thu tủa. Bước 7: rửa tủa DNA bằng 350 µl cồn 70%, lặp lại 2 lần.
Bước 8: làm khô tủa ở nhiệt độ thường hoặc bằng máy làm khô.
Bước 9: hòa tan DNA vào 50 µl TE hoặc nước deion có bổ sung RNase nồng độ 100µg/ml.
Bước 10: bảo quản DNA trong tủ -200C.
Bước 11: DNA thu được sau quá trình tách triết, được mang đi đo OD260/280
bằng máy NanoDrop để kiểm tra độ tinh sạch DNA và nồng độ DNA, sau đó pha loãng về nồng độ 100 ng/µl để thực hiện phản ứng PCR tiếp theo.
Phương pháp PCR để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển mục tiêu GS1 trong các dòng thuốc lá chuyển gen với cặp mồi đặc hiệu là pGS1-F:5’- tctagagagagatccttttctgctctttgaa-3’/pGS1-R: 5’-gagctcaatcggaaaacgagggaaag -3’
Thành phần của phản ứng PCR được sử dụng theo kit GoTaq®Green Master Mix của hãng Promega được mô tả trong bảng 2.4 và chu trình nhiệt được tiến hành theo bảng 2.5.
Bảng 2.4. thành phần của phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen Thành phần Thể tích 1 phản ứng (µl) Master Mix (2X) Tag polymerease 7,5 Ion Mg2+ dNTP mix Go Taq Buffer Loading Dye 6X DNA 2 Forward Primer 5pM 0,6 Reverse Primer 5pM 0,6 H2O 4,3 Tổng thể tích 15
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kì
Khởi đầu 94 4 phút 1 Biến tính 94 40 giây 35 Gắn mồi 56 40 giây Kéo dài 72 1 phút 72 7 phút Giữ 4 ∞
c) Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% . Theo phương pháp của Sambrook và cs với quy trình như sau:
Bước 1: chuẩn bị gel agarose 0,8%: cân 0,8g agarose hòa tan trong 100 ml dung dịch TAE 1X, lắc đều và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50-600C, đổ dung dịch vào khay điện di có cài sẵn răng lược và đặt bản gel vào bể điện di, đổ dung dịch TAE 1X ngập bản gel.
Bước 2: tra mẫu và điện di: sản phẩm PCR được tra vào giếng, điện di cùng với Marker 1kb để kiểm tra kích thước.
Bước 3: nhuộm bản gel: bản gel được lấy ra từ khuôn, ngâm khoảng 10-20 phút trong dung dịch nước có chứa EtBr, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 302 nm trên máy soi DNA, ảnh được chụp bằng máy soi gel.
2.3.1.3. Phương pháp đánh giá về hình thái, sinh trưởng của các dòng thuốc lá chuyển gen GS1
Để đánh giá về khả năng sử dụng hiệu quả nitơ của các dòng thuốc lá chuyển gen và không chuyển gen, các cây thuốc lá sau 2-4 tuần trồng trên giá thể, có độ đồng đều về kích thước được chuyển ra ngoài môi trường nhà kính, không bón phân. Khi cây trồng được 3 tháng tuổi và 5 tháng tuổi chúng tôi sẽ đánh giá về khả năng sinh trưởng và phát triển của cây qua chỉ tiêu về chiều cao cây. Các chỉ tiêu về chiều cao cây được tổng hợp, phân tích và đánh giá bằng phần mền excel (T-test).