Bảy dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 được kiểm tra dương tích với phản ứng PCR được chúng tôi tiếp tục phân tích bằng kỹ thuật lai southern để kiểm tra sự có mặt của gen trong genome và số bản sao của gen chuyển. Do cây bạch đàn cũng có họ gen GS1 nên trong phản ứng lai southern chúng tôi kiểm tra sự có mặt của gen nptII bằng mẫu dò. Nếu dòng cây kiểm tra lai southern dương tính với gen nptII thì cũng đồng nghĩa với dương tính với gen GS1 (2 gen chuyển đồng thời trong cùng cấu trúc chuyển gen).
Kết quả lai southern thu được như hình 3.25 cho thấy 7 dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 và gen nptII (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) phân tích có các dòng (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X29) dương tính chứa một bản copy gen chuyển trong genome của cây Bạch đàn urô chuyển gen; dòng E-X25 và E-X32 âm tính.
Hình 3.24. Kết quả Southern blot các mẫu bạch đàn chuyển gen GS1 và nptII. M: Marker 1kb, P: sản phẩm PCR gen nptII; wt: dòng bạch đàn urô không chuyển gen; giếng 1-7: các dòng cây bạch đàn urô chuyển gen tương ứng E-X7,
E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
1. Đã tạo được 25 dòng thuốc lá chuyển gen GS1 dương tính với phản ứng PCR
2. Đã thu được 50 chồi ra rễ trên môi trường chọn lọc 75 mg/l kanamycin. 3. Đã thu được 7 dòng PCR dương tính với gen GS1, gen nptII, đoạn trình
tự 35S-Promoter, đoạn trình tự NOST và dương tính với phân tích lai Southern.
4. Các dòng dương tính đều mang một bản sao của gen chuyển trong genome.
Kiến nghị:
1. Đánh giá mức độ biểu hiện của gen chuyển bằng kỹ thuật RT-PCR hoặc lai Nothern hoặc Western.
2. Đánh giá mức độ ổn định của gen chuyển qua các thế hệ nhân giống dinh dưỡng
3. Phân tích đánh giá tốc độ sinh trưởng và các đặc điểm lâm học của các dòng Bạch đàn urô chuyển gen ở nhà kính.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Đặng Trọng Lương, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (2001a), "Nghiên cứu chuyển gen cryIA(c) kháng sâu vào một số giống cải bắp (Brassica oleraceavar capitana) qua Agrobacterium", Kết quả nghiên cứu khoa học 1999-2000, Viện Di truyền Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà nội, tr. 120-128.
2. Dương Mộng Hùng (1993), Chọn cây trội và nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào cho hai loài bạch đàn E. camadulensis và E. urophylla, Báo cáo đề tài, trường Đại Học Lâm nghiệp, Hà Tây.
3. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
4. Nguyễn Đức Kiên, Trần Hồ Quang, Gunnar Jansson, Chris Harwood, David Clapham, Sara von Arnold (2009), "Cellulose content as a selection trait in breeding for kraft pulp yield in Eucalyptus urophylla", Ann. For. Sci. (66), tr. 711-719.
5. Nguyễn Hoàng Nghĩa (2000), Chọn giống bạch đàn Eucalyptus theo sinh trưởng và kháng bệnh ở Việt Nam. NXB Nông nghiệp.
6. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Lê Đình Khá, Hoàng Chương (1993), Kết quả khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn giai đoạn 1990-1992, Báo cáo khoa học, Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam.
7. Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển (1999), Tạo cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) kháng thuốc trừ cỏ basta bằng chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà nội, tr. 1297-1304.
8. Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển (1999), Tạo cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) kháng thuốc trừ cỏ basta bằng chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà nội, tr. 1297-1304.
9. Nguyễn Luyện, "Tìm hiểu về cây bạch đàn E. urophylla", Tạp chí lâm nghiệp (số 10, tháng 10/1991).
10. Nguyễn Quang Thạch, (1995), Công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
11. Nguyễn Quang Thạch, (2000), Giáo trình sinh lý thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
12. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
13. Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2003), "Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro cây Hông (Paulownia forturey) và ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc để tạo cây chuyển gen", Báo cáo Khoa học hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2003, tr. 866-869.
14. Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2003), "Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro cây Hông (Paulownia forturey) và ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc để tạo cây chuyển gen", Báo cáo Khoa học hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2003, tr. 866-869.
15. Phạm Thị Vân (2009), Nghiên cứu tạo cây thuốc lá kháng bệnh khảm bằng kỹ thuật RNAi. Luận văn Thạc sỹ sinh học.
16. Phan Tố Phượng, Phạm Thu Hằng, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý, Lili C., Zhang S., Fauquet C. M., Beachy R. N. (1998). Chuyển gen kháng
hygromycin, gen gus và gen kháng bệnh bạc lá vào lúa bằng súng bắn gen. Tạp chí Nông nghiệp và Công nghiệp thực phẩm, (2), tr. 56-57.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
17. Ahlandsberg S, Sathish P, Sun C, and Jansson C (1999) Green fluorescent protein as a reporter system in the transformation of barley cultivars. Physiol Plant 107: 194–200.
18. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977) Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc Natl Acad Sci. 74: 5350–5354.
19. Becker TW, Caboche M, Carrayol E and Hirel B (1992) Nucleotide
sequence of a tobacco cDNA encoding plastidic glutamine synthetase and light- inducibility, organ specificity and diurnalrhythmicity in the expression of the corresponding genes of tobacco and tomato. Plant Mol Biol 19: 367-379.
20. Biesiadka J, Legocki AB. (1997) Evolution of the glutamine synthetase gene in plants. Plant Science 128: 51–58.
21. BRECHLIN P., MÄCK G., BURBA M. und TISCHNER R. (1999) Changes in the isoform pattern and subunit composition of GS-1 in sugar beet leaves depent on leaf age. Plant Physiol 155: 497-502.
22. Brugiere N, Dubois F, Masclaux C, Sangwan R, Hirel B. (2000) Immunolocalization of glutamine synthetase in senescing tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaves suggest that ammonia assimilation is progressively shifted to the mesophyll cytosol. Planta. 211:519–527.
23. Cantón FR, Suarez MF, Jose-Estanyol M and Cánovas F (1999)
Expression analysis of a cytosolic glutamine synthetase genein cotyledons of scots pine seedlings: Developmental regulationand spatial distribution of specific transcripts. Plant Mol Biol 40: 623-634.
24. Clemente MT and Marquez AJ (1999) Site-directed mutagenesis of Glu- 297 from the [alpha] – polypeptide of Phaseolus vulgaris glutamine synthetase alters kinetic and structural propertiesand confers risistance to L-methionine sulfoximine. Plant Mol Biol 40: 835-845.
25. Cren M and Hirel B (1999) Glutamine synthetase in higher phants: Regulation of gene and protein expression from theorgan to the cell. Plant Cell Physiol 40: 1187-1193.
26. DeBlock M, De Brower D, and Tenning P (1989) Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants. Plant Physiol. 91: 694–701.
27. Dubois F, Brugière N, Sangwan RS and Hirel B (1996) Localisation of
tobacco cytosolic glutamine synthetase enzymes and the corresponding transcripts show organ-and cell-specific patterns of protein synthesis and gene expression. Plant Mol Biol 31: 803-817.
28. FAO (2004). Priliminary review of biotechnology in forestry including
genetic modification.
29. Fraley RT, Rogers SG, Horsch RB (1983) Expression of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803–4807.
30. Fuentes SI, Allen DJ, Ortiz-Lopez A, Herna´ndez G (2001) Over- expression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and growth at low nitrogen concentrations. J Exp Bot 52: 1071–1081
31. Gallardo F, Fu J, Cantón FR, García-Gutiérrez A, Cánovas FM and Kirby EG (1999) Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic poplar. Planta 210: 19-26.
32. Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W. and Xiangning J. (2003) "Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco", Plant Growth Regul, 41: 279-286.
33. Hiei Y, Ohta S, Komari T, and Kumashiro T (1994) Efficient transformation of rice (Oriza sativa) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6: 271-282.
34. Hirel B and Cren M (1987) Glutamine synthetase in higher phants: Regulation of gene and protein expression from theorgan to the cell. Plant Cell Physiol 40: 1187-1193.
35. Ireland RJ, Lea PJ.( 1999) The enzymes of glutamine, glutamate, asparagine, and aspartate metabolism. In: Singh BK, editor. Plant Amino Acids, Biochemistry and Biotechnology. New York: Marcel Dekker; 49–109.
36. Jefferson RA (1987) “Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system”. Plant Mol Biol Rep 5: 387–405.
37. Kevil, C. G., L. Walsh, F. S. Laroux, T. Kalogeris, M. B. Grishim, and J. S. Alexander. (1997) An improved, rapid Northern protocol. Biochemical and Biophysical Research Communications 238: 277- 279.
38. Luo Jianzhong (2003) "Variation in growth and wood density of Eucalyptus urophylla. In Eucalyptus in Asia", Proceeding of an international conference. Turbull J.E. edit, 94-100.
39. Mathis R, Gamas P, Meyer Y, Cullimore JV (2000) The presence of GSI-like genes in higher plants: support for the paralogous evolution of GSI and GSII genes. J Mol Evol 50: 116–122.
40. Matsuoka T, Kuribara H, Akiyama H, Miura H, Goda Y, Kusakabe Y, Kenji I, Toyoda M, and Hino A (2001) A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize. J Food Hyg Soc Japan 42, 24-32.
41. Miflin BJ and Lea PJ (1980) Ammonia assimilation. In: Miflin BJ, ed.
The biochemistry of plants, vol 5. San Diego, CA, USA: Academic Press, 169– 202.
42. Oliveira IC, Brears T, Knight TJ, Clark A and Coruzzi GM (2002) Overexpression of Cytosolic Glutamine Synthetase: Relation to Nitrogen, Light, and Photorespiration. Plant Physiol 129: 1–11.
43. Ow DW, Wood KV, DeLuca M, De Wet JR, Helinski DR, and Howell SH (1986) Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science 234: 856–859.
44. Poke, F.S., R.E. Vaillancourt, R.C. Elliott & J.B. Reid (2003) "Sequence variation in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (CAD2)", Mol. Breed, 12(2), 107-118.
45. Rivera AL, Gómez-Lim M, Fernández F, Loske AM (2012) Physical methods for genetic plant transformation. Physics of Life Reviews 9: 308–345.
46. Sakurai N, Hayakawa T, Nakamura T, Yamaya T. (1996) Changes in the cellular localization of cytosolic glutamine synthetase protein in vascular bundles of rice leaves at various stages of development. Planta 200: 306–311.
47. Santos, P.E.T (1990) "Potential for genetic improvement program, estimates of genetic parameters and genotype x environment interaction in
Eucalyptus urophylla S.T.Blake stands", Scienctia Forestalis 43-44: 11-19.
48. Schlamp K, A. Weinmann, M. Krupp, T. Maass, PR Galle, and A. Teufel (2008) BlotBase: a northern blot database. Gene, 427(1-2): 47–50.
49. Stéphanie M, Bernard and Dimah ZH (2009) The importance of cytosolic glutamine synthetase in nitrogen assimilation and recycling. New Phytologist 182: 608–620
50. Waldron, C., Murphy, E.B., Roberts, J.L., Gustafson, G.D., Armour, S.L., and Malcolm, S.K. (1985) Resistance to hygromycin B. Plant Mol Biol
5:103–108.
51. Wang K, Herrera-Estrella L, Van Montagu M, Zambryski P (1984) Right 25 bp terminus sequence of the nopaline T-DNA is essen tial for and determines direction of DNA transfer from Agrobacterium to the plant genome. Cell 38:455-462.
52. Wei X, Borralho N.M.G (1998a), "Genetic control of growth traits of
Eucalyptus urophylla. S.T. Blake in Southest China", Silvae Genetica 47(2-3):
158-165.
53. Zhong PJ, Gallardo F, Pascual MB, Sampalo R, Romero J, de Navarra AT and Cánovas FM (2004) Improved growth in a field trial of transgenic
hybrid poplar overexpressing glutamine synthetase. New Phytologist 164: 137– 145..