2.3.2.1. Phương pháp chuyển gen vào Bạch đàn urô
a) Chuẩn bị vật liệu chuyển gen
-Hạt bạch đàn được sát khuẩn bằng cồn 70% (v/v) trong thời gian 1 phút, loại bỏ cồn, sau đó khử trùng tiếp bằng Javel 50% trong thời gian 5 - 7 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần (lắc mạnh). Ngâm trong nước ít nhất 1 giờ. Sau đó thấm khô hạt bằng giấy thấm khử trùng, hạt không quá khô.
-Hạt bạch đàn sau khi khử trùng được cấy vào môi trường dinh dưỡng MS cơ bản có bổ sung thêm 30 g/l đường và 8 g/l agar, pH 5,8. Để trong tối, điều kiện nhiệt độ phòng nuôi cấy 25oC, trong thời gian 3 ngày. Sau 3 ngày trong tối, hạt bắt đầu nảy mầm và chuyển cây mầm nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng 4-5 ngày, hạt nẩy mầm đồng đều thành cây mầm.
-Dùng panh và dao cắt các đoạn thân mầm dài khoảng 0,5 cm và lá mầm có chứa cuống lá trên giấy thấm đã được làm ẩm bằng nước cất khử trùng để tránh khô mẫu. Gắp thân mầm và lá mầm vào đĩa petri chứa môi trường tiền nuôi cấy (Bảng 2.4) và nuôi trong tối 2 ngày ở 25oC. Đoạn thân mầm và mảnh lá mầm sau khi tiền nuôi cấy sẽ được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.
b) Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens C58 mang gen GS1
-Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: lấy khuẩn A. tumefaciens chủng C58 chứa vector chuyển gen được bảo quản trong glycerol ở -850C, cấy trải khuẩn lên môi trường LB đặc bổ sung 50mg/l kanamycin, 50 mg/l rifamycin. Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 280C trong 2 ngày.
- Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: chọn một khuẩn lạc cho vào 10 ml môi trường LB lỏng bổ sung hai loại kháng sinh với hàm lượng 50mg/l kanamycin và 50mg/l rifamycin. Nuôi khuẩn ở nhiệt độ 280C, lắc 200v/p, trong 14 -16 giờ. Sau đó hút một 2ml dịch vi khuẩn cho vào 50ml LB lỏng, nuôi lắc 200v/p, ở nhiệt độ 280C, trong 4 - 5 giờ cho đến khi OD600 0,5-0,8. Dịch vi khuẩn được ly tâm lạnh ở tốc độ 5.000v/p, trong 10 phút, rồi loại bỏ dịch nổi thu cặn vi khuẩn. Hoà tan cặn vi khuẩn trong dung dịch 1/2MS lỏng với giá trị OD600= 0,5. Để dung dịch ổn định trong 30 phút rồi mới dùng để biến nạp gen.
c) Chuyển gen GS1 vào vật liệu nhận gen
Thể nhận gen được ngâm trong dung dịch A.tumefaciens đã chuẩn bị ở trên trong 10 phút (lắc nhẹ). Sau đó, mẫu được thấm khô và cấy chuyển lên môi trường đồng nuôi cấy (Bảng 2.3), ở nhiệt độ 250C, trong 72 giờ để vi khuẩn xâm nhiễm và chuyển gen sang tế bào thực vật.
d) Rửa khuẩn và cảm ứng tạo chồi
Sau 3 ngày đồng nuôi cấy, thân mầm và lá mầm được rửa khuẩn bằng nước cất vô trùng 1 lần và rửa lại bằng nước cất bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime 400 mg/l, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và chuyển sang môi trường cảm ứng tạo chồi (Bảng 2.3), nuôi dưới ánh sáng cường độ 2.000lux, 25oC trong 4 ngày. Lá mầm và thân mầm chuyển gen GS1 sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường cảm ứng tạo chồi sẽ được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc bổ sung kháng sinh kanamycin.
e) Tái sinh chồi chuyển gen trên môi trường chọn lọc
Mẫu thân mầm và lá mầm sau khi được chuyển sang môi trường chọn lọc trong vòng 21-24 ngày tạo mô sẹo, những mô sẹo lại tiếp tục được chọn lọc trên môi trường có bổ sung kanamycin 150 mg/l, được nuôi cấy dưới ánh sáng trắng cường độ 2.000 lux, 250C. Sau 4 tuần nuôi cấy, các chồi phát triển được chuyển vào môi trường ra rễ có bổ sung 400 mg/l cefotaxime và 75 mg/l kanamycin. Sau 3 tuần xác định số mẫu cấy số mẫu tạo sẹo/ tổng số mẫu cấy ban đầu, số mẫu tạo cụm chồi/ tổng số mẫu cấy ban đầu.
2.3.2.2. Phân tích các dòng cây bạch đàn urô chuyển gen a) Phương pháp tách triết DNA tổng số
Tách chiết DNA tổng số của các dòng bạch đàn urô chuyển gen GS1 và 1 dòng cây không chuyển gen (ký hiệu: wt) làm đối chứng. Lấy khoảng 100 mg lá ở phần ngọn làm mẫu tách chiết DNA tổng số. DNA tổng số được tách theo hướng dẫn kỹ thuật của Bộ Kít (Plant DNA Isolation Kít, hãng Norgen).
b) Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng Bạch đàn urô chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp PCR nhân đoạn gen mục tiêu (gen GS1) từ các dòng Bạch đàn urô chuyển gen
- Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen GS1 có kích thước 408 bp, như sau: GS1-tF: 5’-G A T G A A G A G A C A T G G T A C G G G -3’ và GS1-tR: 5’- G G A C T T G G T G C T G T A A T T T G T G -3’.
- Mẫu DNA tổng số: đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1, ký hiệu +); DNA tổng số tách từ cây Bạch đàn urô không chuyển gen (ký hiệu: wt);
Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen GS1:
Stt Thành phần Thể tích (µl)
1. H2O deion 8,5
2. 2X PCR mastermix 12,5
3. Prime 1: GS1-tF 10 pM 1,0
5. DNA sợi khuôn 2,0
Tổng thể tích 25
Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR nhân đoạn gen GS1:
Bước Nhiệt độ Thời gian
1. Biến tính 95oC 5 phút
2. Biến tính 94oC 1 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Bắt mồi 60oC 30 giây
4. Tổng hợp 72oC 1 phút
Từ bước 2-4 lặp lại 35 chu kỳ 5. 6. Kết thúc Bảo quản 72oC 4oC 10 phút ∞
- Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%.
Phương pháp PCR nhân đoạn gen chọn lọc (nptII) từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen
- Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen nptII có kích thước 700 bp, như sau: NPTII-F: 5’-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3’ và NPTII-R: 5’- ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3’.
Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen nptII:
Stt Thành phần Thể tích (µl)
1. H2O deion 19
2. 2X PCR mastermix 25
3. Prime 1: NPTII-F: 10 pM 2
4. Prime 2: NPTII-R: 10 pM 2
5. DNA sợi khuôn: 100ng/µl 2
Tổng thể tích 50
Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR nhân đoạn gen nptII:
Bước Nhiệt độ Thời gian
2. Biến tính 94oC 1 phút
3. Bắt mồi 62oC 30 giây
4. Tổng hợp 72oC 1 phút
Từ bước 2-4 lặp lại 35 chu kỳ 5. 6. Kết thúc Bảo quản 72oC 4oC 10 phút ∞
- Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Phương pháp PCR nhân đoạn trình tự khởi động – Promoter (35S) từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen
- Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn trình tự khởi động – Promoter (35S) có kích thước 123 bp, như sau: p35S-cf3: 5’- CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG-3’ và p35S-cr4: 5’- TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC-3’
Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn Promoter (35S):
Stt Thành phần Thể tích (µl)
1. H2O deion 19
2. 2X PCR mastermix 50
3. Prime 1: p35S-cf3: 10 pM 2
4. Prime 2: p35S-cr4: 10 pM 2
5. DNA sợi khuôn: 100 ng/µl 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổng thể tích 50
Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR nhân Promoter (35S):
Bước Nhiệt độ Thời gian
1. Biến tính 95oC 3 phút
2. Biến tính 95oC 30 giây
3. Bắt mồi 62oC 30 giây
4. Tổng hợp 72oC 45 giây
Từ bước 2-4 lặp lại 50 chu kỳ 5. 6. Kết thúc Bảo quản 72oC 4oC 7 phút ∞
- Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.
Phương pháp PCR nhân đoạn trình tự kết thúc -Terminator (NOS-t) từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen
- Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn trình tự kết thúc -Terminator (NOS-t) có kích thước 118 bp, như sau: HA-nos-f: 5’-GCATGACGTTATTTATGAGATGGG- 3’/HA-nos-r: 5’-GACACCGCGCGCGATAATTTATCC-3’.
Thành phần phản ứng PCR nhân Terminator (NOS-t):
Stt Thành phần Thể tích (µl)
1. H2O deion 19
2. 2X PCR mastermix 25
3. Prime 1: HA-nos-f: 10 pM 2
4. Prime 2: HA-nos-r: 10 pM 2
5. DNA sợi khuôn: 100 ng/µl 2
Tổng thể tích 50
Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR nhân Terminator (NOS-t):
Bước Nhiệt độ Thời gian
1. Biến tính 95oC 3 phút
2. Biến tính 95oC 30 giây
3. Bắt mồi 62oC 30 giây
4. Tổng hợp 72oC 45 giây
Từ bước 2-4 lặp lại 50 chu kỳ 5. 6. Kết thúc Bảo quản 72oC 4oC 7 phút ∞
- Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.
c) Kiểm tra các dòng cây bạch đàn urô chuyển gen bằng kỹ thuật lai southern.
Các cây Bạch đàn urô sau chuyển gen đã chọn lọc trên môi trường bổ sung kháng sinh kanamycin được kiểm tra sự có mặt của gen chuyển (gen GS1, gen
nptII) bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu. Các cây dương tính với phản ứng PCR được sử dụng cho phân tích southern blot. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tách chiết DNA tổng số (DNA genome)
DNA tổng số được tách đảm bảo độ tinh sạch cho phản ứng cắt enzyme giới hạn. Chúng tôi tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá bánh tẻ của các dòng bạch đàn urô bằng phương pháp tách chiết CTAB với đệm chiết có chứa PVP. Với kích thước genome bạch đàn cần khoảng 10 µg mẫu DNA tổng số để thực hiện phản ứng cắt enzyme giới hạn.
(1) Tách DNA tổng số: Nghiền 2 g lá bánh tẻ bạch đàn urô, chia vào 8 ống effendorft 2 ml (0,25 g mỗi ống). Thêm 0.75 ml dung dịch đệm chiết CTAB (100 mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 2% CTAB, 2% PVP), ủ 60 phút ở 65°C. Thêm 0,75 ml Chloroform, đảo đều, li tâm 12.000 rpm trong 15 phút, thu 700 µl dung dịch pha trên. Thêm 700 µl Isopropanol, ly tâm thu cặn DNA (12.000 rpm, 15 phút), làm khô cặn DNA. Hòa cặn vào 50 µl dung dịch TE.
(2) Tinh sạch cho phản ứng cắt: Gom DNA tổng số sau khi tách ở 8 ống vào 1 ống effendorft. Thêm 500 µl đệm TESC, đảo đều. Li tâm 6000 rpm trong 5 phút, thu cặn. Hòa cặn vào 500 µl đệm TES (100 mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 1M NaCl). Thêm 500 µl Isopropanol, li tâm thu cặn DNA. Rửa cặn bằng cồn 70°, làm khô DNA và hòa cặn DNA trong 40 µl nước deion có RNAse.
Cắt enzyme giới hạn:
Sử dụng 1u enzyme giới hạn cho mỗi µg mẫu DNA tổng số. Cắt qua đêm ở 37°C. Chúng tôi dùng enzyme HindIII.
STT Thành phần Thể tích cho phản ứng cắt 30 µl
1 Enzyme (10u/µl) 3 µl
2 Buffer (10x) 3 µl
3 DNA tổng số 30 µg
4 Nước deion Vừa đủ 30 µl
Điện di trên gel agarose
Điện di sản phẩm cắt DNA tổng số đã tinh sạch trên gel agarose 1%, ở điện thế thấp trong thời gian dài (6h). Chúng tôi đã bỏ qua bước nhuộm
Ethidium Bromide vì mức độ độc hại. Sau đó xử lý với dung dịch HCl 0,25M trong 10 phút và ngâm vào dung dịch chuyển màng.
Chuyển DNA lên màng lai
Phương pháp chuyển màng bằng dung dịch kiềm có ưu điểm là thời gian chuyển màng nhanh, đơn giản, mẫu DNA tự liên kết với màng trong quá trình chuyển màng. Màng lai được cắt vừa với bản gel và đặt dưới bản gel, một cột giấy được đặt phía dưới nhằm tạo áp lực thẩm thấu trong khi dung dịch chuyển màng thấm truyền từ trên thông qua các tấm giấy lọc được cấp từ khay đựng buffer. Quá trình chuyển màng hoàn tất sau 3h với bản gel dày dưới 5mm, hoặc qua đêm. Sau khi chuyển màng, màng lai được rửa với dung dịch 2X SSC và tiến hành lai với mẫu dò.
Tổng hợp mẫu dò (probe)
Bước 1: Nhân dòng trình tự gen npII từ plasmid pBI121 mang gen nptII bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu (NPTII-F: 5’-G A G G C T A T T C G G C T A T G A C T G-3’ và NPTII-R: 5’-A T C G G G A G C G G C G A T A C C G T A-3’). Thành phần chạy PCR và chu kỳ PCR như mục 2.5.2.2b: Mẫu PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp mẫu dò theo hướng dẫn của bộ Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit.
Tiền lai và lai
Màng lai được cố định bằng dung dịch tiền lai (200µl/cm2) trong 4h ở 44°C trong ống lai. Đổ bỏ dung dịch tiền lai. Bổ sung dung dịch lai (60µl/cm2), lai qua đêm ở 44°C.
Rửa màng lai loại bỏ mẫu dò thừa
Màng lai được rửa 2 lần với đệm rửa 2x ở nhiệt độ phòng, 1 lần với đệm rửa 1X 65°C – 15 phút, 2 lần với đệm rửa 0.1x, 65°C – 15 phút.
Hiện màng
Phức hợp enzyme Streptavidin-AP có khả năng gắn bám đặc hiệu với gốc biotin trên mẫu dò. Ngoài ra, enzyme Alkaline phosphatase có khả năng phân hủy , BCIP-T (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, p-toluidine salt) thành hợp chất có màu tím đen. Nhờ vậy có thể phát hiện mẫu dò gắn với đoạn
DNA cần nghiên cứu trên màng lai. Quy trình này được thực hiên theo hướng dẫn của bộ kit Biotin Chromogenic Detection Kit (hãng Themosience).
2.3.2.3. Các chỉ tiêu theo dõi
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại; các bình thí nghiệm được đặt trong tủ tối hoặc trên giàn đèn có cường độ ánh sáng 2.000lux, chu kỳ 16h sáng và 8 h tối tùy theo thí nghiệm. Nhiệt độ phòng nuôi cấy điều chỉnh ở mức 25 ± 20C. Số liệu được thu thập, xử lý tính toán bằng phần mềm Excel.
- Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo = x 100% - Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi = x 100%
- Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi = x 100%
Chương 3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN