Muốn chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn A. tumefaciens thì trước tiên phải tạo được vật liệu thực vật sạch in vitro. Đây là giai đoạn đầu tiên có vai trò quan trọng nhằm cung cấp cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình chuyển gen. Yêu cầu của giai đoạn này là tỷ lệ hạt nảy mầm cao và tỷ lệ mẫu sạch cao. Để đáp ứng được như trên thì các hạt lấy từ ngoài môi trường tự nhiên cần được làm sạch nguồn vi sinh vật trước khi đưa chúng vào môi trường nuôi cấy. Hạt được sát khuẩn bằng 70% (v/v) cồn trong thời gian 1 phút, để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, đồng thời bảo vệ mô thực vật và tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.
Hình 3.9. Tạo nguồn vật liệu chuyển gen. A: hạt bạch đàn khử trùng được gieo trên môi trường MS; B: hạt bạch đàn nảy mầm thành cây trên môi trường MS
sau 7 - 8 ngày nuôi cấy.
Kết quả cho thấy hạt Bạch đàn urô được khử trùng và gieo vào môi trường với tỷ lệ mẫu sạch 97%, tỷ lệ nảy mầm nảy mầm đạt khoảng 95% đáp ứng nguồn nguyên vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
Ngay trong cùng chi bạch đàn thì vật liệu sử dụng thích hợp cho chuyển gen cũng khá khác nhau (lá mầm, trụ dưới lá mầm, thân thật, chồi đỉnh, chồi sơ cấp, lá non). Trong đó hai loại vật liệu được sử dụng phổ biến nhất là lá mầm và trụ dưới lá mầm hoặc cả hai loại này (Tournier và cs, 2003; Tibok, 1990; Quisen, 2007; Dibax và cs, 2010; Sarotoretto và cs, 2002; Gonzalez và cs, 2002; Chang và cs, 2006; Ho và cs, 1998; Prakash và Gurumurthi, 2009). Hạt sau khi nuôi cấy 7 - 8 ngày trên môi trường MS phát triển thành cây mầm. Các lá mầm và thân mầm được cắt thành những mảnh nhỏ cấy lên các công thức môi trường tiền nuôi cấy Pre-T và Pre-L.
Hình 3.10. Thân mầm và lá mầm trên môi trường tiền nuôi cấy. A: Thân mầm bạch đàn trên môi trường tiền nuôi cấy Pre-T; B: Mảnh lá mầm bạch đàn trên
môi trường tiền nuôi cấy Pre-L.
Mẫu thân mầm bạch đàn được cắt thành đoạn có kích thước 0,5cm và lá mầm được cắt có đoạn cuống lá. Ở thí nghiệm này chúng tôi tiến hành biến nạp ngẫu nhiên 5 lô thí nghiệm, tổng số mẫu sử dụng là 1100 mẫu thân mầm và 900 mẫu lá mần. Mẫu bạch đàn được nuôi cảm ứng trên môi trường Pre-T và Pre-L trong tối 2 ngày. Thời gian tiền nuôi cấy là khoảng thời gian mà mẫu cấy được nuôi cấy trên môi trường tái sinh trước khi tiến hành quá trình lây nhiễm vi khuẩn, trong thời gian này các tế bào, mô diễn ra quá trình phân chia mạnh mẽ. Vi khuẩn A. tumefaciens có khả năng chuyển gen tốt hơn đối với các tế bào, mô đang phân chia.
Sau khi nuôi cảm ứng đoạn thân mầm và lá mầm 2 ngày trên môi trường tiền nuôi cấy tiến hành biến nạp đoạn gen GS1 nhờ chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector chuyển gen. Bản chất của vi khuẩn A. tumefaciens là loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật, nên sự tồn tại phát triển với khoảng thời gian dài sẽ có tác dụng không mong muốn đến sự sống, phát triển và phát sinh hình thái của mẫu sau này. Nhưng nếu khoảng thời gian này quá ngắn thì sự xâm nhiễm chưa kịp diễn ra, giảm sự biến nạp gen và hiệu quả chuyển gen sẽ thấp. Thời gian đồng nuôi cấy mẫu là khoảng thời gian mà mẫu cấy đã lây nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens được nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy, môi trường này vừa chứa các chất cần thiết cho mô, tế bào thực vật sinh trưởng, phát triển lại vừa chứa các yếu tố kích thích sự sinh trưởng, phát triển và xâm nhiễm của vi khuẩn vào mô và tế bào thực vật. Theo các nghiên cứu từ trước khoảng thời gian đồng nuôi cấy thích hợp sẽ là 10 phút, đây là khoảng thời gian thích hợp sẽ tạo điều kiện cho vi
khuẩn xâm nhiễm và tiến hành quá trình chuyển gen vào mô thực vật, đồng thời sẽ giúp cho bước diệt khuẩn, phục hồi cũng như chọn lọc về sau được dễ dàng.Thân mầm và lá mầm bạch đàn được cho vào dịch huyển phù vi khuẩn với thời gian tối ưu là 10 phút, sau đó được thấm khô trên giấy thấm vô trùng, rồi cấy lên môi trường đồng nuôi cấy Co-T và Co-L, để trong tối 72 giờ.
Hình 3.11. Thân mầm và lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy. A: Thân mầm bạch đàn trên môi trường đồng nuôi cấy Co-T; B: Mảnh lá mầm bạch đàn trên
môi trường đồng nuôi cấy Co-L.
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu được rửa sạch vi khuẩn bằng dung dịch cefotaxime 400mg/l, thấm khô và cấy chuyển sang môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime 400mg/l. Bước rửa khuẩn đảm bảo cho mẫu cấy không bị nhiễm lại khuẩn A.tumefaciens, nếu bước rửa khuẩn không đảm bảo đã rửa sạch khuẩn thì vi khuẩn sẽ phát triển cùng với mẫu cấy trên môi trường chọn lọc với mật độ cao và mẫu cấy sẽ bị vi khuẩn làm đen và chết, mẫu cấy không có khả năng phát triển trên môi trường chọn lọc. Đồng thời, sau khi rửa khuẩn cần tiến hành chuyển mẫu biến nạp lên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime 400 mg/l, đây là bước hoạt hóa đảm bảo cho mẫu cấy thích ứng với điều kiện nuôi cấy. Nếu chuyển luôn mẫu cấy lên môi trường có bổ sung chất chọn lọc kanamycin 150mg/l mẫu cấy không có thời gian thích ứng sẽ làm cho mẫu cấy bị chết khi cho ngay lên môi trường kháng sinh có nồng độ cao.
A B
Hình 3.12. Mẫu bạch đàn trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn. A: Mẫu thân mầm bạch đàn trên môi trường Aft-T; B: Mẫu lá mầm bạch
đàn trên môi trường Aft-L.
Sau biến nạp, mẫu cấy được nuôi cấy 4 ngày trên môi trường tái sinh (hình 3.12) có những mô đã được tạo sẹo ở hai đầu bị tổn thương đối với mẫu cấy là đoạn thân mầm và tại cuống lá đối với mẫu biến nạp là đoạn lá mầm. Mẫu cấy không bị nhiễm đảm bảo cho các thí nghiệm ở các bước chọn lọc trên chồi nuôi cấy trên môi trường có kháng sinh chọn lọc ở các bước tiếp theo.
Quy trình chuyển gen vào Bạch đàn urô đã được Bùi Văn Thắng và cộng sự thiết lập (chưa công bố). Theo quy trình này trước khi chuyển mẫu sang môi trường chọn lọc, các mẫu nuôi cấy đã được nuôi trên môi trường tái sinh 4 ngày để phục hồi. Đối với mẫu nuôi cấy là thân mầm khả năng tạo sẹo cao hơn so với mẫu nuôi cấy là lá mầm.
Do đoạn T-DNA chuyển gen GS1, cấu trúc chuyển có mang gen kháng kanamycin, nên các môi trường sau biến nạp đều được bổ sung 150mg/l kanamycin để sàng lọc thể nhận gen GS1. Trong nghiên cứu này, kết quả là các mẫu thân mầm và lá mầm sống sót trên môi trường chọn lọc có chứa kanamycin.
Thí nghiệm chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô được lặp lại 5 lần. Sau khi chuyển sang môi trường chọn lọc nuôi khoảng 21-24 ngày, các mẫu thân mầm và lá mầm sống sót và xuất hiện mô sẹo tại các vị trí bị tổn thương và tại các vị trí tổn thương cũng có thể đã xuất hiện các chồi nhỏ. Theo như nghiên cứu trước về quá trình tái sinh cây bạch đàn, đây là tiền đề cho việc tái sinh chồi. Sau khoảng 21-24 ngày tiếp theo các cụm chồi sẽ được chuyển sang môi trường CL-T150 và CL-L150, các chồi có chiều cao khoảng 2-3cm được cắt chuyển sang môi trường chọn lọc ra rễ RR75
Song song với thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm đối chứng được thiết lập bằng cách đặt các mẫu thân mầm và lá mầm trực tiếp lên môi trường CL- T150 và CL-L150. Toàn bộ các mảnh lá mầm và thân mầm không chuyển gen được đặt lên môi trường có bổ sung kháng sinh đều đen dần và chết.
Bảng 3.3. Kết quả chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô CTTN Tên mẫu Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo sẹo Tỷ lệ (%) Số mẫu tạo đa chồi Tỷ lệ (%) Chồi tạo thành Chồi ra rễ Tỷ lệ (%) Mẫu biến nạp lá mầm 900 550 61,1 35 3,9 41 21 51,2 thân mầm 1100 800 72,7 80 7,3 55 29 52,7 Đ/C (wt) lá mầm 50 20 33,3 - - - - - thân mầm 60 30 50,0 - - - - -
Sau khi mẫu bạch đàn được nuôi cấy trên môi trường tái sinh 4 ngày được chuyển lên môi trường chọn lọc. Sau 3 tuần nuôi cấy, sẽ có những mô, tế bào thực vật bị hóa nâu hay bạch tạng không phát triển rồi chết trên môi trường có bổ sung chất kháng sinh (hình 3.13 và 3.14). Giải thích hiện tượng này là do các mô tế bào này không mang gen ngoại lai nptII. Do đó, trên môi trường nuôi cấy bổ sung kanamycin làm mất sức sống và khả năng phát triển của mẫu. Còn các mẫu sống sót được trên môi trường có chứa kháng sinh là do tế bào đã mang gen ngoại lai nptII được điều khiển bởi NOS-promoter. Khi promoter hoạt động, gen nptII sẽ mã hóa cho enzyme Neomycin phosphotrans- ferase II làm mất hoạt tính kanamycin nên mô thực vật vẫn phát triển tốt. Tác dụng gây độc của kanamycin đối với mô bạch đàn đã được ghi nhận trên đối tượng E. grandis (Gonzalez và cs, 2002), E.camadulensis (Quisen và cs, 2009).
Hình 3.13. Quá trình sàng lọc thể nhận gen của đoạn thân mầm. A: đoạn thân mầm khi trước khi chuyển lên môi trường chọn lọc; B: đoạn thân mầm trên môi
trường chọn lọc sau 3 tuần nuôi cấy.
Hình 3.14. Quá trình sàng lọc thể nhận gen của mảnh lá mầm. A: mảnh lá mầm trước khi chuyển lên môi trường chọn lọc; B: mảnh lá mầm trên môi trường
chọn lọc sau 3 tuần nuôi cấy.
Mẫu biến nạp sống sót trên môi trường chọn lọc là điều kiện tiên quyết quyết định đến hiệu quả chuyển gen. Mẫu cấy sống sót trên môi trường có chất chọn lọc kanamycin với nồng độ thích hợp đảm bảo cho mẫu chuyển gen sống sót trên môi trường chọn lọc nghiêm ngặt.
Kết quả nghiên cứu, theo bảng 3.3 đã chỉ ra rằng hiệu quả biến nạp ở đoạn thân mầm có cao hơn so với lá mầm. Khả năng sống sót tạo sẹo ở thân mầm là 72,7%, lá mầm là 61,1% và tạo cụm chồi ở đoạn thân mầm là 7,3% cao hơn so với ở lá mầm là 3,9%. Sau 3 tuần chọn lọc trên môi trường chọn lọc tiếp tục chuyển những đoạn thân mầm và lá mầm đã tạo cụm chồi lên môi trường chọn lọc lần 2, sau 3 tuần các cụm chồi phát triển có chiều cao khoảng 1,5-2cm (hình 3.15) được cắt chuyển sang môi trường ra rễ có bổ sung kháng sinh chọn lọc.
A B (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.15. Chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc từ mẫu thân mầm và lá mầm sau 6 tuần nuôi cấy. A: chồi phát triển từ đoạn thân mầm; B: chồi phát triển từ
mảnh lá mầm.
Các điều kiện nuôi cấy tối ưu và mẫu biến nạp được chọn lọc nghiêm ngặt bởi chất chọn lọc kanamycin, những cụm chồi được hình thành trên môi trường chọn lọc bước đầu khẳng định mang gen ngoại lai GS1, đảm bảo cho thí nghiệm chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường ra rễ.
Các chồi tái sinh từ thể nhận gen là mảnh lá mầm và đoạn thân trên môi trường chọn lọc có 150 mg/l kanamycin tiếp tục được sàng lọc trên môi trường ra rễ chọn lọc có 75 mg/l kanamycin. Đồng thời chồi Bạch đàn urô không chuyển gen (wt) cũng được nuôi cấy trên môi trường ra rễ chọn lọc có 75 mg/l kanamycin làm đối chứng.
Kết quả sau 2 lần cấy chuyển trên môi trường ra rễ chọn lọc có 75 mg/l kanamycin, kết quả thống kê thu được như bảng 3.3 cho thấy rằng, từ 900 thể nhận gen là mảnh lá mầm chuyển gen GS1 thu được 41 chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc 150 mg/l kanamycin nhưng chỉ thu được 21/41 chồi ra rễ trên môi trường chọn lọc có 75 mg/l kanamycin. Kết quả tương tự ở đoạn thân mầm từ từ 1100 thể nhận gen là mảnh lá mầm chuyển gen GS1 thu được 55 chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc 150mg/l kanamycin nhưng chỉ thu được 29/55 chồi ra rễ trên môi trường chọn lọc có 75 mg/l kanamycin. Ngược lai, các chồi Bạch đàn urô không chuyển gen (wt) không có khả năng ra rễ trên môi trường chọn lọc sau 3 tuần nuôi cấy chồi vàng và chết (hình 3.16).
Hình 3.16. Chồi Bạch đàn urô sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường ra rễ. A: Chồi đối chứng không chuyển gen (wt) trên môi trường ra rễ không bổ sung
kanamycin; B: Chồi chuyển gen trên môi trường ra rễ bổ sung 75 mg/l kanamycin; C. Chồi đối chứng không chuyển gen (wt) trên môi trường ra rễ bổ sung 75 mg/l kanamycin.
Các cây ra rễ được huấn luyện và đưa ra trồng trong bầu đất (hình 3.17 và 3.18), cây được 3 tháng tuổi ra lá mới được cắt để tách chiết DNA tổng số làm khuôn cho phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu.
Hình 3.17. Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng trong chậu đất 2 tuần tuổi.
Hình 3.18. Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng trong chậu đất 3 tháng tuổi.