Ứng dụng công nghệ enzyme để tách chiết và thu nhận collagen từ da cá tra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐỖ CAO CƯỜNG ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME ĐỂ TÁCH CHIẾT VÀ THU NHÂN COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Chuyên ngành Công nghệ sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS : KHUẤT HỮU THANH HÀ NỘI - 2010 MỤC LỤC PHẦN I - MỞ ĐẦU PHẦN II – TỔNG QUAN 11 2.1 PROTEIN VÀ CÁC KHÁI NIỆM 11 2.1.1 Thành phần nguyên tố protein 11 2.1.2 Cấu tạo phân tử protein 11 2.1.3 Phân loại Protein 12 2.1.4 Một số tính chất protein 12 2.1.4.1 Tính tan protein 12 2.1.4.2 Tính ngậm nước protein 13 2.1.4.3 Độ nhớt dung dịch protein 13 2.1.4.4 Hằng số điện môi dung dịch protein 13 2.1.4.5 Tính chất điện li protein 14 2.1.4.6 Sự kết muối dung dịch protein 15 2.1.4.7 Biểu quang học protein 15 2.1.4.8 Kết tủa thuận nghịch không thuận nghịch protein 15 2.1.4.9 Các phản ứng hóa học protein 16 2.1.4.10 Biến tính protein 16 2.2 KHÁI QUÁT VỀ COLLAGEN 18 2.2.1 Collagen lược sử nghiên cứu 18 2.2.2 Đại cương cấu trúc collagen 20 2.2.3 Phân loại collagen 24 2.2.4 Một số tính chất chủ yếu collagen 27 2.2.5 Sự phân bố collagen số loài động 28 2.2.5.1 Collagen động vật thủy sản 28 2.2.5.2 Collagen từ loài động vật thân mềm 31 2.2.5.3 Collagen từ loài gia súc , gia cầm 32 2.2.6 Vai trò collagen thể động vật người 33 2.2.6.1 Ý nghĩa collagen sinh vật sống người 33 2.2.6.2 Các dạng tồn collagen thể 34 2.2.7 Ứng dụng collagen 37 2.2.7.1 Trong công nghiệp 37 2.2.7.2 Ứng dụng y học dược phẩm 39 2.2.8 Tiềm nguyên liệu sản xuất collagen từ da cá Việt Nam 41 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH PROTEIN (COLLAGEN) 42 2.3.1 Các biện pháp cần thiết để nhận protein nguyên thể 42 2.3.1.1 Nhiệt độ 43 2.3.1.2 Nồng độ proton (pH) 43 2.3.1.3 Tác nhân hóa học 43 2.3.2 Phá vỡ tế bào chiết rút protein 43 2.3.2.1 Phá vỡ tế bào 43 2.3.2.2 Tách chiết protein 43 2.3.3 Tinh protein 43 2.3.3.1 Loại tạp chất 43 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 2.3.3.2 Các kỹ thuật thu nhận tinh protein 44 2.4 MỘT SỐ KỸ THUẬT TÁCH VÀ TINH SẠCH COLLAGEN 47 2.4.1 Phương pháp tách chiết thu nhận collagen 47 2.4.2 Một số quy trình tách chiết collagen thường sử dụng 49 2.4.2.1 Quy trình tách chiết collagen từ cá da trơn 49 2.4.2.2 Tách chiết collagen từ thịt cá chép, cá hồi (1986) 50 2.4.2.3 Tách chiết collagen từ thịt cá chép (1987) 51 2.4.2.4 Tách chiết collagen từ vẩy cá 51 2.4.2.5 Tách chiết collagen từ cá rô phi song Nile (cá Tilapia) 52 2.4.2.6 Quy trình tách chiết collagen từ da lợn 53 2.4.2.7 Quy trình tách chiết collagen từ xương gà 53 2.4.2.8 Quy trình tách chiết collagen từ xương trâu bò 54 PHẦN III – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .55 3.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 55 3.2 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT SỬ DỤNG 55 3.2.1 Thiết bị 55 3.2.2 dụng cụ 56 3.2.3 Hóa chất 56 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 58 3.3.1 Sơ chế nguyên liệu 58 3.3.2 Tách mỡ 58 3.3.3 Thủy phân protein 59 3.3.4 Thu nhận collagen 59 3.3.5 Xác đinh kết 60 3.3.6 Xây dựng sơ đồ công nghệ: .63 PHẦN IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .64 4.1.THU THẬP MẪU CÁ TRA 64 4.2.TÁCH MỠ 65 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian xử lý (ngâm) mẫu với NaOH 0.1M đến tỷ lệ mỡ bị loại 65 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NaOH đến khả loại mỡ 67 4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian xử lý (ngâm) mẫu C2H5OH 96% (cồn 960) đến khả loại mỡ 69 4.3 THỦY PHÂN VÀ THU NHẬN 71 4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân da cá tra CH3COOH 0.5M 71 4.3.2 Nghiên cứu thủy phân da cá tra CH3COOH 0.5M có bổ sung enzyme 73 4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian thủy phân da cá Tra CH3COOH 0.5M có bổ sung enzyme pepsin 76 4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CH3COOH đến trình thủy phân da cá tra có bổ sung enzyme pepsin 79 4.4 NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NaCl ĐẾN HIỆU SUẤT THU HỒI COLLAGEN TRONG DUNG DỊCH 81 4.5 NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN CHẾ PHẨM CÁ TRA ĐẾN HIỆU SUẤT TÁCH CHIẾT COLLAGEN 82 LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 4.6 KIỂM TRA SẢN PHẨM COLLAGEN: 86 PHẦN V - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU pHi hay pI (isoeletric-điểm đẳng điện): Điểm đẳng điện protein OD (Optical Density): mật độ quang CRP (collagen related peptide) : mối liên kết peptide collagen TEM (Transmission electron microscopy): kỹ thuật kính hiển vi điện tử AFM (Atomic force microscopy): kính hiển vi lượng nguyên tử RER (rough Endoplasmic Reticulum ): màng lưới nội chất FACIT (Fibril associated collagen with interrupted triple helices) MACIT ( Membranne asociated collagen with interrupted triple helices) BSE (bovine spongiform encephalopathy): bệnh bò điên RCF(relative centrifugal force): lực ly tâm ATP (adenosin triphosphat): phân tử mang lượng AND hay DNA (deoxyribonucleic axit) RNA (Ribonucleic axit) SDS PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis): kỹ thuật điện di gel polyacrylamide PTC : phenylisothyocyanate HPLC (high performance liquid chromatography): kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao MS (mass-spectrometry): Phương pháp khối phổ Gly: Glycine Pro: Proline Hyp: Hydroxyproline Ala: Alanine LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hàm lượng nguyên tố protein 11 Bảng 2.2 Độ nhớt số protein .13 Bảng 2.3 Giá trị pHi số protein 14 Bảng 2.4 Bảng phân loại collagen 27 Bảng 2.5 Bảng axit amin thành phần collagen cá hồi .29 Bảng 2.6 Bảng tính ước tính doanh thu 42 Bảng 3.1 Bảng pha chế gel cô gel tách 60 Bảng 4.1.1- Phân tích hàm lượng phụ phẩm từ cá tra 64 Bảng 4.2.1 – Tỷ lệ mỡ loại ngâm mẫu 8h .65 Bảng 4.2.2 – Tỷ lệ mỡ bị loại ngâm mẫu 10h 65 Bảng 4.2.3 – Tỷ lệ mỡ bị loại ngâm mẫu 12h 66 Bảng 4.2.4 – Tỷ lệ mỡ bị loại ngâm mẫu NaOH nồng độ 0.05M 67 Bảng 4.2.5 – Tỷ lệ mỡ bị loại ngâm mẫu NaOH nồng độ 0.2M 68 Bảng 4.2.6 – Tỷ lệ mỡ loại ngâm mẫu với C2H5OH 12h 69 Bảng 4.2.7 – Tỷ lệ mỡ loại ngâm mẫu với C2H5OH 18h 69 Bảng 4.2.8 – Tỷ lệ mỡ loại ngâm mẫu với C2H5OH 24h 70 Bảng 4.3.1 Tỷ lệ collagen thô thu thủy phân da cá 24h 72 Bảng 4.3.2 – Tỷ lệ collagen thô thu thủy phân da cá 48h .72 Bảng 4.3.3 – Tỷ lệ collagen thô thu thủy phân da cá 72h .72 Bảng 4.3.4 – Tỷ lệ collagen thô thu thủy phân da cá CH3COOH 0.5M có bổ sung Papain .74 Bảng 4.3.5 – Tỷ lệ collagen thô thu thủy phân da cá CH3COOH 0.5M có bổ sung Pepsin 74 Bảng 4.3.6 – Tỷ lệ collagen thô thu thủy phân da cá CH3COOH 0.5M có bổ sung endo protease 75 Bảng 4.3.7 – Tỷ lệ collagen thô thu thủy phân da cá CH3COOH 0.5M có bổ sung Flavourzyme 75 LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bảng 4.3.8 – Tỷ lệ collagen thô thu thủy phân da cá CH3COOH 0.5M có bổ sung pepsin 12h 77 Bảng 4.3.9 – Tỷ lệ collagen thô thu thủy phân da cá CH3COOH 0.5M có bổ sung pepsin 24h: 77 Bảng 4.3.10 – Tỷ lệ collagen thô thu thủy phân da cá CH3COOH 0.5M có bổ sung pepsin 72h 78 Bảng 4.3.11 – Tỷ lệ collagen thu thủy phân da cá CH3COOH 0.3M có bổ sung pepsin 24h 79 Bảng 4.3.12 – Tỷ lệ collagen thu thủy phân da cá CH3COOH 0.4M có bổ sung pepsin 24h 80 Bảng 4.3.13 – Tỷ lệ collagen thu thủy phân da cá CH3COOH 0.6M có bổ sung pepsin 24h 80 Bảng 4.4.1 – Tỷ lệ collagen thu kết tủa dịch thủy phân NaCl: .82 Bảng 4.5.1 – Tỷ lệ collagen thu sử dụng da cá bảo quản -200C 83 Bảng 4.5.2 – Tỷ lệ collagen thu sử dụng da cá bảo quản 00C 84 Bảng 4.5.3 – Tỷ lệ collagen thu sử dụng da cá bảo quản -200C từ nhà máy chế biến cá tra 84 Bảng 4.5.4 – Tỷ lệ collagen thu sử dụng da cá bảo quản -200C từ viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 85 Bảng 4.6 Lượng collagen thu sau đông khô 86 LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc liên kết xoắn ba collagen 19 Hình 2.2 Cấu trúc dạng sợi collagen 20 Hình 2.3 Cấu trúc soắn collagen 21 Hình 2.4 Cấu trúc vi sợi collagen .22 Hình 2.5 Cấu trúc bó sợi collagen .23 Hình 2.6 Sự hình thành collagen I .26 Hình 2.7 Cấu trúc da 35 Hình 2.8 Cấu tạo mắt 35 Hình 2.9 Hệ thống tiêu hóa .36 Hình 2.10 Collagen ứng dụng thực phẩm .38 Hình 2.11 Gelatin ứng dụng thực phẩm 38 Hình 2.12 ứng dụng collagen miếng dán vết thương 39 Hình 2.13 Ứng dụng collagen da nhân tạo .40 Hình 2.14 Đưa collagen vào hai thành niệu đạo .40 Hình 2.15 Kem dưỡng da collagen ; son môi collagen Gel collagen 41 Hình 2.16 Dầu gội đầu collagen; Sữa tắm collagen; tinh thể đắp mặt collagen 41 Hình 4.1.1 – Tỷ lệ % da cá thô nguyên liệu 64 Hình 4.2.1 - Ảnh hưởng thời gian đến tỷ lệ mỡ loại 67 Hình 3.1 Sơ đồ tách chiết collagen từ da cá 81 Hình 4.2.2 - Ảnh hưởng nồng độ NaOH đến tỷ lệ mỡ loại 68 Hình 4.2.3 - Ảnh hưởng thời gian đến tỷ lệ mỡ loại C2H5OH 70 Hình 4.3.1 - Ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân .73 Hình 4.3.2 Ảnh hưởng enzyme đến trình thủy phân .76 Hình 4.3.3 Ảnh hưởng thời gian thủy phân da cá tra CH3COOH 0.5M có bổ sung pepsin 78 Hình 4.3.4 Ảnh hưởng nồng độ CH3COOH đến trình thủy phân 81 Hình 4.4.1 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả kết tủa collagen 82 Hình 4.5.1 Ảnh hưởng phương pháp bảo quản đến hiệu suất tách chiết 85 LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hình 4.6.1 Kết điện di collagen tăng nồng độ 87 Hình 4.6.2 Collagen trước đông khô (có bổ sung endo protease (trái), pepsin (phải)) 87 Hình 4.6.3 Collagen thô đông khô 87 LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHẦN I - MỞ ĐẦU Trong năm đầu kỷ 21, giới chứng kiến nhiều thành tựu to lớn lĩnh vực khoa học kỹ thuật, đặc biệt ngành công nghệ sinh học Trong nghành công nghệ protein - enzyme đạt nhiều thành tựu đáng kể Và có xu hướng phát triển mạnh mẽ tương lai Trong công nghệ protein – enzyme việc nghiên cứu ứng dụng collagen khoa học đời sống ngày phát triển mạnh Collagen loại protein cấu trúc chiếm tới 30% tổng lượng protein thể Còn sống collagen có nhiều ứng dụng cho nghành y tế, công nghiệp thực phẩm, nghành công nghiệp mỹ phẩm… Thấy khả ứng dụng cao collagen sống nên giới xuất nhiều nghiên cứu để tăng khả chiết xuất collagen từ nhiều nguồn nguyên liệu khác Trong thể động vật chúng chiếm 30% tổng lượng protein tồn chủ yếu phận như: răng, tóc, xương, da, gân, sụn vách Trên thị trường giới sản phẩm collagen sử dụng ứng dụng nhiều sống Nhưng thị trường Việt Nam collagen biết đến qua sản phẩm mỹ phẩm nhập từ nước số công ty lớn Việt Nam nhập collagen từ nước để đưa vào sản xuất Hầu tất loại mỹ phẩm có chứa collagen protein chiết xuất từ loài gia súc, gia cầm Trong mỹ phẩm dựa collagen từ protein loài gia súc, gia cầm có tỷ lệ hấp thụ thấp cho da người đặc biệt dễ bị ảnh hưởng từ bệnh mà động vật mắc phải như: bệnh bò điên, bệnh liên quan đến hệ thần kinh xương khớp Để khắc phục vấn đề hấp thụ này, collagen chiết xuất từ cá thay Vì collagen từ cá có nhiều ưu điểm tốt mặt mỹ phẩm dược tính Collagen từ cá hấp thụ hoàn toàn da người [37] Việt Nam với điều kiện thuận lợi địa lý, năm gần ngành thủy hải sản nước ta phát triển mạnh mẽ, sản phẩm thủy hải sản xuất đứng thứ giới Trong sản phẩm cá tra, cá basa chiếm tỷ lệ lớn Sản phẩm LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bảng 4.3.10 – Tỷ lệ collagen thô thu thủy phân da cá CH3COOH 0.5M có bổ sung pepsin 72h STT TỔNG Mẫu (g) 10.25 10.25 10.15 10.00 10.20 10.05 60.90 collagen 1.25 1.35 1.2 1.1 1.3 1.15 7.35 Tỷ lệ (%) 12.20 13.17 11.82 11.00 12.75 11.44 12.07 Từ số liệu bảng 4.3.10 cho cho thấy sau thủy phân 60.9g mẫu da cá CH3COOH 0.5M có bổ sung enzyme pepsin 72h thu 7.35g collagen, đạt tỷ lệ 12.07% Kết nghiên cứu bảng 4.3.5 ; bảng 4.3.8 ; bảng 4.3.9; bảng 4.3.10 cho thấy tỷ lệ % collagen thu thủy phân da cá tra CH3COOH 0.5M có bổ sung enzyme pepsin theo khoảng thời gian khác cho kết khác nhau: Xử lý 12h cho hiệu thấp (9.16%); xử lý 24h, 48h, 72h cho hiệu tương đương (12.07%, 12.08%, 12.07%) ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN ĐẾN QUA TRÌNH THỦY PHÂN BẰNG CH3COOH 0.5M 12.07 60.00 50.00 40.00 30.00 12.07 60.60 14.00 12.00 9.16 10.00 60.85 60.50 20.00 10.00 12.08 7.35 7.30 5.55 8.00 6.00 60.90 7.35 4.00 Tỷ lệ (%) Khối lượng (g) 70.00 2.00 0.00 0.00 12h 24h Mẫu (g) 48h Collagen (g) 72h Tỷ lệ (%) Hình 4.3.3 Ảnh hưởng thời gian thủy phân da cá tra CH3COOH 0.5M có bổ sung pepsin LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 78 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Dựa vào số liệu thu cho thấy trình thủy phân da cá tra CH3COOH 0.5M có bổ sung enzyme pepsin với tỷ lệ (1g da : 0.1ml enzyme pepsin 10%) thời gian 12h có tỷ lệ collagen thu thấp Trong lượng collagen thu khoảng thời gian 24h, 48h, 72h sự thay đổi nhiều ( Biểu đồ 4.3.3) Qua thấy thời gian thủy phân 24h hiệu Từ kết chọn giải pháp thủy phân da cá Tra CH3COOH 0.5M có bổ sung enzyme pepsin với tỷ lệ (1g da : 0.1ml enzyme pepsin 10%) thời gian 24h để tiến hành thí nghiệm 4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CH3COOH đến trình thủy phân da cá tra có bổ sung enzyme pepsin Sau da cá loại mỡ tiến hành thủy phân CH3COOH có bổ sung enzyme pepsin theo tỷ lệ (1g da : 0.1ml enzyme pepsin 10%) thời gian 24h với nồng độ khác CH3COOH là: 0.3M ; 0.4M ; 0.5M ; 0.6M Bảng 4.3.11 – Tỷ lệ collagen thu thủy phân da cá CH3COOH 0.3M có bổ sung pepsin 24h STT TỔNG Mẫu (g) 10.20 10.05 10.00 10.15 10.10 10.05 60.55 collagen(g) Tỷ lệ (%) 0.95 9.31 0.85 8.46 0.85 8.50 0.9 8.87 0.85 8.42 0.85 8.46 5.25 8.67 Từ bảng 4.3.11 cho thấy sau thủy phân 60.55g mẫu da cá CH3COOH 0.3M có bổ sung enzyme pepsin 24h thu 5.25g collagen, đạt tỷ lệ 8.67% LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 79 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bảng 4.3.12 – Tỷ lệ collagen thu thủy phân da cá CH3COOH 0.4M có bổ sung pepsin 24h STT TỔNG Mẫu (g) 10.15 10.20 10.05 10.20 10.00 10.15 60.75 collagen (g) 1.05 1.1 0.95 1.15 0.95 1.1 6.30 Tỷ lệ (%) 10.34 10.78 9.45 11.27 9.50 10.84 10.37 Từ bảng 4.3.12 cho thấy sau thủy phân 60.75g mẫu da cá CH3COOH 0.4M có bổ sung enzyme pepsin 24h thu 6.3g collagen, đạt tỷ lệ 10.37% Bảng 4.3.13 – Tỷ lệ collagen thu thủy phân da cá CH3COOH 0.6M có bổ sung pepsin 24h STT TỔNG Mẫu (g) collagen(g) Tỷ lệ (%) 10.00 1.15 11.50 10.20 1.35 13.24 10.00 1.15 11.50 10.05 1.2 11.94 10.15 1.25 12.32 10.15 1.2 11.82 60.55 7.30 12.06 Từ bảng 4.3.13 cho thấy sau thủy phân 60.55g mẫu da cá CH3COOH 0.6M có bổ sung enzyme pepsin 24h thu 7.3g collagen, đạt tỷ lệ 12.06% Từ kết bảng 4.3.9 ; bảng 4.3.11 ; bảng 4.3.12; bảng 4.3.13 cho thấy tỷ lệ % collagen thu thủy phân da cá tra CH3COOH có bổ sung enzyme pepsin 24h với nồng độ CH3COOH khác là: 0.3M ; 0.4M ; 0.5M; 0.6M thể qua biểu đồ 4.3.4: LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 80 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CH3COOH ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN 12.07 60.00 50.00 40.00 30.00 10.00 60.75 60.55 14.00 12.00 8.67 20.00 10.00 12.06 10.37 60.50 7.30 6.30 5.25 8.00 6.00 60.55 7.30 0.00 4.00 Tỷ lệ (%) Khối lượng (g) 70.00 2.00 0.00 0.3 M 0.4 M Mẫu (g) 0.5 M Collagen (g) 0.6 M Tỷ lệ (%) Hình 4.3.4 Ảnh hưởng nồng độ CH3COOH đến trình thủy phân Qua biểu đồ (Hình 4.3.4) cho thấy tăng nồng độ CH3COOH tỷ lệ % collagen thu tăng Trong nồng độ CH3COOH 0.5M 0.6M có tỷ lệ % collagen thu chênh lệch không nhiều Qua cho thấy thủy phân da cá CH3COOH nồng độ 0.5M thích hợp Từ kết chọn giải pháp thủy phân da cá CH3COOH 0.5M có bổ sung enzyme pepsin thời gian 24h Kết phù hợp với nghiên cứu trước [22], [20] Kết luận: Khi thủy phân CH3COOH 0.5M theo tỷ lệ (1g da: 15ml CH3COOH) có bổ sung enzyme pepsin 10% theo tỷ lệ (1g da : 0.1ml enzyme) thời gian 24h hiệu suất collagen thu lớn 4.4 NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NaCl ĐẾN HIỆU SUẤT THU HỒI COLLAGEN TRONG DUNG DỊCH Sau da cá thủy phân , lọc thu dịch, phần dịch thu tiến hành kết tủa tinh thể NaCl đến nồng độ sau: 1.5M, 2M, 2.5M, 2.6M, 3M, 4M LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 81 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bảng 4.4.1 – Tỷ lệ collagen thu kết tủa dịch thủy phân NaCl: STT NaCl (M) collagen (g) 1.5 2.5 12.07 12 12 Từ kết ta có biểu đồ (4.4.1): LƯỢNG COLLAGEN (g) ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NaCl ĐẾN KHẢ NĂNG KẾT TỦA COLLAGEN 13 12 11 10 12.07 12 12 collagen (g) 1.5 2.5 NỒNG ĐỘ NaCl (M) Hình 4.4.1 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả kết tủa collagen Từ biểu đồ kết thí nghiệm cho thấy nồng độ NaCl tăng lượng Kết tủa tăng theo nồng độ NaCl đạt đến 2.5M lượng kết tủa thu lớn Vì chọn nồng độ NaCl 2.5M để kết tủa collagen 4.5 NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN CHẾ PHẨM CÁ TRA ĐẾN HIỆU SUẤT TÁCH CHIẾT COLLAGEN Áp dụng quy trình nghiên cứu loại mẫu da cá bảo quản theo cách khác nhau: LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 82 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Cá tra mua nguyên từ chợ Cầu Gỗ - Hoàn kiếm – Hà Nội, sơ chế phòng thí nghiệm Vi sinh – Kỹ thuật di truyền, Khoa CNSH – CNTP, ĐH Bách Khoa Hà Nội: + Da cá rửa nước lạnh - 70C, sử dụng ngay.(M1) + Da cá đem bảo quản đông lạnh -200C tuần (M2) + Da cá đem bảo quản lạnh (tủ đá thường 00C tuần) (M3) - Da cá mua từ nhà máy chế biến cá tra (Cần Thơ) bên Trung tâm kiểm nghiệm VSATTP vùng Cần Thơ cung cấp Da lọc riêng bảo quản đông lạnh (-200C) tuần trước sử dụng nghiên cứu (M4) - Da cá tra loại mỡ bảo quản đông lạnh bên Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II – TP Hồ Chí Minh cung cấp Bảo quản (-200C) tuần trước sử dụng nghiên cứu (M5) Tỷ lệ collagen thu sử dụng da cá tươi (M1) Từ kết bảng 4.3.9: STT Mẫu (g) 10.05 10.00 10.10 10.00 10.15 10.20 TỔNG 60.50 collagen (g) 1.2 1.25 1.2 1.1 1.25 1.3 7.30 Tỷ lệ (%) 11.94 12.50 11.88 11.00 12.32 12.75 12.07 Từ bảng 4.3.9 cho thấy sử dụng da cá tươi lượng collagen thu trung bình là: 7.3g collagen 60.5g da cá, tương ứng 12.07% Bảng 4.5.1 – Tỷ lệ collagen thu sử dụng da cá bảo quản -200C (M2): STT TỔNG Mẫu (g) 10.20 10.25 10.15 10.05 10.25 10.15 61.05 LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC collagen (g) 1.2 1.3 1.15 1.15 1.3 1.25 7.35 83 Tỷ lệ (%) 11.76 12.68 11.33 11.44 12.68 12.32 12.04 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Từ bảng 4.5.1 cho thấy sử dụng da cá sau bảo quản đông lạnh -200C tuần lượng collagen thu trung bình là: 7.35g collagen 60.05g da cá, tương ứng 12.04% Bảng 4.5.2 – Tỷ lệ collagen thu sử dụng da cá bảo quản 00C (M3): STT TỔNG Mẫu (g) collagen (g) Tỷ lệ (%) 10.25 1.2 11.71 10.20 1.2 11.76 10.10 1.2 11.88 10.25 1.25 12.20 10.00 1.15 11.50 10.05 1.2 11.94 60.85 7.20 11.83 Số liệu bảng 4.5.2 cho thấy sử dụng da cá sau bảo quản lạnh 00C tuần lượng collagen thu trung bình là: 7.2g collagen 60.85g da cá, tương ứng 11.83% Bảng 4.5.3 – Tỷ lệ collagen thu sử dụng da cá bảo quản -200C từ nhà máy chế biến cá tra (M4): STT TỔNG Mẫu (g) collagen (g) Tỷ lệ (%) 10.15 1.2 11.82 10.20 1.25 12.25 10.20 1.15 11.27 10.05 1.2 11.94 10.25 1.3 12.68 10.15 1.25 12.32 61.00 7.35 12.05 Từ bảng 4.5.3 cho thấy sử dụng da cá mua từ nhà máy chế biến cá tra bảo quản đông lạnh -200C tuần lượng collagen thu trung bình là: 7.35g collagen 61g da cá, tương ứng 12.05% LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 84 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bảng 4.5.4 – Tỷ lệ collagen thu sử dụng da cá bảo quản -200C từ viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản (M5) STT TỔNG Mẫu (g) 10.20 10.10 10.15 10.00 10.15 10.10 60.70 collagen (g) 1.25 1.2 1.2 1.15 1.25 1.25 7.30 Tỷ lệ (%) 12.25 11.88 11.82 11.50 12.32 12.38 12.03 Số liệu bảng 4.5.4 Cho thấy sử dụng da cá mua từ Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản bảo quản đông lạnh -200C tuần lượng collagen thu trung bình là: 7.3g collagen 60.7g da cá, tương ứng 12.03% Khối lượng (g) 70.00 60.00 50.00 12.07 61.05 60.50 40.00 30.00 20.00 10.00 12.05 12.04 60.85 61.00 12.03 60.70 11.83 7.30 7.35 7.20 7.35 7.30 0.00 M1 M2 Khối lượng mẫu (g) M3 M4 M5 lượng collagen (g) Tỷ lệ (%) 12.10 12.05 12.00 11.95 11.90 11.85 11.80 11.75 11.70 Tỷ lệ (%) ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BẢO QUẢN MẪU ĐẾN HIỆU QUẢ TÁCH CHIẾT COLLAGEN Hình 4.5.1 Ảnh hưởng phương pháp bảo quản đến hiệu suất tách chiết Căn vào kết nghiên cứu thu cho thấy sử dụng da cá bảo quản nhiệt độ -200C thời gian tuần hiệu suất trình tách chiết gần không bị ảnh hưởng LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 85 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 4.6 KIỂM TRA SẢN PHẨM COLLAGEN Sau thủy phân da cá CH3COOH 0.5M có bổ sung enzyme pepsin 10% thời gian 24h tiến hành lọc thu dịch thủy phân Dịch thủy phân tiến hành ly tâm, thẩm tích để thu collagen thô Trung bình 150ml dịch thủy phân sau ly tâm thu 25g collagen thô Sau collagen thô tiến hành đông khô Bảng 4.6 Lượng collagen thu sau đông khô pepsin Pflavourzyme papain endo protease Collagen trước đông khô (g) 24.5 14.9 17.2 15.2 Collagen sau đông khô (g) 7.35 4.45 5.45 4.75 Sản phẩm sau đông khô tiến hành kiểm tra kỹ thuật điện di: - Sản phẩm collagen thô đem chạy điện di gel polyacrylamide Bản gel thu phân tách tiểu phần protein (Hình 12) Giếng – Mẫu có bổ sung endo protease (tăng nồng độ lên lần) Giếng – Mẫu có bổ sung Papain (tăng nồng độ lên lần) Giếng – Mẫu có bổ sung Flavourzyme (tăng nồng độ lên lần) Giếng 4- Mẫu có bổ sun Pepsin (tăng nồng độ lên1 lần) Kết điện di cho thấy vạch khoảng α-1 α-2 rõ nét, theo tỷ lệ α-1: α2 2:1, khoảng kích thước từ 100 - 120kDal Tương đồng với mẫu collagen loai I Kết cho thấy sản phẩm thu từ da cá tra collagen loại Hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước [20, 21, 24] LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 86 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI M – Marker 250kDa; I – Collagen I – Mẫu bổ có sung endo protease – Mẫu có bổ sung Papain – Mẫu có bổ sung Flavourzyme – Mẫu có bổ sung Pepsin Hình 4.6.1 Kết điện di collagen tăng nồng độ Hình 4.6.2 Collagen trước đông khô ( bổ sung endo protease (trái), pepsin (phải)) Hình 4.6.3 Collagen thô đông khô LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 87 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHẦN V - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN: Tỷ lệ da cá thô thu từ nguyên liệu nguyên 6.88% Xây dựng quy trình tách chiết collagen từ da cá tra với thông số kỹ thuật: - Nhiệt độ bảo quản da cá tối ưu là: -200C - Trong điều kiện tách mỡ: + NaOH nồng độ 0.1M, tỷ lệ (1g mẫu : 10ml NaOH), thời gian xử lý : 10h + C2H5OH (96%) thời gian xử lý: 18h - Trong điều kiện tách chiết tinh sạch: + CH3COOH nồng độ 0.5M, tỷ lệ ( 1g mẫu: 15ml CH3COOH) + Pepsin 10% tỷ lệ (1g mẫu : 0.1ml enzyme) + thời gian : 24h + Nồng độ NaCl: 2.5M Sử dụng kết hợp enzyme axit axetic (CH3COOH) thủy phân da cá tra cho hiệu tốt không sử dụng enzyme Trong loại enzyme sử dụng để thủy phân da cá thu collagen (endo protease, papain, pepsin, flavourzyme) enzyme pepsin cho hiệu cao (12.07%) Kiểm tra thành phần cấu trúc collagen thu kỹ thuật điện di gel polyacrymide 8% Cấu tử collagen thu thuộc collagen loại (gồm tiểu phần α-1 α-2 nằm khoảng 100 – 120kDal) KIẾN NGHỊ: - Để đề tài tiếp tục nghiên cứu tách phân đoạn protein để tách collagen loại tinh sử dụng dược phẩm, mỹ phẩm - Nghiên cứu ứng dụng collagen thủy phân từ cá thực tiễn LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 88 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: Trần thị Ân, Đái Duy Ban, Nguyễn Hữu Chấn, Đỗ Đình Hồ, Lê Đức Trình (1980), Hóa sinh học NXB Y Học Nguyễn Hữu Chấn, Nguyễn thị Hà, Nguyễn Nghiêm Luật, Hoàng Bích Ngọc, Vũ thị Phương (2001), Hóa Sinh NXB Y Học Phạm Chân Châu, Trần thị Áng (2003), Hóa Sinh NXBGD – Hà Nội Cao Đăng Nguyên (2006), Giáo trình công nghệ protein, Đại học Khoa Học – Đại Học Huế Nguyễn thị Thịnh Phạm Trân Châu, Đàm Phú Yên (1971), Hóa sinh học đại cương NXB KHKT Đặng thị Thu, Tô kim Anh, Lê quang Hòa, Đỗ ngọc Liên, nguyễn thị Xuân Sâm, lê ngọc Tú, Đỗ Hoa Viên (2009), Cơ sở công nghệ sinh học, công nghệ hóa sinh NXB Giáo Dục Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng thị Thu , Phạm quốc Thăng, Nguyễn thị Thịnh, Bùi Đức Hội, Lưu Duẫn, Lê Doãn Diên (2002), Hóa Sinh Công Nghiệp Tài liệu nước ngoài: Anamaria Bechir; Rodica Sirbu; Minodora Leca; Maria Maris; Dan Artenie Maris; Emilia Mihaela Cadar; Marius Maris ( 2009), “Nanobiotechnology of Obtaining of Collagen Gels from Marin Fish Skin andYours Reological Properties for using Like New Materials in Dental Medicine” The Proceedings of World Academy of Science, Engineering and Technology, (No.42), pp 687693 Ali Aberoumand (2010), Edible Gelatin from Some Fishes Skins as Affected B Y Chemical Treatments, pp 59-61 10 Camille J Francois, and M.J Glimchera (2003), The isolation and amino axit composition of the α chains of chicken-bone collagen, pp.91-96 LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 89 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 11 Dieter Swatschek et al Alupei, Corneliu Iulian (Neuwied, DE) Ruth, Peter (Melsbach, DE) Rohrer, Christian (Linz, AT) Schatton, Wolfgang (Frankfurt, DE) (2002), “Marine sponge collagen: isolation, characterization and effects on the skin parameters surface-pH, moisture and sebum”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol 53, No 1, pp 107-113 12 Guldehen BILGEN, Servet YALCIN (18.02.1999), “Collagen content and Electrophoretic Analysis of Type I collagen in Breast skin of heterozygous naked neck and normally feathered commercial broilers”, pp 483-487 13 Isabel Aidos, Oyvind Lie, and Marit Espe (1999), Collagen Content in Farmed Atlantic Salmon (Salmo salar L.) 47 (4), pp 1440–1444 14 Kenji Satof, Reiji Yoshinalra, Mamoru Satof And Shizunori Ikeda (1986) A Simplified Method for Determining Collagen in Fish Muscle, pp 889-893 15 Kenji Satof, Reiji Yoshinalra, Mamoru Sato and Yutaka Shimizu (1987), Isolation of Native Axit-Soluble Collagen from Fish Muscle, pp 1431-1436 16 Marco P.E Wenger, Laurent Bozec, Michael A Horton and Patrick Mesquida Bone and Mineral Centre (2007), Mechanical Properties of Collagen Fibrils, pp 1255-1263 17 Matthew D.Shoulder and Ronald T.Raines (2009), ”Collagen structure and stability”, Annual review of Biochemistry, pp 929-951 18 Mr Somsanith Duang paseuth, Mrs Quail das, Mr Narasak chotchamlong, Miss Javkhlan Arium baatar, Miss Alisa khunchornyakong, Mrs vijaya layan prashanthini, Miss Warangkana jutidamrongphan (2007), seafood processing, pp 4-22 19 Peter F Pavison, lenxington, Mass (1991), collagen extracted from collagencontaining tissue, united states patent (5,064,941), pp 1-6 20 Prabjeet Singh, Soottawat Benjakul, Sajid Maqsood, Hideki Kishimura (2010), “Isolation and characterisation of collagen extracted from the skin of striped catfish (pangasianodon hypophthalmus)” Foodchemistry, pp 97-105 LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 90 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 21 S Morimura , H Nagata, Y Uemura, A Fahmi, T Shigematsu and K Kida (2002), “Development of an effective process for utilization of collagen from livestock and fish waste” Process biochemistry, pp 1403-1412 22 S RAMA and GOWRI CHANDRAKASAN (1983) “Physico-chemical characterization and molecular organization of the collagen from the skin of an air-breathing fish”, (Ophiocephalus striatus), pp 147-154 23 Takeshi nagai, Masami Izumi (2003), Fish scale collagen Preparation and partial characterization, pp 239-244 24 Takeshi Nagai and Nobutaka Suzuki (accepted July 1999), “Isolation of collagen from fish waste material — skin, bone and fins” Food chemistry 68, pp 277-281 25 Treesin Potaros, Nongnuch Raksakulthai, Jiraporn Runglerdkreangkrai and Wanchai Worawattanamateekul (2009), “Characteristics of Collagen from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Skin Isolated by Two Different Methods”, pp 584-593 26 ZHONGKAI ZHANG ; GUOYING LI ; BL SHI (2005), “Physicochemical properties of collagen, gelatin and collagen hydrolysate derived from bovine limed split wastes”, pp 23-28 27 Wolff I, Wich G, Furthmayr H, Timpl R, steffen C (1970 Dec 22), “The role of collagen in the quality and processing of fish” 221(3): 652-6 Website: 28 http://www.freepatentsonline.com 29 www.collagenelife.com 30 http://www.vasep.com.vn 31 http://agriviet.com/home/showthread.php?t=1560 32 www.verylib.com.cn/ /242752.htm 33 http://www.sciencedirect.com 34 www.vietlinh.com.vn 35 http://vi.wikipedia.org/wiki/Protein LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 91 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 36 http://en.wikipedia.org/wiki/Collagen 37 http://www.collagenelife.com/page_1167323108078.html 38 http://www.goodmaxgroup.com/Health-Products-Collagen/About-CollagenFactory/Fish-Collagen-Peptide-Introduction.html 39 http://vietfish.org/20100910040243396p48c83/collagen-co-hoi-moi-cho-dn-sanxuat-ca-tra.htm 40 http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/s1095643302002155 41 http://wires.wiley.com/WileyCDA/WiresArticle/wisId-WNAN100.html 42 http://www.gelatin.com 43 http://www.pokka.com.sg 44 http://www.eatyourselfbeautiful.com 45 http://trungnguyen.com.vn/vn/default.aspx?c=333 46 http://www.midwesternresearch.com/CASINGS_COLLAGEN.htm LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC 92 HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG ... COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA Mục đích đề tài: - Nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết thu nhận collagen từ da cá tra công nghệ enzyme Nội dung: - Xác định tỉ lệ da cá thu từ phụ phẩm chế biến cá tra. .. thường sử dụng 49 2.4.2.1 Quy trình tách chiết collagen từ cá da trơn 49 2.4.2.2 Tách chiết collagen từ thịt cá chép, cá hồi (1986) 50 2.4.2.3 Tách chiết collagen từ thịt cá chép... [38] Từ ứng dụng hiệu kinh tế collagen mang lại sống, nhận thấy tiềm nguồn cung cấp collagen nước ta Chúng tiến hành nghiên cứu đề tài: “ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYM ĐỂ TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN COLLAGEN