Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý đến hiệu suất tách chiết polysaccharide từ nấm linh chi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN HOÀNG NGỌC MINH ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ VẬT LÝ ĐẾN HIỆU SUẤT TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE TỪ NẤM LINH CHI CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS QUẢN LÊ HÀ Hà Nội – Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Hoàng Ngọc Minh, xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài ―Ản Pol s ƣởn ủ u tố vật l n iệu suất t i t ride từ nấm Linh chi‖ công trình nghiên cứu thực hướng dẫn PGS.TS Quản Lê Hà Các số liệu, kết trình bày luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình khoa học khác LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước tiên xin gửi lời chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình giảng dạy, hướng dẫn suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Quản Lê Hà tận tình giúp đỡ, trực tiếp bảo, hướng dẫn thời gian thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên góp ý cho suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Học viên N u ễn Hoàn N ọ Min MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổn qu n nấm Lin i 1.1.1 Tên khoa học phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 1.1.4 Thành phần hóa học dược tính sinh học 1.1.5 Tác dụng Linh chi 1.2 Pol s ride tron nấm Lin i .9 1.2.1 Thành phần Polysaccharide 10 1.2.2 Vai trò dược học Polysaccharide 10 1.3 Beta – glucan (β-glucan) 11 1.3.1 Giới thiệu β-glucan 11 1.3.2 Tính chất β-glucan 11 1.4 C u tố ản ƣởn n qu trìn t i t 12 1.4.1 Nguyên liệu 12 1.4.2 Dung môi 13 1.4.3 Yếu tố kỹ thuật 13 1.5 C t n ân vật l 14 1.5.1 Ứng dụng phương pháp siêu âm tách chiết .14 1.5.2 Sử dụng vi sóng 17 1.6 Tìn ìn nuôi trồn n iên ứu nấm Lin i .18 1.6.1 Tình hình nghiên cứu giới .19 1.6.2 Tình hình nghiên cứu nước .22 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 Đối tƣợn n 2.2 Hó iên ứu 24 ất t i t bị t í n iệm 24 2.2.1 Hóa chất 24 2.2.2 Thiết bị thí nghiệm 25 2.3 P ƣơn p pn iên ứu 25 2.3.1 Quy trình thí nghiệm tổng quan 25 2.3.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu .27 2.3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết 28 2.4 P ƣơn p p p ân tí 30 2.4.1 Phương pháp phân tích polysaccharide tổng số 30 2.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng β-glucan .31 2.4.3 Phương pháp sắc ký mỏng TLC 33 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 34 3.1 K ảo s t iều kiện t i t tron dun môi nƣớ 34 3.1.1 Ảnh hưởng trạng thái nguyên liệu 34 3.1.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu nước 35 3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian đến trình tách chiết 36 3.2 K ảo s t ản ƣởn ủ t n ân vật l n qu trìn t i t tron dun môi nƣớ 39 3.2.1 Ảnh hưởng chế độ siêu âm đến trình tách chiết 39 3.2.2 Khảo sát nhiệt độ siêu âm thích hợp 40 3.2.3 Khảo sát thời gian siêu âm thích hợp 41 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng vi sóng đến trình tách chiết 43 3.2.5 Sử dụng vi sóng siêu âm hỗ trợ trình tách chiết 45 3.2.6 Khảo sát thời gian siêu âm kết hợp vi sóng 46 3.3 K ảo s t iều kiện t i t tron dun môi kiềm 49 3.3.1 Xác định nồng độ dung môi thích hợp .49 3.3.2 Xác định thời gian tách chiết thích hợp 50 3.3.3 Xác định nhiệt độ tách chiết thích hợp .51 3.4 Điều kiện t í ợp t i t pol s ride từ nấm Lin i .52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 62 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU TÊN ĐẦY ĐỦ UHF Ultra High Frequency wave UAE Ultrasonic-assisted extraction RSM Response Surface Methodology DNS 3,5-dinitrosalicylic acid TLC Thin Layer Chromatography UV Ultra-violet IR Infra-red GC – MS Gas Chromatography Mass Spectometry HPLC High-performance liquid chromatography ICP Inductively-Coupled Plasma NK Natural killer cells HIV Human immunodeficiency virus HPAEC – PAD High performance anion exchange chromatography - pulsed amperometric detection DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần hóa học nấm Linh chi Bảng 1.2: Các hoạt chất sinh học dẫn xuất nấm Linh chi Bảng 1.3: Một số ứng dụng sóng siêu âm công nghệ thực phẩm 15 Bảng 3.1: Lượng polysaccharide thu 55 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Các loại nấm Linh chi Hình 1.2: Cấu tạo cắt ngang Nấm Linh chi Hình 1.3: Công thức hóa học β-glucan nấm Linh chi 11 Hình 1.4: Phân loại loại sóng theo tần số 15 Hình 1.5: Phân tử phân cực xếp lại vị trí trường điện từ 18 Hình 3.1: Nấm nghiền nhỏ dạng bột 34 Hình 3.2 : Nấm dạng mảnh 2x10mm 34 Hình 3.3: Ảnh hưởng trạng thái nguyên liệu đến trình tách chiết 34 Hình 3.4: Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/nước đến trình tách chiết 35 Hình 3.5: Ảnh hưởng thời gian đến trình tách chiết 37 Hình 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ siêu âm đến trình tách chiết 40 Hình 3.7: Ảnh hưởng thời gian siêu âm đến trình tách chiết 41 Hình 3.8: Dịch tách chiết vi sóng từ phút ÷ phút 43 Hình 3.9: Ảnh hưởng thời gian vi sóng đến trình tách chiết 44 Hình 3.10: Kết hợp vi sóng siêu âm 46 Hình 3.11: Mẫu tách chiết hỗ trợ vi sóng từ 30 giây ÷ 210 giây 47 Hình 3.12: Khảo sát thời gian tách chiết thích hợp sử dụng vi sóng 47 Hình 3.13: Ảnh hưởng dung môi đến trình tách chiết 49 Hình 3.14: Thời gian tách chiết thích hợp dung môi NaOH 5% 50 Hình 3.15: Nhiệt độ tách chiết thích hợp NaOH 5% 51 Hình 3.16: Kết sắc ký từ dịch thủy phân polysaccharide sản phẩm 55 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh MỞ ĐẦU Nấm Linh chi (hay Lingzhi – tiếng Trung Quốc; Reishi – tiếng Nhật Bản) loại nấm dược liệu đặc biệt biết đến y học phương Đông Tác phẩm "Thần nông thảo kinh" Trung Quốc xếp Linh chi vào loại ―thần dược‖ cao nhân sâm "Bản thảo cương mục" Lý Thời Trân xem Linh chi loại thuốc quý, có tác dụng bảo vệ gan, giải độc, bổ tim, bổ óc, tiêu đờm, lợi niệu, bổ dày Gần đây, nhiều nghiên cứu đến từ Trung Quốc, Nhật Bản, Mỹ… với kỹ thuật khoa học đại phát nấm Linh chi có tác dụng phòng chữa số bệnh Nhiều công trình nghiên cứu giới xác định hoạt chất Linh chi tác dụng dược lý chúng Quả thể, sợi nấm bào tử nấm Linh chi có chứa số chất có hoạt tính sinh học mạnh như: Acid ganoderic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans, beta-D-glucan… Các nhà khoa học Việt Nam tìm thấy nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố vi lượng cần thiết cho vận tải chuyển hóa chất thể như: Đồng, sắt, kali, mangan, natri, canxi… [5] Ngày nay, polysaccharide tách chiết từ nấm Linh chi chứng minh có hoạt tính dược lý như: Chống ung thư, kháng u, chống oxi hóa, làm tăng khả miễn dịch thể, diệt tế bào ung thư [32] Việc chiết xuất polysaccharide trình quan trọng nghiên cứu ứng dụng polysaccharide sau Về bản, chiết nước nóng phương pháp sử dụng rộng rãi việc chiết xuất polysaccharide Tuy nhiên, phương pháp có suất thấp, tiêu tốn thời gian, cần trì nhiệt độ cao, cần thiết phải tìm phương pháp khác khắc phục nhược điểm [14],[60] Phương pháp tách chiết với hỗ trợ sóng siêu âm vi sóng thúc đẩy trình chiết xuất hứa hẹn cải thiện đảm bảo hiệu suất tách chiết Viện CNSH&CNTP 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh Bột Linh chi Tách chiết nước Tỷ lệ 1:20 Siêu âm (600C, 30‘) Vi sóng (350W, 150s) Lọc Dịch chiết Bã nấm Linh chi Kết tủa etOH 96% Sấy (600C, 12h) Tách chiết NaOH Tỷ lệ 1:5 40C, 12h NaOH 5% (tỷ lệ 1:20) 600C, 1,5h Ly tâm (6000v/phút, 15‘) Loại dịch Thu kết tủa Viện CNSH&CNTP Lọc Bã nấm 53 Dịch chiết 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh Sấy kết tủa Trung hòa HCl 2M Thẩm tích (100C, ngày) Polysaccharide thô (PS1) Kết tủa etOH 96% Tỷ lệ 1:5 40C, 12h Ly tâm (6000v/phút, 15‘) Loại dịch Thu kết tủa Sấy kết tủa Polysaccharide kiềm t ô (PS2) Viện CNSH&CNTP 54 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh Hàm lượng polysaccharidethu sau tách chiết theo quy trình từ 1g nguyên liệu nấm Linh chi khô ban đầu: Bảng 3.1: Hàm lượng polysaccharide thu P ƣơn pháp Lần Nước/siêu âm/vi sóng (PS1) Lần NaOH 5% (PS2) Polysaccharide Hàm lƣợn β-glucan (mg/g) (% polysaccharide) 55,846 ± 0.283 42,915 92,416 ± 0.34 54,396 Hình 3.16: Kết sắc ký từ dịch thủy phân polysaccharide sản phẩm Mẫu ối ứn (nƣớ ất) Mẫu pol s ride t i t bằn nƣớ (m /ml) Mẫu uẩn D- glucose (mg/ml) Mẫu pol s ride t i t bằn N OH 5% (m /ml) Kết phân tích sản phẩm thu sau thủy phân sắc ký TLC (Hình 16) cho thấy sản phẩm tạo có độ cao tương ứng với D-glucose chứng tỏ sản phẩm sau thủy phân chứa D-glucose sản phẩm tách chiết NaOH 5% cho hàm lượng polysaccharide cao sản phẩm tách chiết nước Viện CNSH&CNTP 55 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu thu rút kết luận sau: Xác định điều kiện thích hợp tách chiết dung môi nước: - Thời gian nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tách chiết Khi gia tăng nhiệt độ thời gian hàm lượng polysaccharide tăng, tách chiết dung môi nước 1000C cho hiệu suất tốt đạt 2,38% - Điều kiện thích hợp tách chiết sóng siêu âm: Ở 600C 30 phút, hiệu suất đạt 1,6% - Điều kiện thích hợp tách chiết vi sóng (đối với thể tích hỗn hợp nghiên cứu): Công suất 350W 150 giây, hiệu suất đạt 0,7% Xác định điều kiện thích hợp để tách chiết dung môi NaOH: Nồng độ NaOH 5%, 1,5 600C, hiệu suất đạt 11,3% Lựa chọn điều kiện tách chiết polysaccharide từ nấm Linh chi: Nguyên liệu nấm Linh chi sau nghiền nhỏ tách chiết nước có hỗ trợ sóng siêu âm (600C, 30 phút) vi sóng (350W, 150 giây), thu polysaccharide 55,846 ± 0,283mg/g, ß-glucan chiếm 42,915% Trích ly bã nấm (thu sau lần chiết nước) dung dịch NaOH 5% (600C, 1,5 giờ) cho hàm lượng polysaccharide đạt 92,416 ± 0,34mg/g, ß-glucan chiếm 54,396% KIẾN NGHỊ Do máy siêu âm phòng thí nghiệm đáp ứng nhiệt độ cao 600C cần khảo sát thêm điều kiện nhiệt độ cao tách chiết bể siêu âm Khảo sát phương pháp tinh sản phẩm Viện CNSH&CNTP 56 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lê Trung Hiếu (2011), Nghiên cứu tách chiết định lượng hoạt chất polysaccharide triterpenoid nấm Linh chi Ganoderma lucidum, Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế Trương Thị Hòa cộng (2001), Nghiên cứu trích ly hợp chất sinh học từ nấm Linh chi, Viện công nghệ thực phẩm Nguyễn Hoài Hương (2009), Bài giảng thực hành hóa sinh, Đại học kỹ thuật công nghiệp HCM Đỗ Tất Lợi, Lê Duy Thắng Trần Văn Luyến (1994), Nấm linh chi nuôi trồng sử dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh, NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội Lê Xuân Thám (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điểm hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst, Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Ðại học Khoa Học Tự Nhiên, Ðại học Quốc Gia Hà nội, Việt nam Lê Xuân Thám (1998), Nấm Linh Chi thuốc quý, NXB Khoa học Kỹ thuật Lê Xuân Thám (2005), Nấm Linh Chi tài nguyên dược liệu quý Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 15 TIẾNG ANH 10 Al-Harahsheh M Kingman S.W (2004), "Microwave-assisted leaching—a review", Hydrometallurgy 73(3), tr 189-203 11 Amaral A.E cộng (2008), "An unusual watersoluble β-glucan from the basidiocarp of the fungus Ganoderma resinaceum", Carbohydrate Polymers 72(3), tr 473-478 12 Bao X.F cộng (2001), "Structural and immunological studies of a major polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst", Carbohydrate Research 332(1), tr 67-74 13 Bao X.F cộng (2002), "Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum", Phytochemistry 59(2), tr 175-181 14 Bonrath W (2004), "Chemical reactions under ‗non-classical conditions‘, microwaves and ultrasound in the synthesis of vitamins", Ultrason Sonochem 11, tr 1-4 Viện CNSH&CNTP 57 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh 15 Chan W.K cộng (2007), "Response of human dendritic cells to different immunomodulatory polysaccharides derivedfrom mushroom and barley", International Immunology 19, tr 891-899 16 Chang Y.W Lu T.J (2004), "Molecular Characterization of Polysaccharides in Hot-Water Extracts of Ganoderma lucidum Fruiting Bodies", Journal of Food and Drug Analysis 12(1), tr 59-67 17 Chen J.H., Zhou J.P Zhang L.N (1998), "Chemical structure of the waterinsoluble polysaccharide isolated from the fruiting body of Ganoderma lucidum", Polymer Journal 30(10), tr 838-842 18 Chen Y cộng (2010), "Optimization of ultrasonic/microwave assisted extraction (UMAE) of polysaccharides from Inonotus obliquus and evaluation of its anti-tumor activities", Int J Biol Macromol 46, tr 429-435 19 Coustantina T Geoge L (2003), "Extraction optimization in Food engineering", Maral Dekker Inc, New York, tr 52-72 20 Dam S.M cộng (2015), "Optimizing the polysaccharide extraction from the Vietnamese Lingzhi (Ganoderma lucidum) via enzymatic method", Journal of Food and Nutrition Sciences 3, tr 111-114 21 Dong J.Z., Wang Z.C Wang Y (2011), "Rapid extraction of polysaccharides from fruits of Lycium barbarum L J.", Food Biochem 35, tr 1047-1057 22 Dong Q cộng (2012), "A novel water-soluble β-D-glucan isolated from the spores of Ganoderma lucidum", Carbohydrate Research 353, tr 100-105 23 Gunjan S cộng (2013), "Optimization of extraction and characterization of polysaccharides from medicinal mushroom Ganoderma lucidum using response surface methodology", Academic Journals 7, tr 23232329 24 Huang P cộng (2007), "Study on Microwave-assisted Extraction of Polysaccharides from Spores of Ganoderma atrum with Response Surface Analysis", Chin Food Sci Technol 28, tr 200-203 25 Huang S.Q cộng (2010), "Optimization of Alkaline Extraction of Polysaccharides from Ganoderma lucidum and Their Effect on Immune Function in Mice", Molecules 15, tr 3694-3708 26 Huang S.Q cộng (2011), "Purification and structural characterization of a new water-soluble neutral polysaccharide GLP-F1-1 from Ganoderma lucidum", International Journal of Biological Macromolecules 48(1), tr 165169 27 Huang S.Q Ning ZX (2010), "Extraction of polysaccharide from Ganoderma lucidum and its immune enhancement activity", Int J Biol Macromol 47(3), tr 336-341 Viện CNSH&CNTP 58 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh 28 Hung W.T cộng (2008), "Structure Determination of ß-Glucans from Ganoderma lucidumwith Matrix-assisted Laser Desorption/ionization (MALDI) Mass Spectrometry", Molecules 13, tr 1538-1550 29 Ji J.B cộng (2005), "Improvement of leaching process of Geniposide with ultrasound", Ultrasonics Sonochemistry 13(5), tr 455-462 30 Jung H.K cộng (2007), "Production and Physicochemical Characterization of β-Glucan Produced by Paenibacillus polymyxa JB115", Biotechnology and Bioprocess Engineering 12, tr 713-719 31 Kan Y.J cộng (2015), "Antioxidant activity of polysaccharide extracted from Ganoderma lucidum using response surface methodology", Int J Biol Macromol 72, tr 1-7 32 Kim B.K cộng (1980), "Studies on atineoplastic components of Korean basidiomycetes", Korean J Mycol 8, tr 107-113 33 Ordin L (1959), "Effect Of Water Stress On Cell Wall Metabolism Of Avena Coleoptile Tissue", Plant Physiol 35(4), tr 443-450 34 Li J.W., Ding S.D Ding X.L (2007), "Optimization of the ultrasonically assisted extraction of polysaccharides from Zizyphus jujuba cv jinsixiaozao", Journal of Food Engineering 80(1), tr 176-183 35 Lie L., cộng (2006), "5 α - Reductase Inhibitory Effect of Triterpenoid Isolated from Ganoderma lucidum", Biol Pharm Bull 29(2),tr 2-5 36 Liu W., cộng (2010), "Characterization and antioxidant activity of two lowmolecular-weight polysaccharides purified from the fruiting bodies of Ganoderma lucidum", International Journal of Biological Macromolecules 46(4), tr 451-457 37 Ma J., Qiao Z Xiang X (2011), "Optimisation of extraction procedure for black fungus polysaccharides and effect of the polysaccharides on blood lipid and myocardium antioxidant enzymes activities", Carbohydr Polym 84, tr 10611068 38 Masao H., cộng (2001), "Anticomplement activity of terpenoids from the spores of Ganoderma lucidum.", Planta medica 67(9), tr 1-4 39 Meihua M., cộng (2013), "Optimization of Extraction Technology of Polysaccharide of Tricholoma giganteum", Pharmacology & Pharmacy 4, tr 15 40 Min S., cộng (2014), "Effect of ultrasonic extraction conditions on antioxidative and immunomodulatory activities of a Ganoderma lucidum polysaccharide originated from fermented soybean curd residue", Food Chemistry 155, tr 50-56 41 Miyazaki Nishijima (1981), "Studies on fungal polysaccharides XXVII structural examination of a watersoluble, anti-tumor polysaccharide of Ganoderma lucidum", Chemical and Pharmaceutical Bulletin 29, tr 3611-3616 Viện CNSH&CNTP 59 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh 42 Mizuno T., Sakai T Chihara G (1995), "Health foods and medicinal usages of mushrooms", Food Reviews International 11, tr 69-81 43 Nguyen M.T (2009), "The process of bioactive extraction from Lingzhi", J Scientist and Technology, Vietnam 47(1) 44 Nguyen T.A., Tran T.H Nguyen T.P.H (2007), "Survey on the conditions to extract the bioactive components from Lingzhi (Garnoderma lucidum Karst.)", The proceeding of the 4th Organics Chemistry Conference of Science and Technology in Vietnam 45 Nie S.P cộng (2013), "Current development of polysaccharides from Ganoderma:Isolation", structure and bioactivities, Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre 1, tr 10-20 46 Pan K cộng (2013), "Optimization extraction of Ganoderma lucidum polysaccharides and its immunity and antioxidant activities", Int J Biol Macromol 55, tr 1-6 47 Povey M.I.W Mason T.J (1980), "Application of ultrasound in food technology", British Poultry Science 21(6), tr 490-495 48 Riera E cộng (2010), "High-power ultrasonic system for the enhancement of mass transfer in supercritical CO2 extraction processes", Ultrasonics 50, tr 306-309 49 Shufeng Z cộng (2004), "A Phase I/II Study of Ling Zhi Mushroom Ganoderma lucidum (W.Curt.:Fr.) Lloyd (Aphyllophoromycetideae) Extract in Patients with Type II Diabetes Mellitus", International Journal of Medicinal Mushrooms 6(1), tr 32-40 50 Sissi W.G cộng (2011), Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects, 2, CRC Press - Taylor and Francis Group, LLC, tr 175-201 51 Sone Y cộng (1985), "Structures and antitumor activities of the polysaccharides isolated from fruiting body and the growing culture of mycelium of Ganoderma lucidum", Agricultural and Biological Chemistry 49, tr 26412653 52 Song J.F., Li D.J Liu C.Q (2009), "Response surface analysis of microwaveassisted extraction of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris", J Chem Technol Biotechnol 84, tr 1669-1673 53 Tian Y cộng (2012), "Ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of polysaccharides recovered from white button mushroom (Agaricus bisporus)", Carbohydr Polym 88, tr 522-529 54 Ukai S cộng (1982), " Structure of an alkali-soluble polysaccharide from the fruit body of Ganoderma japonicum Lloyd", Carbohydrate Research 105(2), tr 237-245 Viện CNSH&CNTP 60 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh 55 Wang G cộng (1993), "Antitumor active polysaccharides from the Chinese mushroom Songshan lingzhi, the fruiting body of Ganoderma tsugae", Bioscience Biotechnology and Biochemistry 57(6), tr 894-900 56 Wang X Ma H.L (2007), "Pulsed Ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Ganoderma lucidum", Chin Food Sci Technol 9, tr 99102 57 Xiao L.W cộng (2010), "Extraction of Mycelial Polysaccharides from Submerged Cultured Agaricus blazei", Bioinformatics and Biomedical Engineering (iCBBE) 4, tr 1-4 58 Ye L.B cộng (2009), "Structural characterisation of a heteropolysaccharide by NMR spectra", Food Chemistry 112(4), tr 962-966 59 Zhang H cộng (2012), "Structural characterisation of a novel bioactive polysaccharide from Ganoderma atrum", Carbohydrate Polymers 88(3), tr 1047-1054 60 Zhang L Liu Z (2008), "Optimization and comparison of ultrasound/microwave assisted extraction (UMAE) and ultrasonic assisted extraction (UAE) of lycopene from tomatoes", Ultrason Sonochem 15, tr 731737 61 Zhang Z cộng (2011), "Optimization of the microwave-assisted extraction process for polysaccharides in himematsutake (Agaricus blazei Murrill) and evaluation of their antioxidant activities", Food Sci Technol 17, tr 461-470 Viện CNSH&CNTP 61 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh PHỤ LỤC Dựn t ị ƣờn uẩn lu ose Pha dung dịch đường glucose chuẩn: Cân glucose tinh khiết cân phân tích 0,01g Hòa tan đường glucoza nước cất định mức tới 10ml dung dịch mẹ có nồng độ 1mg/ml Tiến hành pha loãng dung dịch mẹ theo bảng sau để có nồng độ tương ứng là: 0,1mg/ml, 0,2mg/ml, 0,3mg/ml, 0,4mg/ml, 0,5mg/ml Tiến hành phản ứng với DNS ống nghiệm có nút xoáy: 0,5ml dịch đường + 1ml DNS, nút chặt, đun 1000C phút, làm lạnh nhanh đem đo OD bước sóng 540nm Trong mẫu đối chứng thay dung dịch đường nước cất Vẽ đồ thị với trục tung OD trục hoành nồng độ đường C (mg/ml) Thiết lập phương trình đường chuẩn: Bảng PL1: Bảng kết dựng đường chuẩn D-glucose Mẫu ĐC Đo OD (540nm) 0,483 0,774 1,121 1,371 1,665 1,874 Nồng độ glucose(mg/ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 OD 0,291 0,638 0,888 1,182 1,391 Đƣờn uẩn lu ose OD 540 nm y = 2.822x + 0.026 R² = 0.995 1.5 0.5 0 0.2 0.4 0.6 Nồng độ glucose (mg/ml) Hình PL1: Đường chuẩn glucose Viện CNSH&CNTP 62 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh K ảo s t ản ƣởn dị i t nấm Lin ủ tỷ lệ etOH i n qu trìn k t tủ pol s ride tron Bảng PL2: Kết tỷ lệ dịch chiết : etOH 96% (v/v) STT Dung môi N iệt T ời i n ộ(0C) ( iờ) Tỷ lệ dị Hàm lƣợn ƣờn tổn t i t : etOH 96% tron nấm (m ) Nước cất 30 1h 1:2 1,53 ± 0,05 Nước cất 30 1h 1:4 3,45 ± 0,05 Nước cất 30 1h 1:5 5,72 ± 0,11 Nước cất 30 1h 1:6 5,47 ± 0,05 Nước cất 60 1h 1:2 4,76 ± 0,05 Nước cất 60 1h 1:4 7,37 ± 0,05 Nước cất 60 1h 1:5 10,82 ± 0,05 Nước cất 60 1h 1:6 11,02 ± 0,17 Nước cất 100 1h 1:2 11,28 ± 0,26 10 Nước cất 100 1h 1:4 13,49 ± 0,17 11 Nước cất 100 1h 1:5 17,74 ± 0,11 12 Nước cất 100 1h 1:6 16,72 ± 0,51 K ảo s t ản ƣởn ủ t ời i n n iệt ộ tron qu trìn pol s ride từ nấm Lin i bằn dun môi N OH t i t Bảng PL3: Kết ảnh hưởng thời gian nhiệt độ dung môi NaOH N iệt ộ T ời i n NaOH (0C) ( iờ) 1% 30 1h 7,938 ± 0,113 1% 30 1,5h 8,335 ± 0,170 1% 30 2h 8,731 ± 0,227 STT Nồn ộ Viện CNSH&CNTP 63 Hàm lƣợn ƣờn tổn t i t tron nấm (m ) 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh 1% 60 1h 11,566 ± 0,000 1% 60 1,5h 15,138 ± 0,170 1% 60 2h 16,386 ± 0,170 1% 100 1h 23,813 ± 0,113 1% 100 1,5h 29,653 ± 0,283 1% 100 2h 31,694 ± 0,057 10 2% 30 1h 12,133 ± 0,227 11 2% 30 1,5h 17,406 ± 0,170 12 2% 30 2h 19,447 ± 0,170 13 2% 60 1h 15,252 ± 0,170 14 2% 60 1,5h 23,700 ± 0,227 15 2% 60 2h 46,775 ± 0,170 16 2% 100 1h 40,142 ± 0,113 17 2% 100 1,5h 46,492 ± 0,227 18 2% 100 2h 50,234 ± 0,113 19 3% 30 1h 38,214 ± 0,113 20 3% 30 1,5h 45,585 ± 0,113 21 3% 30 2h 46,492 ± 0,113 22 3% 60 1h 39,745 ± 0,170 23 3% 60 1,5h 46,095 ± 0,170 24 3% 60 2h 48,476 ± 0,057 25 3% 100 1h 45,131 ± 0,680 26 3% 100 1,5h 48,646 ± 0,340 27 3% 100 2h 55,904 ± 0,113 28 4% 30 1h 47,796 ± 0,283 29 4% 30 1,5h 48,079 ± 0,227 Viện CNSH&CNTP 64 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh 30 4% 30 2h 48,136 ± 0,170 31 4% 60 1h 74,387 ± 1,134 32 4% 60 1,5h 75,748 ± 0,454 33 4% 60 2h 78,696 ± 0,907 34 4% 100 1h 75,067 ± 2,041 35 4% 100 1,5h 77,562 ± 0,454 36 4% 100 2h 81,191 ± 0,227 37 5% 30 1h 52,275 ± 0,794 38 5% 30 1,5h 57,605 ± 0,454 39 5% 30 2h 58,512 ± 0,680 40 5% 60 1h 93,891 ± 0,907 41 5% 60 1,5h 113,395 ± 0,454 42 5% 60 2h 110,446 ± 0,680 43 5% 100 1h 97,746 ± 2,268 44 5% 100 1,5h 91,850 ± 1,134 45 5% 100 2h 87,314 ± 0,454 K t t í n iệm x ịn àm lƣợn β-glucan Bảng PL4: Phân tích hàm lượng Glucan tổng số K ối lƣợn STT Mẫu mẫu p ân tí (mg) OD Hàm lƣợn Glu n (510 nm) tổn số (%) PS1 100 0,048 ± 0,000 50,526 ± 0,000 PS2 100 0,07 ± 0,001 73,684 ± 1,053 Viện CNSH&CNTP 65 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng Ngọc Minh Bảng PL5: Phân tích hàm lượng α-glucan K ối lƣợn STT Mẫu mẫu p ân tí (mg) OD Hàm lƣợn α-glucan (510 nm) (% polysaccharide) PS1 100 0,078 ± 0,002 7,611 ± 0,195 PS2 100 0,08 ± 0,002 7,806 ± 0,195 P ƣơn p px ịn Nitơ tổn số (p ƣơn p p Kjeld l) * Nguyên tắc: Khi đốt nóng nguyên liệu đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, hợp chất hữu bị oxy hoá Cacbon hydro tạo thành CO2 H2O nitơ sau giải phóng dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan dung dịch [3] Đuổi amoniac khỏi dung dịch NaOH, đồng thời cất thu lượng dư axit boric H3PO3 (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH4OH + Na2SO4 2NH4OH + H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 7H2O Định phân lượng tetraborat amôn tạo thành dung dịch H2SO4 chuẩn, qua đótính lượng nitơ mẫu vật (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)SO4 + H3BO3 * Cách thức thực hiện: - Cân 0,5g mẫu chuyển vào bình Kjeldahl - Cho tiếp vào bình Kjeldahl 10ml H2SO4 đậm đặc (d=1,84) - Để tăng nhanh trình vô hoá (đốt cháy) cần phải cho thêm hỗn hợp xúc tác CuSO4 K2SO4 (tỷ lệ 1:3) Sau đun dung dịch hoàn toàn màu để nguội Viện CNSH&CNTP 66 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ - Nguyễn Hoàng Ngọc Minh Chuyển toàn dung dịch sau vô hoá xong bình Kjeldahl vào bình định mức 100ml thêm nước cất đến vạch mức, lắc - Lấy 10ml dung dịch thí nghiệm sau vô hóa định mức đến 100ml 10ml dung dịch NaOH 40% cho vào bầu cất Quá trình cất kết thúc sau 15 phút, định phân lượng tetraborat amon tạo thành dung dịch H2SO4 0,01N Cất mẫu trắng để kiểm chứng với thuốc thử thao tác thay 10ml dung dịch vô hoá 10ml nước cất Kết tính theo công thức: X= ( ) = ( ) = 2,25% Trong : X: Hàm lượng protein (%) 6,25: Hệ số chuyển đổi sang hàm lượng protein a: Số ml H2SO4 0,01N dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm b: Số ml H2SO4 0,01N dùng để chuẩn độ mẫu kiểm chứng 0,14: mg nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,01N V: Dung tích bình định mức V1: ml dung dịch thí nghiệm hút từ bình định mức vào bầu cất m: Lượng mẫu đem cất đạm (mg) Viện CNSH&CNTP 67 2013 - 2015 ... sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết như: trạng thái nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian, loại dung môi để tách chiết polysaccharide từ nấm Linh chi đạt hiệu suất tốt - Khảo sát khả năngtách chiết. .. trình tách chiết 35 Hình 3.5: Ảnh hưởng thời gian đến trình tách chiết 37 Hình 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ siêu âm đến trình tách chiết 40 Hình 3.7: Ảnh hưởng thời gian siêu âm đến trình tách. .. hỗ trợ tách chiết mang lại kết cao, Wang, X cộng (2007) thành công việc sử dụng máy siêu âm để hỗ trợ tách chiết polysaccharide từ nấm Linh chi dung môi nước làm tăng hiệu suất tách chiết polysaccharide