Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (pangasius hypophthalmus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ THỊ THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS) LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2018 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ THỊ THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS) Chuyên ngành: Chế biến Thực phẩm Đồ uống Mã số chuyên ngành: 62540201 Phản biện độc lập 1: PGS.TS Quản Lê Hà Phản biện độc lập 2: PGS.TS Đặng Minh Nhật Phản biện 1: GS.TSKH Nguyễn Minh Tuyển Phản biện 2: GS.TS Lê Văn Việt Mẫn Phản biện 3: TS Lê Thị Minh Thủy NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS Phan Đình Tuấn PGS.TS Nguyễn Hồng Dũng ii LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tác giả Các kết nghiên cứu kết luận luận án trung thực, không chép từ nguồn hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Tác giả luận án Lê Thị Thu Hương iii TÓM TẮT LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Collagen loại protein chủ yếu chất ngoại bào mô liên kết [1], [2] Collagen chiếm 30 % tổng lượng protein thể, đóng vai trị then chốt thành phần cấu tạo mô liên kết da, gân, xương, dây chằng,…Collagen loại vật liệu sinh học ứng dụng rộng rãi công nghiệp sản xuất mỹ phẩm, thực phẩm dược phẩm [3], [4] Trước đây, collagen tinh chế từ nguồn nguyên liệu da xương trâu, bò, lợn Từ năm 2000 đến nay, bùng nổ bệnh bị điên, bệnh lở mồm long móng lợn gia súc; thêm vào đó, lý tơn giáo số đạo cấm sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ bò, lợn nên đa số nghiên cứu tách chiết collagen tập trung vào nguồn nguyên liệu thay có nguồn gốc từ thủy sản Việt Nam quốc gia xuất thủy sản lớn giới, chủ yếu mặt hàng phi lê cá tra, cá ba sa Lượng phụ phẩm hai loại cá thải hàng năm lên tới hàng trăm ngàn Tại thời điểm tại, phụ phẩm cá tra, cá ba sa chủ yếu chế biến thành thức ăn gia súc phân bón có giá trị kinh tế thấp Trong đó, da cá tra chứa lượng collagen lớn, sản phẩm có giá trị cao, ưa chuộng thị trường giới, có nhiều ứng dụng cơng nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm vật liệu sinh học Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra nhằm đa dạng hóa sản phẩm có nguồn gốc từ thủy sản, nâng cao giá trị kinh tế loài cá tra, cá ba sa, từ nâng cao thu nhập cho người ni trồng chế biến thủy sản cần thiết Mục tiêu luận án Đề tài “Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus)” thực với mục tiêu: (1) Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết collagen xác định giải pháp kỹ thuật để nâng cao hiệu suất thu nhận collagen; iv (2) Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng động học q trình trích ly collagen nhằm lựa chọn thơng số cơng nghệ thích hợp thơng qua mơ hình hóa động học trích ly để dự đoán hàm lượng collagen theo thời gian trích ly, tăng khả chủ động điều khiển q trình trích ly (3) Xác định số đặc tính hóa lý collagen tách chiết từ da cá tra Nội dung nghiên cứu - Xác định thông số kỹ thuật ba cơng đoạn quy trình cơng nghệ tách chiết collagen: tách tạp chất, trích ly tinh collagen - Tối ưu hóa trình trích ly collagen phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Mothodology) sử dụng phần mềm Design Expert 10: Thiết kế thí nghiệm theo phương án quay bậc hai tâm xoay Box – Hunter; đánh giá tính ý nghĩa hệ số hồi quy theo chuẩn Student; đánh giá tính phù hợp phương trình hồi quy theo chuẩn Fisher; Tối ưu hóa giá trị yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen phương pháp bề mặt đáp ứng; Kiểm tra tương thích thực nghiệm mơ hình dự đốn - Nghiên cứu động học chế trình trích ly collagen: với thơng số ảnh hưởng vùng khảo sát xác định qua nghiên cứu tối ưu hóa trên, tiến hành khảo sát thay đổi hàm lượng collagen trích ly theo thời gian theo thay đổi hàm lượng thông số ảnh hưởng Kết thực nghiệm thu dùng để kiểm chứng, đánh giá tương thích ba mơ hình với thực nghiệm để chọn mơ hình phù hợp mơ tả động học q trình trích ly collagen - Nghiên cứu đặc tính hóa lý collagen da cá tra như: thành phần amino acid, cấu tạo phân tử, nhiệt độ biến tính Đồng thời kiểm tra số tiêu kim loại nặng vi sinh vật collagen thành phẩm Những đóng góp luận án * Về mặt học thuật v (1) Đã xây dựng mơ hình tốn học mơ tả quy luật ảnh hưởng nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin tỷ số dung môi / da cá đến hiệu suất trích ly collagen; (2) Xác định q trình trích ly collagen từ da cá tra tuân theo quy luật động học bậc hai; (3) Xác định chất collagen tách chiết từ da cá tra đặc tính * Về mặt thực tiễn (1) Đưa giải pháp kỹ thuật hiệu để làm da cá tra trước trích ly cách sử dụng LASNa để loại lipid H2O2 để khử màu da cá với thông số kỹ thuật cụ thể (2) Xây dựng phương trình hồi quy mơ tả quan hệ hiệu suất trích ly collagen với yếu tố ảnh hưởng: nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin tỷ số dung mơi/da cá, từ xác định giá trị tối ưu (3) Xác định điều kiện tốt để loại muối khỏi collagen phương pháp thẩm tích với hiệu suất tách muối cao đạt 95,75% (4) Xác định điều kiện tốt để loại lipid khỏi collagen thành phẩm kỹ thuật trích ly lipid dung mơi CO2 siêu tới hạn (5) Đánh giá đặc tính chất lượng collagen thành phẩm cho thấy sản phẩm phù hợp để dùng làm vật liệu sinh học sử dụng nuôi cấy tế bào vi ABSTRACT Fish skin is the byproduct of fishery companies in the Mekong River Delta Basa fish (Pangasius hypophthalmus) skin contains large amounts of collagen, highly valuable protein in the food, cosmetics and pharmaceutical industries The aims of this thesis "Research on methods of extraction collagen from tra fish (Pangasius hypophthalmus) skin" were as follows: (1) Research on extraction process of collagen from tra fish (Pangasius hypophthalmus) skin; (2) Optimisation and kinetics studies on the extraction of collagen from tra fish skin; (3) Studies on the characterizations of collagen from tra fish skin The thesis presented an overview of the structure, origin and application of collagen; the collagen extraction methods and the theoretical basis of kinetic of solid – liquid extraction Statistical optimization of process conditions using the central composite design (CCD) appeared to be an effective tool for the extraction process of soluble collagen from the fish skin (Pangasius hypophthalmus) Each of the three independent variables (acetic acid concentration, liquid to solid ratio, and pepsin content) showed a significant effect in the yield of extracted collagen The mathematical model gave an R2 of 0,993 and a P value of less than 0,0001, which implied a good agreement between the predicted values and the actual values of the yield of PSC, thus confirmed a good generalization of the mathematical model The optimal conditions to obtain maximum yield of PSC were identified as follows: 0,47 M of acetic acid concentration, 55 mL/g of liquid to solid ratio and 0,49 % of pepsin content Under these optimized conditions, the experimental PSC extraction yield agreed closely with the predicted yield of 92,44 % Kinetic models based on the second order rate equation were successfully developed to describe the extraction process with different processing variables Extraction rate constant, initial extraction rate and equilibrium concentrations of collagen for different acetic acid concentrations, pepsin contents and liquid to solid ratios were predicted The vii model verification showed that the experimental values agreed with the predicted ones, with percentage error differences in the range of 0,18 - 4,05 % The extraction of collagen from basa fish (Pangasius hypophthalmus) skin mainly consists of three phases: Phase 1- Removing fat and pigments: basa fish skin was treated by LASNa 0,5 % to remove fat, during hours and H2O2 % to remove pigments, during hours The compositions of basa fish skin after treatment by LASNa were as follows: hydroxyproline - 13,8 mg/g; moisture - 79,54 %; organic substance - 20,33 %; lipid – 0,98 % and ash – 0,13 %; color parameters obtained as follows: L = 73,065 ± 0,12; a = -3,64 ± 0,11 and b =18,32 ± 0,68 Phase - Extraction of collagen from basa fish skin and fractional precipitation to obtain collagen: Collagen was extracted from basa fish skin with acetic acid - 0,47 M, pepsin - 0,49 % and L/S - 55 ml/g during 24 hours at a temperature of °C, then NaCl was added to a final concentration of 0,9 M in order to precipitate collagen Phase - Refining collagen in two main stages (removing sodium chloride in solution collagen by dialysis and removing lipid by SCCO2) After purification, the compositions of collagen were: 0,159 % of NaCl; 0,1467 % of lipid (by dry weight) The collagen from basa fish skin is identified as type I collagen The collagen consist of three chains as follows: the α chain with molecular weight of about 130 kDa, the β chain with molecular weight of about 250 kDa (as components of two α chain) and the γ chain chain with molecular weight of about 300 kDa (as components of α chain) The denature temperature of collagen is 39 oC The final product’s compositions were: hydroxyproline 97,76 mg/g (corresponding collagen content is 927,7 mg/g); organic compounds 92,8 %; moisture 7,0 %; lipid 0,03 % and ash 0,20 %; without detection of heavy metals (As, Pb) The product met the microbiological standards of Vietnam Pharmacopoeia IV-2009 viii LỜI CÁM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: GS.TS Phan Đình Tuấn PGS.TS Nguyễn Hồng Dũng, người thầy tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận án Xin cảm ơn dự án RBE (Research Based Education)- JICA, thầy PGS.TS Nguyễn Hoàng Dũng, chủ nhiệm đề tài B1-07 “Fish collagen extraction and application” cô PGS.TS Phan Ngọc Hòa chủ nhiệm đề tài B2-06 “Purification collagen from Pangasius hypophthalmus fish skin and application”, GS Shigeru Morimura - cố vấn đề tài, toàn thể thành viên thực đề tài hỗ trợ cho tơi nhiều ý kiến q báu q trình thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ quý báu GS.TS Lê Văn Việt Mẫn, TS Trần Bích Lam, GS.TS Đống Thị Anh Đào, Cơ Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS Mai Thanh Phong, PGS.TS Lê Kim Phụng, TS Hồng Minh Nam, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu thực nghiệm dành cho nhiều ý kiến trao đổi khoa học bổ ích cho luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh, Phịng Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Kỹ thuật Hóa Học Bộ mơn Cơng Nghệ Thực Phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán giảng viên Khoa Kỹ thuật Hóa học & Mơi trường, Ban Giám hiệu Trường Đại học Lạc Hồng tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình vừa công tác vừa thực luận án Tôi xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên giúp đỡ suốt thời gian qua Một lần nữa, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc gởi lời chúc tốt đẹp tới quý thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp, em sinh viên gia đình hỗ trợ, động viên khuyến khích tơi suốt thời gian qua ix MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH xv DANH MỤC BẢNG BIỂU xviii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .xx MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Nguồn gốc, cấu tạo, tính chất ứng dụng collagen 1.1.1 Nguồn nguyên liệu tách chiết collagen 1.1.1.1 Collagen tách chiết từ da bò 1.1.1.2 Collagen tách chiết từ da lợn .3 1.1.1.3 Collagen tách chiết từ cá .4 1.1.2 Cấu tạo phân tử collagen 1.1.2.1 Thành phần amino acid phân tử collagen .5 1.1.2.2 Cấu trúc collagen 1.1.3 Phân loại collagen 10 1.1.3.1 Collagen dạng sợi 10 1.1.3.2 Collagen không dạng sợi 10 1.1.4 Tính chất collagen 12 1.1.4.1 Tính hydrate hóa collagen 13 1.1.4.2 Độ nhớt dung dịch collagen 14 1.1.5 Ứng dụng collagen 15 1.1.5.1 Ứng dụng collagen thực phẩm 15 1.1.5.2 Ứng dụng collagen lĩnh vực vật liệu sinh học 16 x D.1.2 Thẩm tích lần tỉ lệ 1/30 group