Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus)

A PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Collagen loại protein chủ yếu chất ngoại bào mô liên kết [1], [2] Collagen chiếm 30 % tổng lượng protein thể, đóng vai trò then chốt thành phần cấu tạo mô liên kết da, gân, xương, dây chằng, …Collagen loại vật liệu sinh học ứng dụng rộng rãi công nghiệp sản xuất mỹ phẩm, thực phẩm dược phẩm [3], [4] Trước đây, collagen tinh chế từ nguồn nguyên liệu da xương trâu, bò, lợn Từ năm 2000 đến nay, bùng nổ bệnh bò điên, bệnh lở mồm long móng lợn gia súc; thêm vào đó, lý tơn giáo số đạo cấm sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ bò, lợn nên đa số nghiên cứu tách chiết collagen tập trung vào nguồn nguyên liệu thay có nguồn gốc từ thủy sản Việt Nam quốc gia xuất thủy sản lớn giới, chủ yếu mặt hàng phi lê cá tra, cá ba sa Lượng phụ phẩm hai loại cá thải hàng năm lên tới hàng trăm ngàn Tại thời điểm tại, phụ phẩm cá tra, cá ba sa chủ yếu chế biến thành thức ăn gia súc phân bón có giá trị kinh tế thấp Trong đó, da cá tra chứa lượng collagen lớn, sản phẩm có giá trị cao, ưa chuộng thị trường giới, có nhiều ứng dụng công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm vật liệu sinh học Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra nhằm đa dạng hóa sản phẩm có nguồn gốc từ thủy sản, nâng cao giá trị kinh tế loài cá tra, cá ba sa, từ nâng cao thu nhập cho người nuôi trồng chế biến thủy sản cần thiết Mục tiêu luận án Mục tiêu luận án là: (1) Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết collagen xác định giải pháp kỹ thuật để nâng cao hiệu suất thu nhận collagen; (2) Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng động học trích ly collagen nhằm lựa chọn thơng số cơng nghệ thích hợp thơng qua mơ hình hóa động học trích ly để dự đốn hàm lượng collagen theo thời gian trích ly, tăng khả chủ động điều khiển q trình trích ly Những đóng góp luận án (1) Đã xác định quy luật ảnh hưởng nồng độ acid acetic, hàm lượng enzyme pepsin tỷ lệ dung mơi/ da cá đến hiệu suất trích ly collagen (2) Đã xác định q trình trích ly collagen từ da cá tra tuân theo quy luật động học bậc hai Trên sở mơ hình động học bậc hai dự đốn hàm lượng collagen thu theo thời gian trích ly, tốc độ trích ly thời điểm mà hệ trích ly đạt đến cân (3) Đã xác định collagen tách chiết từ da cá tra collagen loại I Đồng thời xác định thành phần acid amin, nhiệt độ biến tính (39 oC) collagen trích ly từ da cá tra Bố cục luận án Luận án có 112 trang, 26 bảng, 34 hình 209 tài liệu tham khảo, bao gồm các phầ n: Mở đầu; Chương 1: Tổng quan; Chương 2: Nguyên và phương pháp liêụ nghiên cứu; Chương 3: Kết và bàn luận; Chương 4: Kết luận và đề xuất; Danh mục công triǹ h đã công bố ; Tà i tham khảo Phụ lục liêụ B NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN Phần tổng quan luận án trình bày tóm tắt cấu tạo, nguồn gốc, vai trò ứng dụng collagen, phương pháp tách chiết collagen từ da cá, nghiên cứu động học trích ly rắn - lỏng, mơ hình động học trích ly sở mơ hình hấp phụ Peleg, mơ hình khuếch tán Fick mơ hình động học bậc hai Trên sở phân tích vấn đề tồn công nghệ tách chiết collagen, tác giả nêu rõ hướng nghiên cứu nội dung nghiên cứu luận án Luận án gồm nội dung sau đây: (1) - Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp để tách tạp chất (protein non – collagen, lipid, chất màu); (2) Tối ưu hóa q trình trích ly nhằm nâng cao hiệu suất trích ly collagen từ da cá; (3) Xác định mơ hình động học trích ly collagen, thơng qua mơ hình dự đốn hàm lượng collagen trích ly theo thời gian, tốc độ trích ly thời gian mà hệ trích ly đạt đến trạng thái cân bằng, từ chủ động điều khiển q trình trích ly theo u cầu; (4) Xác định số đặc tính hóa lý collagen da cá tra CHƯƠNG 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu - Nguyên liệu: Da cá tra thu nhận từ Công ty Cổ phần Thủ y Sản Việt An (QL 91, Khóm Thạnh An, P Mỹ Thới, Tp Long Xuyên, tỉnh An Giang) (cá nuôi tỉnh An Giang đến tuổi thu hoạch) Da sau rửa sạch, làm nước bảo quản túi PE -18oC tủ đông sử dụng - Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trình tách chiết collagen, phân tích hydroxyproline, hóa chất chạy điện di hãng Merck, Biorad, Sigma – Aldrich, Trung Quốc, Ấn Độ Enzym Pepsin (P7000) hãng Sigma -Aldrich có hoạt độ 426 U/mg enzyme 2.2 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu Khảo sát trình loại tạp chất từ da cá tra Quy hoạch cổ điển: Khảo sát trình tách tạp chất ba loại dung môi: NaOH, LASNa ethanol; Khảo sát trình xử lý màu da cá H2O2 - Da cá sau rã đông, rửa sạch, để nước, sau ngâm dung dịch NaOH nồng độ 0,5%; 1%; 1,5%, với tỉ lệ da cá/dung dịch 1:10 (w/v); nhiệt độ trì oC, trình ngâm tiến hành khuấy trộn khoảng 30 phút/ lần Ở nồng độ NaOH, khảo sát trình xử lý da cá h, sau h vớt da cá rửa nước cất da cá đạt pH 7,0 Lấy mẫu để xác định hàm lượng lipid, hàm lượng hydroxyproline, hàm ẩm, độ tro; đồng thời thay dung môi NaOH Tiến hành tương tự với dung dịch LASNa (0,5%; 1%; 1,5%) Đối với dung dịch ethanol trình tách tạp chất diễn tương tự, thay đổi hàm lượng ethanol (5%; 10%; 15%) thời gian khảo sát 48h, đến thời điểm [4, 8, 12, 16, 24, 48] lấy mẫu để xác định hàm lượng lipid, hàm lượng hydroxyproline, hàm ẩm, độ tro - Da cá sau tách béo LasNa rửa sạch, để sau xử lý da cá H2O2 nồng độ 0,5%, 1,0% 1,5% môi trường kiềm NaOH 0,05N; với tỉ lệ da cá/dung dịch (w/v): 1:10; nhiệt độ 4oC Tiến hành lấy mẫu theo thời gian [0,5; 1; 1,5; 2; 3] để xác định độ sáng da cá 2.2.2 Khảo sát q trình trích ly collagen từ da cá tra - Thực thí nghiệm thăm dò để chọn vùng khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình trích ly collagen: Acid acetic (0,25 – 0,75 M); Tỷ lệ dung môi/da cá (20 – 100 ml/g); Hàm lượng enzyme pepsin (0,25-0,85%) - Quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp cấu trúc có tâm với ba yếu tố: nồng độ acid acetic, tỷ lệ L/S, hàm lượng pepsin hàm mục tiêu hiệu suất trích ly collagen- Y (%) để tìm phương trình hồi quy - Tối ưu hóa giá trị yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) - Kiểm tra phù hợp mơ hình với thực nghiệm: tiến hành thí nghiệm lặp lại điều kiện tối ưu tìm theo phương pháp RSM Sai số hiệu suất trích ly theo thực nghiệm với hiệu suất dự đốn theo mơ hình < 5% mơ hình có ý nghĩa 2.2.3 Nghiên cứu động học chế trình trích ly collagen từ da cá tra - Mơ động học q trình trích ly collagen từ da cá theo ba mơ hình động t học trích ly rắn – lỏng: Mơ hình hấp phụ Peleg ( C0= � + ); mơ hình khuếch tán�Fick � ( �� �� = � ); mơ hình động học bậc hai [ �� K +K t dC 2 = k(� -C) ]; Chọn mơ dt � hình động học trích ly collagen phù hợp qua việc so sánh, đánh giá thông số: hệ số tương quan – R2, sai số tồn phương trung bình –RMSD, giá trị sai số phần trăm tuyệt đối trung bình – P (%); Kiểm tra tương thích mơ hình động học trích ly collagen chọn với thực nghiệm 2.2.4 Khảo sát trình tinh collagen - Khảo sát trình loại muối phương pháp thẩm tích chế độ tĩnh chế độ khuấy trộn Thời gian khảo sát: 72h, với tỷ lệ dung dịch collagen/ dung dịch đệm acetic 0,1 M 1/10, 1/30, 1/50; sau 36 h tiến hành thay dung dịch đệm Đo hàm lượng NaCl môi trường đệm theo thời gian để xác định thời điểm hệ collagen/ dung dịch đệm đạt trạng thái cân - Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu suất tách lipid dung môi CO2 trạng thái siêu tới hạn (SCCO2): Áp suất dòng: 100, 200, 300 bar, Lưu lượng dòng: 5, 10, 15 g/phút; Nhiệt độ dòng: 34, 38, 42 oC; Hàm lượng ethanol: 5, 10, 15 (%) 2.2.5 Xác định tính chất hóa lý collagen thành phẩm - Xác định số tiêu hóa lý sản phẩm collagen; Xác định thành phần cấu tạo chuỗi collagen phương pháp điện di; Xác định nhiệt độ biến tính sản phẩm collagen phương pháp đo độ nhớt; Xác định cấu trúc sợi collagen phương pháp SEM, TEM FTIR; Phân tích thành phần acid amin sản phẩm collagen; Phân tích hàm lượng asen chì sản phẩm collagen; Kiểm nghiệm số tiêu vi sinh sản phẩm collagen 2.3 Phương pháp phân tích - Xác định hàm lượng collagen gián tiếp thông qua việc định lượng hydroxyproline theo Ignat’eva N,Y cộng sự; Điện di theo phương pháp SDS- PAGE Laemmli; Xác định cấu trúc collagen phương pháp chụp SEM, TEM phân tích phổ FTIR 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Tất thí nghiệm thực lần lặp lại để tính giá trị trung bình, xử lý thống kê phần mềm Excel 97-2003, phần mềm Design Expert (Sofware Version 10, Stat-Ease Inc), phần mềm thống kê R-3.2.2 CHƯƠNG 3.1 3.1.1 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát trình tách tạp chất từ da cá tra Khảo sát trình tách tạp chất từ da cá tra NaOH, LASNa Ethanol Bảng 3.1 trình bày kết so sánh ba loại dung dịch ngâm da cá (NaOH, LASNa ethanol) mức độ thất collagen (tính theo hàm lượng hydroxyproline) hiệu suất tách lipid Sử dụng LASNa 0,5% để xử lý da cá thời gian tiếng cho kết tốt nhất; thành phần da cá sau xử lý có hàm lượng HP: 13,8 mg/g; độ ẩm: 79,54%; lipid: 0,98% tro: 0,13% Bảng 3.1 Hiệu suất tách hydroxyproline, lipid tro xử lý da cá tra NaOH, LASNa ethanol điều kiện tốt Lipid Tro Hydroxyproline Thời Hiệu suất (%) (%) (%) gian xử Dung dịch lý (h) 0,5 65,26 55,56 31,84 NaOH 1,0 78,06 64,44 37,1 (%) 1,5 47,2 84,44 10,07 0,5 84,84 71,11 15,75 LASNa 1,0 71,41 60 24,79 (%) 1,5 65,16 48,89 14,59 61,41 44,44 21,37 12 Ethanol 10 42,5 26,67 7,51 (%) 15 49,69 44,44 17,77 3.1.2 Xử lý màu da cá tra H2O2 Kết xử lý màu H2O2 điều kiện nồng độ H2O2 1%, thời gian xử lý cho kết tốt nhất, thơng số biểu thị độ trắng sáng: L = 73,065 ± 0,12; a = -3,64 ± 0,11 b = 18,32 ± 0,68 Thông số độ sáng da cá tra tương đương với độ sáng sản phẩm gelatin từ da cá đuối (L = 75,93; a = 4,77; b = 27,43) [172], độ sáng da cá tra độ sáng sản phẩm gelatin từ da cá rô phi (L = 92,35; a = - 0,47; b = 2,3) [179] da cá tra có độ sáng cao độ sáng sản phẩm gelatin từ da cá ngừ đại dương (L = 63,60; a = 12,67; b = 37,43), cá hồng (L = 63,57; a = 10,03; b = 30,5), cá mập (L = 41,87; a = 8,0; b =30,87) [172] 3.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hiệu suất trích ly collagen 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ acid acetic đến hiệu suất trích ly collagen Ảnh hưởng nồng độ acid acetic đến hiệu suất trích ly collagen trình bày hình 3.1 cho thấy hiệu suất trích ly collagen tăng dần theo chiều tăng nồng độ acid acetic từ 0,25 M đến 0,55 M; hiệu suất trích ly cao 84,81 % đạt nồng độ acid acetic 0,55 M; nhiên tiếp tục gia tăng nồng độ acid acetic khoảng từ 0,55 M ÷ 0,75 M hiệu suất trích ly có xu hướng giảm dần Vì vậy, khảo sát sau chọn nồng độ acid acetic thay đổi từ 0,25 M - 0,75M 3.2.2 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi : da cá (L/S) đến hiệu suất trích ly collagen Hình 3.2 cho thấy, hiệu suất trích ly collagen tăng dần theo gia tăng tỷ số dung môi/ da cá; Tuy nhiên tỷ số L/S > 60ml/g mức độ gia tăng hiệu suất trích ly khơng đáng kể tỷ số L/S cao gây hao tốn nhiều dung môi cho q trình trích ly chúng tơi chọn tỷ số L/S khoảng từ 20-60ml/g cho nghiên cứu sau 100 80 60 40 20 3.2.3 Hiệu suất trích ly collagen (%) Hiệu suất trích ly collagen (%) Hình 3.1 Hiệu 100 suất trích ly collagen nồng độ acid acetic khác đạt sau 24h với 80,89 84,81 76,20 90 72,38 80 60,24 70 56,82 60 50 40 30 20 10 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 Acid acetic (M) 66,77 20 75,52 84,81 86,63 40 60 80 Tỷ số L/R (ml/g) 89,21 100 Hình 3.2 Hiệu suất trích ly collagen sau 24 h tỷ lệ L/S khác nhau; nồng độ acid acetic 0,55M hàm lượng pepsin 0,5% Ảnh hưởng hàm lượng pepsin đến hiệu suất trích ly collagen Hình 3.3 cho thấy, hiệu suất trích ly tăng theo gia tăng hàm lượng pepsin; nhiên hàm lượng pepsin > 0,75%, tiếp tục tăng hàm lượng pepsin hiệu suất trích ly tăng khơng đáng kể, đồng thời giá thành enzyme pepsin cao nên Hiệu suất trích ly collagen (%) chúng tơi chọn khoảng khảo sát enzyme pepsin từ 0,25-0,75% cho nghiên cứu sau 100 80 60 40 20 90,99 91,34 73,22 78,24 88,08 0,35 0,45 0,55 0,65 Hàm lượng pepsin (%) 0,75 0,85 84,95 55,14 0,25 Hình 3.3 Hiệu suất trích ly collagen sau 24 h hàm lượng pepsin khác nhau; nồng độ acid acetic 0,55M tỷ số L/S 60 ml/g 3.3 3.3.1 Tối ưu hóa q trình trích ly collagen phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng phần mềm Design Expert 10 Phân tích thống kê dự đốn phương trình hồi quy Tiến hành quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp quay bậc hai Box – Hunter, dạng cấu trúc có tâm với hàm mục tiêu hiệu suất trích ly collagen, Y (%) Ba yếu tố khảo sát là: Nồng độ acid acetic: X1[0,25; 0,75]; tâm X1 = 0,5M; Hàm lượng enzyme pepsin: X2 [0,25; 0,75]; tâm X2 = 0,5%; Tỷ lệ L/S: X3 [20; 60]; tâm X3 = 40 ml/g Phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng yếu tố đến hiệu suất trích ly collagen có dạng sau: Y = -32,46 + 204,97 X1 + 1,22 X3 -71,78 X1X2 – 0,76 X1X3 – 0,43 X2X3 – 135,17 2 (3.1) �1 – 100,38 �2 – 4,44 �3 3.3.2 Tối ưu hóa giá trị yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM-CCD) Từ phương trình hồi quy 3.1, tiến hành tối ưu hóa hiệu suất trích ly collagen theo phương pháp RSM-CCD, sử dụng phần mềm Design expert 10: mơ hình dự đốn hiệu suất trích ly collagen cao 92,44% đạt nồng độ acid acetic 0,474M, hàm lượng pepsin 0,494% tỷ lệ L/S 55,247ml/g Hình 3.4 a,b,c 0,75M); thời gian 0- 24 giờ, với hàm lượng pepsin 0,5% tỷ lệ L/S 60 ml/g - Xác hệ số k, h, Ce phụ thuộc vào tỷ lệ L/S (R) hàm lượng enzyme pepsin (E) theo cách tương tự acid acetic 3.4.5 Kiểm tra phù hợp mơ hình động học bậc hai với thực nghiệm Kết xác định hàm lượng collagen từ thực nghiệm hàm lượng collagen tính từ phương trình dự đốn (3.5) nồng độ acid acetic 0,474M; tỷ lệ lỏng/rắn 55,247 ml/g; hàm lượng pepsin 0,494% theo thời gian trích ly Mức độ chênh lệch số liệu tính tốn thực nghiệm dao động khoảng 0,33 % – 4,39 % (với độ tin cậy 95 %); điều cho thấy phương trình dự đốn tương thích tốt với thực nghiệm Phương trình (3.5, 3.9, 3.13) dùng để dự đốn hàm lượng collagen theo thời gian trích ly nồng độ acid acetic, hàm lượng enzyme pepsin, tỷ số L/S vùng khảo sát 3.5 3.5.1 Khảo sát trình tinh collagen Khảo sát trình thẩ m tí ch muố i khỏ i dung dich collagen loaị bằng mà ng cellulose – RCDMB Đồ thị hình 3.8 trình bày thay đổi hàm lượng NaCl trường hợp môi trường đệm khuấy trộn lần thứ với tỉ số dung dịch collagen/dung dịch đệm 1/10, 1/30 1/50 (ml/ml) cho thấy, hàm lượng muối NaCl môi trường dung dịch đệm tăng dần theo thời gian thẩm tích ba tỉ số Theo kết phân tích phương sai phương pháp Tukey (Phụ lục D.1.1; D.1.2; D.1.3) q trình thẩm tích đạt trạng thái cân tỉ số 1/10, 1/30, 1/50 thời điểm 32 giờ, 28 24 Hàm lượng NaCl (%) 0,16 1/10 0,12 1/30 0,08 1/50 0,04 0,00 1216202428323640 Thời gian (h) Hình 3.8 Sự gia tăng hàm lượng NaCl mơi trường thẩm tích theo thời gian tỉ số collagen/dung dịch đệm khác (Thẩm tích lần thứ nhất) Hàm lượng NaCl (%) Đồ thị hình 3.9 trình bày thay đổi hàm lượng NaCl trường hợp môi trường đệm khuấy trộn lần thứ hai với tỉ số collagen/dung dịch đệm (ml/ml) 1/10, 1/30, 1/50 Tương tự trình thẩm tích lần thứ nhất, nồng độ muối mơi trường đệm tăng theo thời gian tiến hành thẩm tích; nhiên tốc độ tách muối NaCl từ dung dịch collagen môi trường đệm acid acetic 0,1M qua lớp màng membrane tỉ số có khác biệt đáng kể Q trình thẩm tích đạt trạng thái cân tỉ số 1/10, 1/30, 1/50 thời điểm 28 giờ, 24 16 (Theo kết phân tích phương sai phương pháp Tukey - Phụ lục D.2.1; D.2.2; D.2.3) 0,16 1/10 0,12 1/30 0,08 1/50 0,04 0,00 12 16 20 24 28 32 36 40 Thời gian (h) Hình 3.9 Sự gia tăng hàm lượng NaCl môi trường thẩm tích theo thời gian tỉ số collagen/dung dịch đệm khác (Thẩm tích lần thứ hai) 3.5.2 3.5.2.1 Tá ch lipid bằ ng CO2 siêu tớ i haṇ (SCCO2) Ảnh hưởng áp suất dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid Hiệu suất (%) 100 80 60 40 20 (a) 100 200 300 Áp suất (bar) 79,80 76,79 55,75 Hình 3.10 (a) - Ảnh hưởng áp suất dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)Hình điện di SDS-PAGE mẫu collagen Cột 0- collagen trước trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau trích ly lipid áp suất tương ứng 100, 200 300 bar, cột - protein chuẩn Kết phân tích phương sai phương pháp Tukey - Phụ lục E.1, khác biệt hiệu suất tách lipid áp suất 200 bar 300 bar khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0.109 > 0.05); đồng thời kết điện di hình 3.10 (b) cho thấy vạch γ mẫu collagen sau trích ly lipid mờ dần theo gia tăng áp suất áp suất 300 bar vạch γ hẳn Do chúng tơi chọn áp suất dòng CO2 200 bar để thực nghiên cứu 3.5.2.2 Ảnh hưởng lưu lượng dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid Kết trình bày hình 3.11(a) cho thấy hiệu suất trích ly lipid tăng theo gia tăng lưu lượng dòng CO2; nhiên theo kết phân tích phương sai phương pháp Tukey - Phụ lục E.2, khác biệt hiệu suất tách lipid lưu lượng 10 g/phút 15 g/phút khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0.1772 > 0.05); đồng thời kết điện di hình 3.11 (b) cho thấy khơng có khác biệt cấu trúc thay đổi lưu lượng dòng CO2 Do chúng tơi chọn lưu lượng dòng CO2 10 g/phút để thực nghiên cứu Hiệu suất (%) 100 80 60 40 20 (a) 77,32 80,42 50,43 10 15 Lưu lượng CO2 (g/phút) Hình 3.11 (a)- Ảnh hưởng lưu lượng dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)Hình điện di SDS-PAGE mẫu collagen Cột 0- collagen trước trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau trích ly lipid lưu lượng dòng CO2 tương ứng 5, 10 15 g/phút, cột - protein chuẩn 3.5.2.3 Hiệu suất (%) 100 80 60 40 20 Ảnh hưởng nhiệt độ dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid 87,90 76,79 61,07 (a) 34 38 42 Nhiệt độ dòng CO2 (oC) Hình 3.12 (a)- Ảnh hưởng nhiệt độ dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)Hình điện di SDS-PAGE mẫu collagen Cột - collagen trước trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau trích ly lipid nhiệt độ dòng CO2 tương ứng 34, 38 42oC, cột - protein chuẩn Kết trình bày hình 3.12 (a) cho thấy hiệu suất trích ly lipid tăng theo gia tăng nhiệt độ dòng CO2 Tuy nhiên kết điện di hình 3.12 (b) cho thấy xuất vệt mờ đậm dần (phía hai chuỗi α1, α2) theo chiều nhiệt độ gia tăng, điều chứng tỏ có phân cắt phân tử collagen nhiệt độ trích ly tăng; đặc biệt nhiệt độ 42 oC vệt mờ đậm nhất, tương ứng với mức độ phân cắt phân tử collagen cao Do đó, để hạn chế mức độ phân giải collagen mà đạt yêu cầu hiệu suất trích ly lipid, chúng tơi chọn lưu lượng dòng CO2 10 g/phút để thực nghiên cứu 3.5.2.4 Ảnh hưởng hàm lượng chất trợ dung môi- ethanol đến hiệu suất tách lipid Hiệu suất (%) Kết trình bày hình 3.13 (a) cho thấy hiệu suất trích ly lipid tăng theo gia tăng hàm lượng ethanol, nhiên theo kết phân tích phương sai phương pháp Tukey - Phụ lục E.4, khác biệt hiệu suất tách lipid hàm lượng ethanol 10 15% khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0.927 > 0.05) Thêm vào đó, kết điện di hình 3.13 (b) cho thấy xuất vệt mờ đậm dần (phía hai chuỗi α1, α2) theo chiều gia tăng hàm lượng ethanol, điều chứng tỏ có phân cắt phân tử collagen sử dụng ethanol làm dung môi hỗ trợ Mặc dù ethanol hàm lượng 10% gây phân giải collagen mức độ nhẹ (vệt xuất phía hai chuỗi α1, α2 không rõ nét so với chuỗi γ, β, α ); mặt khác bổ sung ethanol làm dung mơi hỗ trợ hiệu suất trích ly lipid tăng lên đáng kể (97,10%) so với trường hợp không sử dụng dung môi hỗ trợ điều kiện (76,79) Do đó, chúng tơi chọn hàm lượng ethanol 10% để thực 100 nghiên cứu 98,07 97,10 95 90 85 82,64 80 75 70 (a) 10 15 Hàm lượng etanol (%) Hình 3.13 (a) -Ảnh hưởng chất trợ dung môi- ethanol đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình điện di SDS-PAGE mẫu collagen Cột - collagen trước trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau trích ly lipid với hàm lượng ethanol tương ứng 5, 10 15%, cột - protein chuẩn Hiệu suất (%) 3.5.2.5 98 96 94 92 90 Khảo sát tốc độ tách lipid theo thời gian điều kiện tối ưu 97,10 97,29 98,69 (a) 30120 60 Thời gian (phút) Hình 3.14 (a) - Kết khảo sát tốc độ tách lipid theo thời gian; (b)- Hình điện di SDS-PAGE mẫu collagen Cột - collagen trước trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau trích ly lipid với thời gian lưu tương ứng 30, 60 120 phút, cột - protein chuẩn Kết trình bày hình 3.14 (a) cho thấy hiệu suất trích ly lipid tăng theo thời gian trích ly; nhiên tốc độ gia tăng chậm theo kết phân tích phương sai phương pháp Tukey - Phụ lục E.5, khác biệt hiệu suất tách lipid thời điểm 30 phút 60 phút khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,689 > 0,05); đồng thời kết điện di hình 3.14 (b) cho thấy gia tăng thời gian trích ly, chuỗi γ phân tử collagen bị phân giải dần đến thời điểm 120 phút chuỗi γ khơng Do chúng tơi chọn thời gian trích ly lipid hỗn hợp ethanol 10% CO2 siêu tới hạn 30 phút hiệu suất trích ly lipid đạt 97,10% tương ứng với hàm lượng lipid lại collagen 0,1467% ± 0,018 (tính theo trọng lượng khơ) hay (0.03% ± 0,001 tính theo trọng lượng ướt) 3.6 Xác định đặc tính hóa lý collagen thành phẩm 3.6.1 Kết điện di gel polyacrylamide – SDS collagen da cá tra Hiǹ h 3.15 cho thấy mẫu collagen da cá tra (cột 1, 2, 3, 4) bao gồ m chuỗi: α1, α2, β γ Collagen da cá tra có hai chuỗi gần nhau: α2 có phân tử lượng khoảng 110 kDa, α1 có phân tử lượng khoảng 130 kDa; chuỗi α1 có bề dày lớn đậm so với chuỗi α2 Hình điện di collagen da cá tra tương tự hình điện di collagen da cá rơ phi collagen da bê loại I (collagen loại I hãng Sigma dùng làm đối chứng) gel polyacrylamide –SDS theo nghiên cứu Treesin Potaros cộng sự, 2009 [32] Hình 3.15 SDS-PAGE collagen da cá tra cột 1, 2, 3, cột 0- protein chuẩn 3.6.2 Nhiệt độ biến tính collagen từ da cá tra Độ nhớt tương đối Từ đồ thị 3.16, xác định nhiệt độ biến tính collagen 39 oC Nhiệt độ biến tính collagen da cá tra (39 oC) cao collagen da cá balloon (30 oC) số loài cá khác [178] 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 33,5 35,5 36,5 37,5 38,5 39,5 40,5 41,5 42,5 43,5 44,5 47,5 Nhiệt độ (oC) Hình 3.16 Đường cong biến tính nhiệt dung dịch collagen 0,3% 3.6.3 Cấu trúc sợi collagen từ da cá tra Hình thái bề mặt collagen da cá tra cho thấy sợi bó sợi collagen nằm đan xen tạo thành dạng mạng lưới thể rõ ảnh chụp kính hiển vi điện tử qt (SEM) hình 3.17 Hình chụp SEM collagen da cá tra tương tự hình chụp SEM collagen loại I tách chiết từ cá thu đao da bê [191] [192] Hình 3.17 Ảnh SEM chụp cấu trúc collagen tách chiết từ da cá tra Hình 3.18 Ảnh TEM chụp bó sợi collagen tách chiết từ da cá tra Hình chụp TEM collagen tách chiết từ da cá tra cho thấy xếp sợi collagen bó sợi (hình 3.20) Bó sợi gồm có sợi hình trụ có đường kính trung bình khoảng 150 nm, tương tự đường kính sợi collagen bò [193] Hình chụp TEM collagen da cá tra tương tự hình chụp TEM collagen loại I tách chiết từ cá rô phi [194] [195] 3.6.4 Cấu trúc phân tử collagen từ da cá tra Phổ FTIR collagen tách chiết từ da cá tra mơ tả hình 3.19, dải amide A thể tần số giãn nhóm N-H (nằm mạch bên phân tử collagen) liên kết hydrogen với phân tử nước Dao động giãn nhóm N-H tự xảy vùng số sóng 3400 – 3440 cm-1, nhóm NH tham gia tạo liên kết hydrogen với nước, tần số dao động giảm, số sóng < 3400 [196] [197] Amide A collagen da cá tra số sóng 3432 cm-1, nghĩa phân tử collagen có nhóm NH mạch bên không liên kết với nước Amide B biểu thị tần số giãn bất đối xứng nhóm CH2 [176], Amide B collagen da cá tra số sóng 2930 cm-1, tương tự số sóng amid B collagen cá thu đao (2940) [173], cá trôi (2923), cá chép (2925) [174] Amide I (1657 cm-1) biểu thị dao động giãn nhóm C = O liên kết hidrogen với nhóm COO-; amide II (1546 cm-1) biểu thị dao động uốn nhóm NH liên kết với dao động giãn nhóm CN, dao động giãn bất đối xứng nhóm COO , dao động xoắn nhóm CH2; Amide III (1243 cm-1) biểu thị dao động giãn C-O dao động uốn nhóm NH mặt phẳng, dao động liên quan tới tương tác phân tử collagen [198] Tỷ số cường độ tính theo chiều cao đỉnh amide III/chiều cao đỉnh vị trí số sóng 1454 cm-1 dùng để giải thích cấu trúc xoắn ba collagen [199], tỷ số ≈ collagen dạng cấu trúc xoắn ba nguyên thể [200] Đối với collagen da cá tra, tỷ số chiều cao đỉnh vị trí amide III/ chiều cao đỉnh vị trí số sóng 1454 cm-1 1,01; Chứng tỏ, collagen da cá tra giữ cấu trúc xoắn ba Hình 3.19 Phổ FTIR collagen tách chiết từ da cá tra 3.6.5 Thành phần acid amin collagen từ da cá tra Kết phân tích hàm lượng acid amin collagen da cá tra (Pangasius hypophthalmus) cho thấy hàm lượng hydroxyproline 10,54% tương đương với hàm lượng hydroxyproline cá đuối (10,2%) [9], cá hương (Cynoscion acoupa) (10,5%) [201] cao cá nhám đầu đen (8,8%) [202], cá trê (8,6) [203], cá rô phi (8,4) [204] 3.7 Khả ứng dụng collagen da cá tra Với kết phân tích trình bày thấy collagen da cá tra dạng collagen nguyên thể (dạng cấu trúc xoắn ốc nguyên vẹn collagen), có độ tinh khiết cao, có khả phân giải sinh học, tương tự sản phẩm collagen loại I tách chiết từ da bê hãng Sigma Aldrich [208] collagen da cá tra thích hợp dùng làm vật liệu sinh học làm môi trường để nuôi cấy tế bào, collagen loại I đóng vai trò chất gắn với nguyên bào cơ, hạch thần kinh cột sống, tế bào gan, phổi sơ khai, nguyên bào sợi, tế bào màng trong,… [209] CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Trên sở kết nghiên cứu đạt được, rút kết luận sau: * Về mặt học thuật Đã xây dựng mơ hình tốn học mơ tả quy luật ảnh hưởng nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin tỷ số dung môi / da cá đến hiệu suất trích ly collagen; Xác định q trình trích ly collagen từ da cá tra tuân theo quy luật động học bậc hai; Xác định chất collagen tách chiết từ da cá tra đặc tính * Về mặt thực tiễn Đưa giải pháp kỹ thuật hiệu để làm da cá tra trước trích ly cách sử dụng LASNa để loại lipid H2O2 để khử màu da cá với thông số kỹ thuật cụ thể Xây dựng phương trình hồi quy mơ tả quan hệ hiệu suất trích ly collagen với yếu tố ảnh hưởng: nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin tỷ số dung môi/da cá, từ xác định giá trị tối ưu Xác định điều kiện tốt để loại muối khỏi collagen phương pháp thẩm tích với hiệu suất tách muối cao đạt 95,75% Xác định điều kiện tốt để loại lipid khỏi collagen thành phẩm kỹ thuật trích ly lipid dung môi CO2 siêu tới hạn Đánh giá đặc tính chất lượng collagen thành phẩm cho thấy sản phẩm phù hợp để dùng làm vật liệu sinh học sử dụng nuôi cấy tế bào * Đề xuất Để áp dụng quy trình tách chiết collagen vào sản xuất, cần tiếp tục nghiên cứu chuyển quy mô (scale up) nhằm xác định giá trị thông số ảnh hưởng điều kiện thực tế sản xuất 23 Việc mơ hình hóa mô tất công đoạn (từ chuẩn bị nguyên liệu da cá đến sản phẩm cuối cùng) cần thiết để tự động hóa nâng cao hiệu trình Sản phẩm collagen thu thành phần collagen nguyên thể (phân tử lượng khoảng 300 kDa), chứa phân đoạn nhỏ Để tách riêng phân đoạn cần sử dụng màng lọc có kích thước phù hợp trang thiết bị chuyên dụng nhằm thu nhận sản phẩm collagen có phân tử lượng phù hợp ứng dụng lĩnh vực mỹ phẩm, dược phẩm, thực phẩm, với kỳ vọng đem lại hiệu kinh tế cao cho ngành sản xuất collagen ... ba Hình 3.19 Phổ FTIR collagen tách chiết từ da cá tra 3.6.5 Thành phần acid amin collagen từ da cá tra Kết phân tích hàm lượng acid amin collagen da cá tra (Pangasius hypophthalmus) cho thấy... kính sợi collagen bò [193] Hình chụp TEM collagen da cá tra tương tự hình chụp TEM collagen loại I tách chiết từ cá rô phi [194] [195] 3.6.4 Cấu trúc phân tử collagen từ da cá tra Phổ FTIR collagen. .. Hình chụp SEM collagen da cá tra tương tự hình chụp SEM collagen loại I tách chiết từ cá thu đao da bê [191] [192] Hình 3.17 Ảnh SEM chụp cấu trúc collagen tách chiết từ da cá tra Hình 3.18 Ảnh