Nghiên cứu, thu nhận hệ enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA VƯƠNG BẢO THY NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME TIÊU HÓA TỪ NỘI TẠNG CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS) Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm Đồ Uống Mã số: 62540201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT Tp Hồ Chí Minh, 2014 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Người hướng dẫn khoa học 1: TS TRẦN BÍCH LAM Người hướng dẫn khoa học 2: GS.TSKH.VS LƯU DUẨN Phản biện độc lập 1: GS TS ĐẶNG THỊ THU Phản biện độc lập 2: PGS TS TRANG SỸ TRUNG Phản biện 1: GS TS TRẦN THỊ LUYẾN Phản biện 2: PGS TS ĐỒNG THỊ THANH THU Phản biện 3: PGS TS LÊ VĂN VIỆT MẪN Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp ……………………………………………………………… ……………………………………………………………… Vào lúc ngày tháng năm 2014 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Bách Khoa –ĐHQG-HCM [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn “Preparation, purification and properties of lipase from hepatopancreas of Tra (Pangasius hypophthalmus) catfish”, Tạp chí phát triển Khoa Học Cơng Nghệ, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM, tập 14, K3, trang 5-11, 2011 Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn “Properties of digestive enzymes from visceral organs of Tra (Pangasius hypophthalmus) catfish”, Tạp chí phát triển Khoa Học Cơng Nghệ, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM, tập 14, K4, trang 34-43, 2011 Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn “Purification and characterization of proteases from hepatopancreas of Tra (Pangasius hypophthalmus) catfish”, Tạp chí Khoa Học Cơng Nghệ, Bộ Khoa Học Công Nghệ, tập 49, 5A, trang 290-297, 2011 Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn “Thơng số động học tính chất protease tinh từ gan tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus)”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, kỳ tháng 12/2013, trang 60-63, 2013 Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn “Tính chất động học đặc điểm thủy phân lipase tinh từ gan tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus)”, Tạp chí phát triển Khoa Học Công Nghệ, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM, tập 16, K4, trang 85-91, 2013 Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn “Nghiên cứu tách lấy pancreatin từ gan tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus)”, Tạp chí Phân tích Hóa Lý Sinh học, Hội Khoa học Kỹ thuật Phân tích Hố lý Sinh học VN, tập 18 (4), trang 178-186, 2013 Vương Bảo Thy, Phan Trung Thành, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn “Nghiên cứu thu nhận enzym lipase từ gan tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus) phương pháp lọc màng membrane”, Tạp chí Khoa Học Công Nghệ, Bộ Khoa Học Công Nghệ, tập 51 (5C), trang 21-25, 2013 Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme từ gan tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus) phương pháp kết tủa”, Tạp chí Khoa Học Cơng Nghệ, Bộ Khoa Học Công Nghệ, tập 52 (5C), trang , 2014 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu enzyme tiêu hóa lồi cá đặc biệt quan tâm vài thập kỷ vừa qua Do cá sống môi trường nhiệt độ thấp nên để trì sống, chúng cần phải có hệ enzyme tương đối mạnh Trong enzyme nội tạng cá, lipase ngày quan tâm có khả ứng dụng cao y học công nghệ thực phẩm Một số lipase từ nội tạng cá giới nghiên cứu lipase cá mập, cá mòi, cá hồi, cá tráp, cá ngừ vây xanh, cá đối, cá rô, Riêng lipase cá tra (Pangasius hypophthalmus), chưa có nghiên cứu cơng bố Trong đó, lý thuyết, cá tra có mô mỡ phát triển so với loại cá da trơn khác, loài cá enzyme lipase phải đóng vai trò quan trọng q trình trao đổi chất Vì việc thu nhận, tinh nghiên cứu tính chất lipase gan tụy cá tra có giá trị khoa học cần đặc biệt quan tâm So với lipase protease nội tạng cá nghiên cứu nhiều loài protease cá mòi, cá hồi trứng, cá hồi bạc, cá trồng, cá thu Tuy nhiên, cá da trơn Việt Nam số khảo sát chung protease nội tạng chưa có cơng bố phân tích riêng tính chất protease gan tụy cá tra Theo dự báo VASEP (Hiệp hội Chế biến Xuất Thủy sản Việt Nam) đến năm 2015 sản lượng cá tra nguyên liệu khoảng 1,8 triệu riêng phần nội tạng ước tính khoảng 100.000 tấn, nguồn nguyên liệu dồi dào, nhiều tiềm để thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa ứng dụng y học, công nghệ thực phẩm Đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus)” nhằm góp phần giải vấn đề MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định đặc tính phân bố, phân lập xác định tính chất enzyme tiêu hóa nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) Xác định phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ nguồn nội tạng cá tra sẵn có để đưa vào ứng dụng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án enzyme tiêu hóa có quan nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) chủ yếu tập trung vào enzyme lipase protease Phạm vi nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu luận án nghiên cứu đặc điểm phân bố enzyme protease, lipase amylase quan nội tạng; thu nhận, tinh xác định tính chất lipase protease từ nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp nghiên cứu để thực luận án phương pháp nghiên cứu thực nghiệm khoa học kết hợp với phương pháp phân tích lý thuyết tổng hợp tài liệu NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa quan nội tạng cá tra Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra Nghiên cứu tinh xác định tính chất protease gan tụy cá tra Nghiên cứu tinh xác định tính chất lipase gan tụy cá tra Nghiên cứu khả ứng dụng chế phẩm enzyme tiêu hóa Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN Ý nghĩa khoa học Là cơng trình Việt Nam nghiên cứu cách có hệ thống, phân tích chuyên sâu hệ enzyme protease, lipase từ gan tụy cá tra (Pangasius hypophthalmus), đóng góp dẫn liệu khoa học quan trọng hệ enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra Đã xác định đặc điểm cấu tạo tính chất protease lipase từ gan tụy cá tra; đưa điều kiện trích ly phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme gan tụy cá tra phương pháp kết tủa phương pháp lọc màng; đề xuất phương pháp tinh protease lipase từ gan tụy cá tra Ý nghĩa thực tiễn Là cơng trình Việt Nam nghiên cứu thu nhận, tinh enzyme tiêu hóa từ nguồn phế liệu nội tạng ngành chế biến cá tra (Pangasius hypophthalmus), góp phần làm phong phú thêm nguồn thu chế phẩm enzyme nói chung protease, lipase nói riêng Chế phẩm enzyme từ nội tạng cá tra ứng dụng có hiệu cao sản xuất pepton, hỗ trợ tiêu hóa Kết nghiên cứu giải pháp thiết thực từ thực tế sản xuất ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm có giá trị gia tăng từ nguồn phế liệu cá, góp phần phát triển bền vững công nghiệp cá tra Việt Nam BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 120 trang bao gồm: Mở đầu trang; Chương 1: Tổng quan 28 trang; Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 14 trang; Chương 3: Kết bàn luận 73 trang; Kết luận kiến nghị trang, 150 tài liệu tham khảo Trong luận án có 24 bảng, 62 hình đồ thị CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá Hiện nay, nghiên cứu hệ tiêu hóa lồi cá nói chung cá da trơn nói riêng chủ yếu tập trung vào việc khảo sát thói quen ăn uống chúng Ngoại trừ enzym pepsin từ dày cá nhiều tác giả giới nghiên cứu thu nhận, tinh sạch, xác định tính chất đưa vào ứng dụng, hiểu biết hệ enzyme tiêu hóa từ tụy tạng cá hạn chế Nghiên cứu protease tụy tạng cá cho thấy protease kiềm, có hai loại protease trypsin chymotrypsin Trypsin enzyme giống trypsin có hoạt độ protease tinh định tính số lồi cá như: cá mòi, cá ốt vảy nhỏ, cá tuyết đảo băng, cá tuyết Đại Tây Dương, cá hồi trứng, cá hồi Đại Tây Dương, cá hồi bạc, cá trồng Ngoài trypsin chymotrypsin, nghiên cứu đặc biệt quan tâm đến protease kiềm từ nội tạng cá Nghiên cứu enzyme protease hệ tiêu hoá loài cá khác cho thấy serine protease từ cá tương tự với enzyme động vật máu nóng kích thước phân tử, thành phần acid amin nhạy cảm với chất có tác động ức chế serine protease Một số lipase từ nội tạng cá khác nghiên cứu lipase cá mập, cá tuyết, cá tráp, cá đối, cá rơ Jonh S Patton tìm thấy hai loại lipase gan tuỵ dạng hoạt hoá cá mập, loại lipase hoạt hoá muối mật đặc hiệu cho acid béo khơng bão hồ vị trí tính đặc hiệu nhóm cho ester Lie Lambertsen cho thấy enzyme lipase thu từ cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua) thuỷ phân chủ yếu PUFA cho thấy chúng có tính đặc hiệu acid béo hồn toàn đối lập với enzyme lipase vi sinh vật Alberta N.A Aryee thu nhận phân đoạn lipase từ nội tạng cá đối (Mugil cephalus) Poonsuk Prasertsan khảo sát hoạt độ lipase đối tương nghiên cứu nội tạng loại cá ngừ Nguồn enzyme tiêu hóa tiềm từ nội tạng cá tra Cá tra (Pangasius hypophthalmus) lồi cá có giá trị kinh tế cao Việt Nam Riêng phần nội tạng, phế liệu ngành chế biến cá tra, ước tính khoảng 100.000 tấn/ năm Đây nguồn nguyên liệu dồi dào, nhiều tiềm để thu nhận enzyme tiêu hóa lipase, protease ứng dụng y học, cơng nghệ thực phẩm Việc thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra đánh giá mang tính khả thi cao có điểm mạnh như: (1) nội tạng cá tra nguồn nguyên liệu giàu enzyme; (2) trữ lượng nguồn nguyên liệu nước ta lớn; (3) có sở lý thuyết enzyme tiêu hóa, ứng dụng kỹ thuật đại nghiên cứu thu nhận enzyme từ nội tạng cá tra; (4) giá trị sản phẩm cao; (5) dự đốn nhu cầu sử dụng enzyme tiêu hóa tăng cao tương lai; (6) khác với tụy tạng lợn, bò hay gia cầm, sử dụng chế phẩm enzyme từ cá không gặp cản trở tôn giáo hay dịch bệnh 1.2 Phƣơng pháp thu nhận tinh enzyme từ nội tạng cá Cho đến chế phẩm enzyme tiêu hóa chủ yếu thu nhận tinh theo phương pháp truyền thống qua công đoạn trích ly, kết tủa tinh Nhưng xu hướng để thu nhận enzyme công nghiệp phương pháp lọc màng (membrane) Ưu điểm phương pháp lọc màng gây nhiễm mơi trường phương pháp kết tủa truyền thống khơng sử dụng hóa chất muối trung tính hay dung mơi hữu aceton, ethanol, isopropanol (thể tích gấp - lần thể tích dịch enzyme) để kết tủa enzyme Nhược điểm phương pháp lọc màng kích thước phân tử phân riêng giao động khoảng lớn, phương pháp lọc màng khơng tách riêng hồn tồn protein Kỹ thuật lọc màng ứng dụng hiệu công nghiệp thu nhận chế phẩm thô, hiệu việc thu nhận chế phẩm tinh khiết 1.3 Ứng dụng enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá Các enzyme tiêu hóa thu nhận từ nội tạng cá nghiên cứu ứng dụng xử lý thịt, trích ly dầu cá từ nguyên liệu thô, sản xuất acid béo ω-3 dạng concentrate, dùng làm enzyme chống oxy hóa, tách loại da cá, tinh trứng cá, tách bỏ vỏ động vật có vỏ, sản xuất nước chấm từ cá, sản xuất thức ăn gia súc từ cá, sản xuất protein thủy phân từ cá, tận thu hợp chất màu từ phế phẩm động vật có vỏ, khử mùi oxy hố sữa CHƯƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) công ty chế biến thủy sản Vĩnh Long cung cấp Ngay sau giết mổ, nội tạng bảo quản -20 C để hạn chế biến tính enzyme 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp xác định đặc điểm phân bố enzyme nội tạng Nguyên liệu nội tạng chia thành loại sau: (1) gan tụy, (2) ruột, (3) nội tạng hỗn hợp pH trích ly từ 6-11 Các enzyme khảo sát: lipase, protease amylase Mục tiêu: chọn thành phần nội tạng, pH trích ly tối ưu để hoạt độ protease, lipase, amylase tính 1g chất khơ ngun liệu cao Phương pháp trích ly enzyme từ nội tạng cá tra Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hòa tan enzyme: (1) tỷ lệ nguyên liệu/dung môi từ 1/1 – 1/5; (2) nhiệt độ từ - 45 C; (3) thời gian từ 0,5 – 2,5 Hàm mục tiêu: hoạt độ, hoạt độ riêng protease, lipase/g chất khô nguyên liệu cao Phương pháp lọc màng thu nhận protein enzyme Trong dịch trích ly enzyme thơ, ngồi enzyme có chất hòa tan, protein tạp, hạt lipid…Để thu nhận enzyme, sử dụng kết hợp 02 kỹ thuật lọc màng là: (I) vi lọc (MF) với màng 0,1 μm (II) siêu lọc (UF) Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình lọc UF: (1) nồng độ chất tan dòng nhập liệu với tỷ lệ pha lỗng dịch enzyme từ 1/1 -1/3; (2) áp suất lọc từ -8 psi; (3) thời gian lọc từ 90 -150 phút Hàm mục tiêu: hiệu suất thu hồi độ tinh củ sau lọc UF đạt giá trị cao Phương pháp kết tủa thu nhận protein enzyme Từ dịch trích ly enzyme thơ, sử dụng tác nhân dung mơi hữu (aceton, ethanol, isopropanol) muối amoni sulfate bổ sung vào dịch enzyme để kết tủa protein Ứng với tác nhân kết tủa, khảo sát (1) tỷ lệ dung mơi dịch trích enzyme từ 1/1 – 5/1 (v/v) (2) nồng độ bão hòa muối amoni sulfate từ 40 – 80% bổ sung vào dịch enzyme Hàm mục tiêu: chọn tác nhân cho hiệu suất thu hồi cao để thu nhận chế phẩm enzyme; chọn tác nhân cho độ tinh cao để tiếp tục tách riêng enzyme tinh Phương pháp tinh enzyme Chế phẩm enzyme thô gồm hỗn hợp nhiều enzyme, thông thường phải kết hợp 2-3 phương pháp tinh 0mới tách riêng enzyme Sử dụng kết hợp phương pháp như: (1) Thẩm tích để loại muối chất có phân tử lượng nhỏ; (2) Sắc ký trao đổi ion; (3) Sắc ký lọc gel Sephadex Trong nghiên cứu này, enzyme chọn tinh thẩm tích; sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose; sắc ký lọc gel Sephadex G-75/ G-100 Mục tiêu: thu nhận protease/ lipase tinh từ hỗn hợp enzym ban đầu Phương pháp xác định tính chất enzyme tinh Các enzyme tinh xác định thành phần cấu tạo, phân tử lượng; xác định thông số động học pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, độ bền pH, độ bền nhiệt theo thời gian, chất làm tăng làm giảm hoạt độ enzyme; xác định giá trị Km Vmax Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme Chế phẩm enzyme ứng dụng sản xuất pepton, hỗ trợ tiêu hóa 2.3 Cơng thức tính tốn Hoạt độ riêng số đơn vị hoạt độ enzyme tính 1mg protein chế phẩm Hoạt độ tương đối tỷ lệ phần trăm hoạt độ enzyme lại hoạt độ enzyme ban đầu Hiệu suất thu hồi tỷ lệ tổng hoạt độ enzyme thu sau trình tinh tổng hoạt độ enzyme mẫu trước đem tinh Độ tinh tính theo tỷ lệ hoạt độ riêng enzyme thu sau trình tinh hoạt độ riêng mẫu enzyme trước đem tinh Sử dụng phần mềm Stargaphic Plus 4.0 để xử lý thống kê CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa nội tạng cá tra 3.1.1 Tỷ lệ khối lượng thành phần nội tạng cá tra Nội tạng cá tra theo kết nghiên cứu, chiếm tỷ lệ khối lượng 5,83%, cao so với cá ngừ (5,44%) thấp so với cá thu (8%) nghiên cứu khác, nội tạng loại cá phế liệu ngành chế biến thủy sản nghiên cứu tận thu enzyme 14 Kết bảng chọn thời gian lọc 120 phút Hiệu trình lọc UF tinh lipase thể bảng Bảng 6: Hiệu suất thu hồi độ tinh lipase sau lọc UF Công Nồng độ Hoạt độ Hoạt độ Tổng Hiệu suất Độ tinh đoạn protein lipase riêng lipase hoạt độ thu hồi Xử lý (mg pr/ml) (U/ml) (U/mg pr) lipase (U) (%) (lần) 0,1 µm 0,79 a 0,42 b UF 20,15 b 22,22 a 25,47 b 8060 100 52,70 a 7466 92,6 2,07 Trên bảng 2, 3, 4, 5, 6, chữ số khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức p < 0,05 Kết chọn thơng số q trình lọc UF phân đoạn 10 KDa tỷ lệ pha loãng dịch enzyme/nước cất 1/3, áp suất lọc 6psi, thời gian lọc 120 phút Bên cạnh mạnh phương pháp lọc màng thiếu sót như: (1) pha lỗng dịch enzyme gây bất lợi cho qua trình tạo chế phẩm; (2) phương pháp có hiệu cao trình tinh enzyme lipase Trong protease dịch enzyme đáng quan tâm Do đó, nội dung thí nghiệm tiếp theo, chúng tơi nghiên cứu tinh protease lipase theo phương pháp kết tủa truyền thống 3.4 Khảo sát trình kết tủa enzyme Khảo sát trình kết tủa với loại tác nhân là: amoni sulfate, ethanol, aceton isopropanol với nồng độ tỷ lệ khác bổ sung vào dịch enzyme Đánh giá hiệu suất thu hồi độ tinh enzyme tác nhân kết tủa Kết nghiên cứu cho thấy với tác nhân kết tủa amoni sunfate, chọn nồng độ muối amoni sulfate bão hòa 60% cho hiệu suất thu hồi độ tinh protease, lipase cao Với tác nhân kết tủa ethanol, chọn tỷ lệ ethanol/ dịch trích ly 3/1 (v/v) Với tác nhân kết tủa aceton, chọn tỷ lệ aceton/dịch trích ly 4/1 Với tác nhân kết tủa isopropanol, chọn tỷ lệ isopropanol/dịch trích ly 4/1 cho hiệu kết tủa tốt 15 So sánh kết phương pháp kết tủa 90.0 88.0 86.3 b a 86.0 2.97 84.0 b 2.15 c 81.71 82.0 80.0 1.94 a Hiệu suất thu hồi (%) 90.72 92.0 ab 88.54 bc 86.67 cd 1.89 d 2.04 bc SA SA+ Ethanol aceton thaå m tích tác nhân kết tủa isopropanol Hiệu suất thu hồi protease (%) Độ tinh 91.43 92.00 90.00 a b 88.33 88.00 3.07 86.00 2.21 84.00 82.00 b 84.40 a c Hiệu suất thu hồi (%) Hình 1: So sánh hiệu suất thu hồi độ tinh protease tác nhân kết tủa bc 88.80 ab 87.78 bc cd 1.87 d 80.00 SA SA+ Ethanol aceton thẩ m tích thu hồi lipase (%) Hiệu suất isopropanol tác nhân kết Độ tủatinh Hình 2: So sánh hiệu suất thu hồi độ tinh lipase tác nhân kết tủa Trên hình 1,2, chữ số khác hệ trục thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức p < 0,05 Từ kết hình 1-2 chọn phương pháp kết tủa ethanol cho hiệu suất thu hồi cao để sản xuất chế phẩm enzyme; chọn phương pháp kết tủa amoni sunfate cho độ tinh cao để nghiên cứu tiếp thu nhận protease, lipase tinh Chế phẩm enzyme có hoạt độ protease: 49,26 U/g chế phẩm; Hoạt độ riêng protease 1,42 U/mg protein; Hoạt độ lipase: 587,85 U/ g chế phẩm; Hoạt độ riêng lipase: 16,91 U/mg protein 3.5 Nghiên cứu tinh xác định tính chất protease gan tụy Kết khảo sát cho thấy trình tinh protease từ dịch trích ly enzyme bao gồm bước sau: (1) kết tủa phân đoạn muối amoni sunfate 60% nồng độ bảo hòa; (2) thẩm tích màng cellophane 12 KDa; (3) tinh sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose; (4) kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex G-75 Kết sắc ký đồ thể hình 3, 6.0 Hàm lượng protein (mg/ml) 0.25 0.20 0.15 0.10 NaCl 0.3 M 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.05 0.00 43 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 0.0 phân đoạn (3ml/ống) Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ protease (U/ml) Hình 3: Sắc ký đồ trao đổi ion protease gan tụy cá tra cột DEAE-cellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 0-0,3M Từ kết hình cho thấy mẫu enzyme sau qua cột phân tách thành peak lớn số peak nhỏ, peak có diện tích lớn thể hoạt độ protease gồm 15 phân đoạn (ống 15-29) với hoạt độ 17 protease cao 4,86 U/ml; kiểm tra 15 phân đoạn hoạt độ lipase, kiểm tra độ tinh phương pháp chạy điện di gel SDS-PAGE cho thấy phân đoạn có hai loại protein có phân tử lượng khác (hình 5) Điều chứng tỏ phương pháp rửa giải theo gradient nồng độ NaCl 0-0,3M thu nhận hỗn hợp gồm loại protease loại lipase Các peak lại hầu hết protein tạp thể hoạt độ lipase, protease thấp Từ kết hình cho thấy mẫu enzyme sau qua cột phân tách thành peak, có peak diện tích lớn thể hoạt độ protease gồm 10 phân đoạn (ống 16-26) với hoạt độ protease cao 2,33 U/ml Vậy sau qua cột sắc ký lọc gel sephadex G75 tách protease khỏi lipase, kết kiểm tra độ tinh phân tử lượng protease thể hình 2.5 Hàm lượng protein (mg/ml) 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 2.0 1.5 1.0 0.04 0.5 0.02 0.00 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 0.0 40 phân đoạn (3ml/ống) Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ protease (U/ml) Hình 4: Sắc ký lọc gel protease gan tụy cá tra Sephadex G-75 Hiệu trình tinh protease thể bảng Kết bảng cho thấy sau trình tinh thu nhận protease có hoạt độ riêng 28,59 U/mg, độ tinh cao gấp 22,41 lần so với dịch enzyme thô Hiệu suất thu hồi protease đạt 23,67% Bảng 7: Tóm tắt q trình tinh protease gan tụy cá tra Cơng đoạn Protein Tổng hoạt tổng độ (U) (mg) * Hoạt độ Độ tinh Hiệu suất riêng thu hồi (U/mg pr) (lần) (%) 202,5 258,3 1,28 1,0 100 Kết tủa 82,35 223,2 2,71 2,12 86,41 Thẩm tích 56,7 201,15 3,55 2,78 77,87 Sắc ký ion 4,59 122,81 26,78 20,99 47,55 2,14 61,14 28,59 22,41 23,67 Enzyme thô DEAE-cellulose Sắc ký lọc gel Sephadex-G75 * Nguyên liệu gan tụy: 50g ** Kết trung bình lần thí nghiệm Kiểm tra độ tinh xác định phân tử lượng protease gan tụy Kết hình xác định protease gan tụy tinh phân tử lượng 31 KDa Hình 5: Kết điện di gel SDS–PAGE Cột b: thang protein chuẩn, cột a: phân đoạn thu từ sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose, cột c: phân đoạn thu từ sắc ký lọc gel Sephadex G75 3.5.3 Xác định số tính chất protease gan tụy tinh 3.5.3.1 Nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt theo thời gian protease 100 H oạ t độ tư ng đố i (% 80 35 độ C 45 độ C 50 độ C 55 độ C 60 độ C 70 độ C 60 40 20 0 15 30 45 Thời gian (phút) 60 90 120 Hình 6: Độ bền nhiệt theo thời gian protease Kết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu protease gan tụy cá tra 0 55 C Theo kết hình 6, nhiệt độ thấp 35-50 C, protease bền nhiệt 0 nhiệt độ cao 55-70 C, nhiệt độ tối ưu 55 C sau thời gian 120 phút hoạt độ protease giảm 43,16% Khi nhiệt độ cao 55 C tốc độ giảm hoạt độ protease nhanh hơn, nhiệt độ 60 C sau 120 phút hoạt độ protease giảm 60,37%, nhiệt độ 70 C sau 15 phút hoạt độ protease giảm 86,42% 3.5.3.2 pH tối ưu độ bền pH theo thời gian protease 105 100 H oạ t độ tư ng đố i 95 pH pH 7.5 pH pH 8.5 pH 90 85 80 75 70 30 60 Thời gian (phút) 90 120 Hình 7: Độ bền pH theo thời gian protease Kết nghiên cứu cho thấy protease gan tụy có pH tối ưu 8,5, ổn định pH 7-9 Theo kết hình 7, sau 120 phút hoạt độ tương đối protease 80% Ở pH sau 120 phút hoạt độ protease giảm 12,84% Ở pH sau 120 phút hoạt độ protease giảm 19,32% Nhìn chung, protease gan tụy cá tra bền pH 7-9 khoảng thời gian 2-3 giờ, phù hợp để nghiên cứu ứng dụng y học làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa 3.5.3.3 Ảnh hưởng số ion kim loại đến hoạt độ protease Kết cho thấy hoạt độ protease gan tụy cá tra bị kìm hãm 2+ 2+ 2+ 2+ ion kim loại nặng Zn , Cu , Mg , kích thích có mặt ion Ca 3.5.3.4 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt độ protease Theo đồ thị Lineweaver- Burk, giá trị Km Vmax protease tinh thủy phân chất BSA xác định với Km = 897 mg/L Vmax = 15,7 mg/L.phút 3.5.3.5 Thành phần acid amin protease gan tụy Từ kết cho thấy protease tinh có 14 loại acid amin với tỷ lệ khác nhau, đó, amino acid có hàm lượng cao serine với 0,714 mg/g, aspartic với 0,651 mg/g, glutamic với 0,416 mg/g, glysine với 0,355 mg/g leucine với 0,303 mg/g 3.6 Nghiên cứu tinh xác định tính chất lipase gan tụy cá tra Khảo sát trình tinh lipase sắc ký trao đổi ion DEAEHàm lượng protein (mg/ml) cellulose kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex G-75 0.25 0.20 0.15 0.10 NaCl 0.3 M 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.05 0.00 6.0 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 0.0 phân đoạn (3ml/ống) Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ lipase (U/ml) Hình 8: Sắc ký đồ trao đổi ion lipase gan tụy cá tra cột DEAEcellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 0-0,3M Từ kết hình cho thấy mẫu enzyme sau qua cột phân tách thành peak lớn số peak nhỏ, peak có diện tích lớn thể hoạt độ lipase gồm 15 phân đoạn (ống 15-29) với hoạt độ lipase cao 5,67 U/ml; kiểm tra 15 phân đoạn hoạt độ protease, kiểm tra độ tinh phương pháp chạy điện di gel SDS-PAGE cho thấy phân đoạn có hai loại protein có phân tử lượng khác (hình 10) Điều chứng tỏ phương pháp rửa giải theo gradient nồng độ NaCl 0-0,3M thu nhận hỗn hợp gồm loại lipase loại protease Tiếp tục nghiên cứu tách riêng lipase khỏi hỗn hợp sắc ký lọc gel Sephadex G-75 6.0 Hàm lượng protein (mg/ml) 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 5.0 4.0 3.0 0.06 2.0 0.04 1.0 0.02 0.00 7Hàm10 16 (mg/ml) 19 22 lượng13protein 40 25 31 (U/ml) 34 Hoạt 28 độ lipase 37 0.0 phân đoạn (3ml/ống) Hình 9: Sắc ký lọc gel lipase gan tụy gel Sephadex G75 Từ kết hình cho thấy mẫu enzyme sau qua cột phân tách thành peak lớn, có peak diện tích lớn thể hoạt độ lipase gồm phân đoạn (ống 4-12) với hoạt độ lipase cao 5,17 U/ml Kết kiểm tra độ tinh xác định phân tử lượng lipase phương pháp điện di gel SDS-PAGE thể hình 10 Hiệu trình tinh lipase thể bảng Kết bảng cho thấy sau trình tinh thu nhận lipase có hoạt độ riêng 509,71 U/mg, độ tinh cao gấp 37,95 lần so với dịch enzyme thô Hiệu suất thu hồi lipase đạt 40,08% Bảng 8: Tóm tắt q trình tinh lipase gan tụy cá tra Công đoạn Protein * Tổng hoạt Hoạt độ Độ tinh Hiệu suất tổng độ riêng thu hồi (mg) (U) (U/mg pr) (lần) (%) 202,5 2719,8 13,43 1,0 100 Kết tủa 82,35 2493,45 30,28 2,25 91,68 Thẩm tích 56,7 2293,2 40,44 3,01 84,32 Sắc ký ion 4,59 1735 378,29 28,17 63,79 Sắc ký lọc gel 2,14 1090 509,71 37,95 40,08 Enzyme thô DEAE-cellulose SephadexG75 * Nguyên liệu gan tụy: 50g ** Kết trung bình lần thí nghiệm Kiểm tra độ tinh xác định phân tử lượng lipase gan tụy Kết điện di xác định lipase gan tụy tinh có phân tử lượng 57 KDa Hình 10: Kết điện di gel SDS– PAGE Cột c: thang protein chuẩn, cột b: phân đoạn thu từ sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose, cột a: phân đoạn thu từ sắc ký lọc gel Sephadex G-75 3.6.3 Xác định số tính chất lipase tinh 3.6.3.1 Nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt theo thời gian lipase 120 100 Ho ạt độ tư ơn g đối (% 35 độ C 45 độ C 50 độ C 55 độ C 60 độ C 70 độ C 80 60 40 20 0 15 30 45 Thời gian (phút) 60 90 120 Hình 11: Độ bền nhiệt theo thời gian lipase Kết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu lipase gan tụy 50 C Enzym bền nhiệt độ 35-55 C Theo kết hình 11, nhiệt độ tối ưu 50 C sau thời gian 120 phút hoạt độ lipase giảm 44,7% Khi nhiệt độ cao 0 55 C tốc độ giảm hoạt độ lipase nhanh hơn, nhiệt độ 60 C sau 120 phút hoạt độ lipase giảm 70,61%, nhiệt độ 70 C sau 15 phút hoạt độ lipase giảm 78,68% 3.6.3.2 pH tối ưu độ bền pH theo thời gian lipase 105 100 Ho ạt độ tư ơn g đố i (% 95 90 pH pH 7.5 pH pH 8.5 pH 85 80 75 70 65 60 30 60 Thời gian (phút) 90 120 Hình 12: Độ bền pH theo thời gian lipase Lipase từ gan tụy cá tra họat động thủy phân pH tối ưu pH Mặt khác, kết nghiên cứu độ bền pH enzym cho thấy lipase gan tụy cá tra bền khoảng pH 7-9, thời gian 120 phút 70% hoạt lực, thích hợp để nghiên cứu ứng dụng y học làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa 3.6.3.3 Ảnh hưởng số ion kim loại đến hoạt độ lipase Kết nghiên cứu cho thấy lipase gan tụy cá tra bị kìm hãm 2+ 2+ 2+ ion kim loại nặng Zn , Cu Cd Ngược lại, lipase gan tụy cá tra 2+ tăng hoạt độ môi trường phản ứng diện ion Ca Đặc tính giống lipase gan tụy lồi cá khác Ngồi ra, ion Ca 2+ đóng vai trò 2+ khác phản ứng lipase Vai trò Ca phản ứng với acid béo tự sinh phản ứng để tạo muối 3.6.3.4 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt độ lipase Theo đồ thị Lineweaver- Burk, giá trị Km Vmax lipase tinh thủy phân chất triolein xác định với Km = 1,381 mg/L Vmax = 0,063 mg/L.phút 3.6.3.5 Xác định thành phần acid amin của lipase gan tụy Kết cho thấy lipase tinh có 14 loại acid amin, đó, amino acid có hàm lượng cao aspartic với 0,927 mg/g, glutamic với 0,792 mg/g, serine với 0,489 mg/g threonine với 0,453 mg/g 3.6.3.6 Ảnh hưởng nồng độ NaTC đến hoạt độ lipase gan tụy Kết cho thấy nồng độ muối mật NaTC 0,015M hoạt độ lipase cao nhất, gấp 3,08 lần so với mẫu đối chứng (không bổ sung) 3.6.3.7 Ảnh hưởng loại chất đến hoạt độ lipase gan tụy Kết nghiên cứu cho thấy lipase gan tụy cá tra có tính đặc hiệu chất, thủy phân liên kết ester vị trí 1,3 triolein 3.7 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme 3.7.1 Ứng dụng chế phẩm enzyme sản xuất pepton Kết khảo sát cho thấy sử dụng chế phẩm enzyme thủy phân chất cá tra (phế phẩm), cá thát lát, thịt bò thời gian thủy phân thích hợp Từ kết bảng cho thấy pepton thu cách sử dụng chế phẩm enzyme để thủy phân thịt bò cá thác lác có tỷ lệ Namin/ Ntổng 22,15% 20,97% Các sản phẩm pepton đạt yêu cầu loại pepton-pancreatic (theo Dược điển Việt Nam) Bảng 9: Hàm lượng nitơ tổng nitơ amin pepton Cơ chất thủy phân Cá tra Cá thác lác Hàm lượng nitơ tổng (g/l) 4,57 4,83 Hàm lượng Nitơ amin (g/l) 0,85 1,01 Thịt bò 5,16 1,14 Namin/ Ntổng (%) a 18,53 b 20,97 c 22,15 3.7.2 Khả ứng dụng chế phẩm enzyme hỗ trợ tiêu hóa N tổng (%) 25 20.63 19.78 17.28 14.37 15 12.56 10.79 9.32 10 Enzyplex 8.22 7.12 Tỷ lệ N amin/ 16.54 cá tra cá thác lác thịt bò tơm trứng Hình 17: khả thủy phân chấtchế phẩm enzyme số protein 140 112 120 96 100 80 60 hoạt tính tương đối (%) Hình 13: khả thủy phân chế phẩm enzyme số protein 132 129 126 122 116 97 105 100 100 94 89 87 40 20 dầu mè dầu phộng dầu gấc dầu oliu dầu nành dầu hạt cải dầu dừa loại dầu pancreatin Enzyplex Hình 14: Khả thủy phân chế phẩm enzyme số loại dầu Kết hình 13, 14 cho thấy chế phẩm có khả thủy phân tương đương pancreatin từ tụy lợn (Enzyplex) nên ứng dụng để hỗ trợ tiêu hóa bổ sung vào thức ăn chăn ni, làm dược liệu bào chế thuốc, ứng dụng phòng chống suy dinh dưỡng protein lượng trẻ em KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu chúng tơi có số kết luận sau: Kết nghiên cứu thành phần enzyme quan nội tạng hệ tiêu hóa cá tra (Pangasius hypophthalmus) cho thấy enzyme tập trung nhiều gan tụy với hoạt độ lipase 337,01 U/g chất khô, protease 42,14 U/g amylase 209,85 U/g chất khô Gan tụy cá nguyên liệu khai thác enzyme Điều kiện trích ly enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/2 (w/v), pH8, nhiệt độ C, thời gian Sử dụng phương pháp lọc màng thu nhận chế phẩm lipase từ gan tụy cá tra theo qui trình: lọc dịch trích enzyme qua màng MF 1µm 0,1µm, lọc màng UF 10 kDa để thu enzyme với tỷ lệ pha lỗng dịch enzyme thơ 1/3, áp suất lọc psi, thời gian lọc 120 phút Hiệu suất thu hồi lipase sau lọc UF 90,6%, độ tinh 2,07 lần Chế phẩm có hoạt độ lipase: 22,22 U/ml, hoạt độ riêng lipase: 52,70 U/mg protein Để sản xuất chế phẩm enzyme, tốt sử dụng phương pháp kết tủa ethanol theo tỷ lệ với dịch trích enzyme 3/1 (v/v) Chế phẩm có hoạt độ lipase: 587,85 U/g, hoạt độ riêng lipase: 16,91 U/mg protein, hoạt độ protease: 49,26 U/g, hoạt độ riêng protease 1,42 U/mg protein Hiệu suất thu nhận chế phẩm 8,3% so với nguyên liệu ban đầu (w/w) Để tinh protease lipase từ gan tụy cá tra từ dịch trích ly enzyme thơ, kết tủa enzyme muối amoni sunfate 60% bão hòa, thẩm tích màng cellophane 12kDa loại muối Dùng cột sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose thu phân đoạn chứa hai enzyme protease lipase Tách riêng protease lipase qua sắc ký lọc gel Sephadex G-75 Protease tinh có hoạt độ riêng 28,59 U/mg protein, độ tinh 22,41 lần, hiệu suất thu hồi 23,67% Lipase tinh có hoạt độ riêng 509,71 U/mg protein, độ tinh 37,95 lần, hiệu suất thu hồi 40,08% Protease từ gan tụy cá tra serine protease có phân tử lượng 31 kDa, có tỷ lệ cao serine, aspartic glutamic, pH tối ưu 8,5, bền pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 55 C, kích thích có mặt ion Ca 2+ hãm ion Cu , Zn 2+ 2+ bị kìm với chất BSA có Km = 897mg/L Vmax = 15,7 mg/L.min Lipase từ gan tụy cá tra lipase có hoạt độ cao ổn định, phân tử lượng 57kDa, có tỷ lệ cao aspartic glutamic, pH tối ưu 8, 2+ nhiệt độ tối ưu 50 C, tăng hoạt độ có mặt ion Ca bị kìm hãm 2+ 2+ ion Cd , Zn , hoạt động tốt nồng độ muối mật NaTC 0,015M, thủy phân liên kết ester vị trí 1,3 glyceride, với chất triolein có Km = 1,381mg/L Vmax = 0,063 mg/L.min Chế phẩm pancreatin từ gan tụy cá tra có khả ứng dụng sản xuất pepton chất thịt bò cá thác lác, đạt tỷ lệ Namin/ Ntổng 22,15% 20,97%, đạt yêu cầu loại pepton-pancreatic (theo Dược điển Việt Nam); chế phẩm enzyme từ gan tụy cá có đặc tính thủy phân loại protein chất béo tương đương pancreatin từ tụy lợn nên sử dụng làm dược liệu bào chế thuốc ứng dụng phòng chống suy dinh dưỡng trẻ em KIẾN NGHỊ - Trên sở kết nghiên cứu đạt được, đề xuất hướng nghiên cứu sau: - Về lý thuyết cần nghiên cứu làm rõ cấu trúc phân tử protease lipase gan tụy cá tra (Pangasius hypophthalmus) - Về thực tiễn cần tiếp tục nghiên cứu sản xuất chế phẩm lipase từ gan tụy cá tra công nghệ lọc màng quy mô công nghiệp - Nghiên cứu sản xuất protease, lipase tinh từ gan tụy cá tra quy mô lớn - Nghiên cứu bổ sung tính an tồn, gây dị ứng sử dụng chế phẩm enzyme từ gan tụy cá tra làm dược liệu hỗ trợ tiêu hóa y học ... Kỹ thu t lọc màng ứng dụng hiệu công nghiệp thu nhận chế phẩm thô, hiệu việc thu nhận chế phẩm tinh khiết 1.3 Ứng dụng enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá Các enzyme tiêu hóa thu nhận từ nội tạng cá. .. pháp phân tích lý thuyết tổng hợp tài liệu NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa quan nội tạng cá tra Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra Nghiên cứu tinh xác... để thu nhận enzyme tiêu hóa lipase, protease ứng dụng y học, công nghệ thực phẩm Việc thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra đánh giá mang tính khả thi cao có điểm mạnh như: (1) nội tạng cá