Nghiên cứu hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới GS TS Phan Văn Chi, Viện Công Nghệ Sinh Học, người thầy hướng dẫn nghiên cứu Trong suốt thời gian thực khóa luận GS tận tình hướng dẫn, bảo, định hướng truyền thụ cho kiến thức chuyên môn niềm đam mê khoa học Xin chân thành cảm ơn ông! Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Bích Nhi, TS Lê Thị Bích Thảo góp ý quý báu cho trình làm luận văn chia sẻ chuyên môn kinh nghiệm sống Tôi xin chân thành cảm ơn cán phòng Hoá Sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học bên cạnh động viên chia sẻ ủng hộ suốt thời gian làm việc phòng Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Trƣơng Quốc Phong thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Thực Phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình dạy bảo tạo điều kiện cho hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn anh, chị, em bạn lớp cao học CNSH 2010B bên cạnh giúp đỡ Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân - người động viên, khích lệ chỗ dựa vững cho suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 29 tháng 03 năm 2012 Học viên Phạm Đức Đan i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Bản luận văn tốt nghiệp công trình nghiên cứu thực dựa sở nghiên cứu lý thuyết khảo sát thực tế Các số liệu kết luận văn trung thực xác Một phần số liệu công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Hà nội, ngày 29 tháng năm 2012 Học Viên Phạm Đức Đan ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii THUẬT NGỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN viii DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ix MỞ ĐẦU Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GHÉP THẬN VÀ BIẾN CHỨNG THẢI GHÉP 1.1.1 Giới thiệu chung ghép thận 1.1.2 Thải ghép- phân loại chẩn đoán 1.1.2.1 Nguyên nhân chế thải ghép 1.1.2.2 Phân loại thải ghép 1.1.2.3 Thải ghép cấp tính 1.1.2.4 Chẩn đoán thải ghép 1.2 NGHIÊN CỨU HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU 10 1.2.1 Vai trò nước tiểu y học 10 1.2.2 Tính chất thành phần nước tiểu 11 1.2.3 Ưu nhược điểm nghiên cứu nươc tiểu 12 1.2.4.1 Ưu điểm nước tiểu 12 1.2.4.2 Nhược điểm nước tiểu 13 1.2.4 Hệ protein nước tiểu 13 1.3 PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU 14 1.3.1 Các kỹ thuật nghiên cứu proteomics 14 1.3.1.1 Các kỹ thuật phân tách protein 14 1.3.1.2 Khối phổ - Trung tâm proteomics 16 1.3.1.3 Các phần mềm tin sinh học 18 1.3.1.4 Các sở liệu trình tự gen protein 19 1.3.2 Tiếp cận proteomis chẩn đoán bệnh thận 19 1.3.2.1 Xu hướng nghiên cứu 19 1.3.2.2 Proteomics nghiên cứu thải ghép thận cấp tính 20 1.3.2.3 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 22 iii MỤC ĐÍCH CỦA NGHIÊN CỨU 23 Chƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 2.1 VẬT LIỆU 25 2.1.1 Hóa chất 25 2.1.2 Trang thiết bị 25 2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Thu thập mẫu nước tiểu 26 2.2.2 Thu nhận hệ protein nước tiểu ProteoSpinTM Urine Protein Concentration Micro Kit 27 2.2.3 Xác định hàm lượng protein 27 2.2.4 Điện di SDS-PAGE 28 2.2.5 Điện di 2-DE protein nước tiểu 29 2.2.6 Thủy phân protein enzym trypsin gel 30 2.2.7 Sắc kí đa chiều phân tích khối phổ 30 2.2.8 Nhận diện protein sở liệu SwissProt phần mềm Mascot v1.8 33 2.2.9 Phân loại protein nước tiểu công cụ tin sinh học 34 2.3 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 Chƣơng III KẾT QUẢ 36 3.1 XỬ LÝ MẪU 36 3.2 ĐIỆN DI HAI CHIỀU VÀ NHẬN DIỆN HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU 37 3.2.1 Điện di 2-DE hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính 37 3.2.2 Nhận diện vùng điểm protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính hệ 1D nanoLC MS/MS 39 3.3 PHÂN TÍCH TỔNG THỂ HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU BỆNH NHÂN GHÉP THẬN CÓ BIẾN CHỨNG THẢI GHÉP CẤP TÍNH 40 3.3.1 Phân đoạn hệ protein nước tiểu điện di SDS-PAGE 40 3.3.2 Nhận diện hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính 41 3.3.3 Phân tích hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính nhận diện 43 3.3.3.1 Protein có nồng độ cao nước tiểu 43 3.3.3.2 Protein có nồng độ thấp nước tiểu 46 iv 3.4 XÁC ĐỊNH MỘT VÀI PROTIEN LIÊN QUAN ĐẾN THẢI GHÉP THẬN CẤP TÍNH 49 3.4.1 Beta-2-microglobulin 49 3.4.2 Uromodulin 50 3.4.3 Zinc-alpha-2-glycoprotein 51 Chƣơng IV THẢO LUẬN 53 4.1 LỰA CHỌN MẪU NGHIÊN CỨU 53 4.2 XỬ LÝ MẪU 53 4.3 VAI TRÕ CỦA CÁC CHỈ THỊ SINH HỌC 54 4.4 NƢỚC TIỂU- NGUỒN TÌM KIẾM CHỈ THỊ KHÔNG XÂM LẤN 55 4.5 KỸ THUẬT ĐIỆN DI MỘT CHIỀU, HAI CHIỀU KẾT HỢP KHỐI PHỔ (ESIMS/MS) 56 4.6 XÂY DỰNG BẢN ĐỒ HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU BỆNH NHÂN THẢI GHÉP THẬN CẤP TÍNH 57 4.7 MỘT VÀI PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN THẢI GHÉP THẬN CẤP TÍNH 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 Kết luận 62 Kiến nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 75 v THUẬT NGỮ VIẾT TẮT 1-DE One-dimensional electrophoresis Điện di chiều 2-DE Two-dimensional electrophoresis Điện di hai chiều 2DnanoLC Two-dimensional nano liquid chromatography ACN Acetonitrile chiều Acetonitrile amu Atomic mass unit Đơn vị khối lượng nguyên tử APC Antigen- presenting cells APS Ammonium persulfate Các tế bào trình diện kháng nguyên Ammonium persulfate Da Dalton Dalton DTT Dithiothreitol Dithiothreitol EBI European Bioinformatics Institute Viện Tin sinh học Châu Âu ESI Electrospray ionization Ion hóa phương pháp phun điện FA Formic acid Acid formic HLA Human Leucocyte Antigen Kháng nguyên bạch cầu người HPLC High performent liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HUPO Human Proteome Organization Tổ chức hệ protein người IAA Iodoacetamide Iodoacetamide ICAM-1 Intercellular adhesion molecule Phân tử adhesion gian bào IEF Isoelectric focusing Điện di đẳng điện IPG immobilized pH gradient Gradien pH cố định kDa Kilo Dalton Kilo Dalton vi Sắc kỷ lỏng nano hai chiều kV Kilo Volt Kilo Volt m/z Mass to charge ratio Tỷ lệ khối lượng/điện tích MS Mass spectrometry Khối phổ MS/MS Tandem mass spectrometry Khối phổ liên tục NanoLC Nano liquid chromatography Sắc ký lỏng nano NCBI National Center for Biotechnology Trung tâm quốc gia thông tin Information Công nghệ sinh học PDB Protein data bank Ngân hàng liệu protein pI Isoelectric point Điểm đẳng điện RP Reversed phase Ngược pha SCX Strong cation exchange chromatography Sắc ký trao đổi cation mạnh SDSPAGE Sodium dodecyl sulphate Điện di biến tính gel polyacrylamide gel electrophoresis polyacrylamide TCR T cell receptor Thụ thể tế bào T TEMED Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine TFA Trifluoroacetic acid Axít trifluoroacetic TOF Time-of-Flight Thời gian bay w/v Weight/volumn Khối lượng/thể tích vii DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1: Bảng phân loại thải ghép Bảng 2: Hàm lượng số chất máu nước tiểu 11 Bảng 3: Thành phần dung dịch đệm SDS-PAGE 28 Bảng Các thông số hệ sắc ký lỏng nano 32 Bảng Danh sách protein nhận diện nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính 39 Bảng Danh sách protein nồng độ cao nước tiểu bệnh nhân thải ghép thận cấp tính.44 Bảng Danh sách 132 protein nhận diện nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính 75 viii DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Hình 1: Thận ghép cho bệnh nhân suy thận giai đoạn cuối Hình Các phân tử co-stimulatory APC phối tử chúng tế bào T Hình Các phân tử adhesion gian bào phân tử adhesion tế bào mạch máu Hình Sơ đồ phân tách protein điện di 2-DE 15 Hình Hệ thống sắc ký lỏng nanoLC (Dionex) 16 Hình Sơ đồ cấu tạo đơn giản hệ thống khối phổ 17 Hình Sơ đồ minh họa hoạt động hệ ESI-MS/MS 18 Hình Hệ sắc ký lỏng nano đa chiều kết nối trực tuyến khối phổ QSTAR XL 26 Hình Sơ đồ hoạt động hệ sắc ký lỏng nano da chiều 31 Hình 10 Hình minh họa thông số phần mềm Mascot v1.8 33 Hình 11 Dự đoán chức năng, vị trí protein sở liệu với GO 34 Hình 12 Quy trình phân tích hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính 35 Hình 13 Điện di đồ kết tinh hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính proteospinTM Urine protein Concentration Micro kit 36 Hình 14 : Ảnh điện di chiều hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính 38 Hình 15: Điện di đồ phân đoạn cắt gel 41 Hình 16 Điểm số protein theo thuật toán Mowse với mức ý nghĩa P