Giám sát sự lưu hành của virus cúm mùa tại một số tỉnh miền bắc việt nam,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN PHƢƠNG ANH GIÁM SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA VIRUS CÚM MÙA TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2012 - 2013 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh học HÀ NỘI – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN PHƢƠNG ANH GIÁM SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA VIRUS CÚM MÙA TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2012-2013 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh học NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN LÊ KHÁNH HẰNG PGS.TS KHUẤT HỮU THANH HÀ NỘI - 2015 i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : NGUYỄN PHƢƠNG ANH Đề tài luận văn: “Giám sát lƣu hành virus cúm mùa số tỉnh miền Bắc Việt Nam, 2012-2013.” Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CB130690 Tác giả, Ngƣời hƣớng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 21/10/2015 với nội dung sau: Chỉnh sửa thuât ngữ Chỉnh sửa bảng, hình, biểu đồ Chỉnh sửa tài liệu tham khảo Bổ sung hình ảnh kết nghiên cứu Ngày 30 tháng 10 năm 2015 Giáo viên hƣớng dẫn Tác giả luận văn Nguyễn Phƣơng Anh TS Nguyễn Lê Khánh Hằng CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ii LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Phương Anh xin chịu hoàn toàn trách nhiệm số liệu kết luận văn Tôi xin cam đoan nội dung luận văn kết của tìm tòi, nghiên cứu tham gia trực tiếp trình nghiên cứu Những số liệu, kết luận văn trung thực không chép từ luận văn đề tài trước Luận văn hướng dẫn TS Nguyễn Lê Khánh Hằng PGS.TS Khuất Hữu Thanh HỌC VIÊN Nguyễn Phƣơng Anh iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin trân trọng cảm ơn:  Ban Giám hiệu, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ thực phẩm Viện Đào tạo Sau Đại học, Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội  Ban Giám đốc, Ban chủ nhiệm khoa Virus, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ƣơng Đã tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình học tập Tôi xin gửi tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Lê Khánh Hằng, Phó trưởng Khoa Virus, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương tận tình bảo, dìu dắt truyền đạt cho kinh nghiệm quý báu suốt trình nghiên cứu từ bước đầu tới hoàn thành luận văn, tạo điều thuận lợi để học tập, nâng cao mở rộng kiến thức để có kết ngày hôm Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PSG TS Khuất Hữu Thanh, Phó GĐ Trung tâm Nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội hướng dẫn kiến thức chuyên ngành lòng nhiệt tình suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô giáo Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ thực phẩm cho kiến thức chuyên ngành quý báu tạo điều kiện tuận lợi để hoàn thành khóa học Tôi xin trân trọng gửi lời cám ơn tới PGS TS Lê Thị Quỳnh Mai, Phó Viện trưởng Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, TS Hoàng Vũ Mai Phương, Trưởng Khoa Virus, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương bạn đồng nghiệp công tác Phòng Thí nghiệm Cúm, Phòng thí nghiệm Các tác nhân virus đặc biệt lây truyền từ động vật sang người, Khoa Virus, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương nhiệt tình giúp đỡ ủng hộ suốt trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Gia đình, bạn bè người thân gia đình bên cạnh giúp đỡ, ủng hộ động viên đường nghiệp khoa học để đạt thành ngày hôm Hà Nội, ngày 10 tháng 09 năm 2015 NGUYỄN PHƢƠNG ANH iv MỤC LỤC Trang phụ bìa………………………………………………………………………i Bản xác nhận chỉnh sửa luận văn Thạc sĩ………………………………….……ii Lời cam đoan…………………………………………………………………… iii Lời cảm ơn…………………………………………………………………………iv Mục lục…………………………………………………………….…………… v Danh mục chữ viết tắt…………………………………………………….….vi Danh mục bảng………………………………………………………… … vii Danh mục hình, sơ đồ…………………………………………………….…viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH DỊCH CÚM TRÊN THẾ GIỚI 1.2 TÌNH HÌNH DỊCH CÚM TẠI VIỆT NAM 1.2.1 Dịch cúm mùa 1.2.2 Dịch cúm A/H5N1 1.3 VIRUS CÚM .6 1.3.1 Đặc điểm chung 1.3.2 Hình thái cấu trúc virion virus cúm .7 1.3.3 Cấu trúc phân tử chức 1.3.4 Cơ chế nhân lên virus cúm 11 1.4 SỰ TIẾN HÓA CỦA VIRUS CÚM 12 1.4.1 Sự tiến hóa virus cúm A 12 1.4.2 Sự tiến hóa virus cúm B .13 1.5 BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ SINH BỆNH HỌC BỆNH CÚM 14 1.5.1 Biểu lâm sàng bệnh cúm 14 1.5.2 Sinh bệnh học bệnh cúm 15 1.6 ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM .15 v 1.6.1 Các thuốc kháng virus .15 1.6.2 Dự phòng 17 1.7 CHẨN ĐOÁN VIRUS HỌC 20 1.7.1 Phát virus cúm phƣơng pháp RT-PCR 20 1.7.2 Phƣơng pháp phân lập chủng virus cúm 20 1.7.3 Phƣơng pháp định týp virus .21 1.7.4 Phƣơng pháp xác định trình tự gen (Sequence) .21 1.8 GIÁM SÁT SỰ LƢU HÀNH VIRUS CÚM TẠI VIỆT NAM .22 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 24 2.1.1 Định nghĩa ca bệnh 24 2.1.2 Cỡ mẫu, thời gian địa điểm thu thập 24 2.2 VẬT LIỆU .25 2.2.1 Mẫu bệnh phẩm 25 2.2.2 Các chủng virus cúm 25 2.2.3 Sinh phẩm hóa chất 25 2.2.4 Trang thiết bị dụng cụ 28 2.3 PHƢƠNG PHÁP 28 2.3.1 Phƣơng pháp giám sát virus cúm mùa .28 2.3.2 Qui trình thực xét nghiệm virus cúm 29 2.3.3 Phản ứng di truyền phân tử (RT-PCR) .30 2.3.4 Phân lập virus 32 2.3.5 Định týp virus phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI) 34 2.3.6 Giải trình tự gen .36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 3.1 KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM MẪU BỆNH PHẨM CỦA BỆNH NHÂN HỘI CHỨNG CÚM BẰNG PHƢƠNG PHÁP RT-PCR .41 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ KHUẾCH ĐẠI VIRUS CÚM MÙA TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2012- 2013 45 vi 3.3 ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM MÙA TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2012- 2013 46 3.4 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN CÁC VIRUS CÚM A LƢU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2012-2013 .50 3.4.1 Đặc điểm di truyền protein HA virus cúm A/H1N1pdm09 51 3.4.2 Đặc điểm di truyền protein HA virus cúm A/H3N2 57 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ .64 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxy Ribonucleic ARN Acid Ribonucleic CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm phòng chống kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ) HA Hemaglutination Assay (Phương pháp ngưng kết hồng cầu) HI Hemaglutination Inhibition test (Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu) ILI Influenza like illness (Hội chứng cúm) Kb Kilobase MDCK Madin- Darby Canine Kidney Cells (Tế bào thận chó thường trực) PCR Polymerasa Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase) Pdm Pandemic (Đại dịch) PTN Phòng thí nghiệm QIV Quadrivalent Influenza Vaccine (Vắc xin gồm thành phần virus H1N1, H3N2, B/Yamagata B/Victoria) RNP Phức hợp Ribonucleoprotein TCYTTG World Health Oganization (Tổ chức Y tế Thế giới) viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN virus cúm chức .9 Bảng 1.2 Nguồn gốc virus cúm gây vụ đại dịch cúm kỷ XX- đầu kỷ XXI 13 Bảng 2.1 Số mẫu bệnh phẩm bệnh nhân hội chứng cúm thu thập đƣợc theo địa điểm giám sát, 2012-2013 24 Bảng 3.1 Kết xác định lƣu hành virus cúm miền Bắc Việt Nam, 2012 - 2013 phƣơng pháp RT – PCR……………………………………… … 41 Bảng 3.2 Kết xác định phân týp virus cúm phƣơng pháp RT-PCR 42 Bảng 3.3 Kết phân lập virus cúm mùa Miền Bắc Việt Nam, 2012-2013 45 Bảng 3.4 Kết định týp virus cúm mùa phƣơng pháp HI, 2012-2013 46 Bảng 3.5 So sánh kháng nguyên virus cúm mùa miền Bắc Việt Nam với thành phần vắc xin cúm Bắc Nam Bán cầu theo khuyến cáo CYTTG, 2012-2013 48 Bảng 3.6 Số lƣợng virus cúm A phân tích phân đoạn gen HA .51 Bảng 3.7 Vị trí axit amin thay đổi protein HA virus cúm A/H1N1pdm09, 2012-2013 55 Bảng 3.8 So sánh độ tƣơng đồng axit amin protein HA virus cúm A/H1N1pdm09 virus nghiên cứu chủng dự uyển vắc xin, 2012-2013 55 Bảng 3.9 Vị trí axit amin thay đổi protein HA1 virus cúm A/H3N2, 2012-2013 61 Bảng 3.10 So sánh độ tƣơng đồng axit amin protein HA1 virus cúm A/H3N2 virus nghiên cứu chủng dự tuyển vắc xin, 2012-2013 61 ix 37 McCuller, J., GC Wang, S He and R Webter (1999), “Reassortment and insertion-deletion are strategies for the evolution of influenza B viruses in nature”, J Virol, 73, pp 7343-7348 38 McCullers JA, Saito T, Iverson AR (2004), “Multiple genotypes of influenza B virus circulated between 1979 and 2003”, J virol, 78(23), pp.12817-28 39 Neil RE, Talon J., Palese P (1998), “The influenza virus NEP (NS2 protein) mediates the nuclear export of viral ribonucleoproteins” EMBO J, 7, pp 288-296 40 Nichol KL, Mendelman PM., Mallon KP, Jackson LA, Gorse GJ, et al (1999), “Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial”, JAMA, 282, pp 137-144 41 Pasteur Institute of Iran, I.U Avaiable from: http://www.pasteur.ac.ir/researchDepartment/flu/images/flu_structure.gif&i mgrefurl 42 Q Mai Le, Maki Kiso., Kazuhiko Someya, Yuko T Saika, T Hien Nguyen, Khanh H L Nguyen, N Dinh Pham, Ha H Nguyen, Shinya Yamada, Yukiko Muramoto, Taisuke Horimoto, Ayato Takada, Hideo Goto, Takashi Suzuki, Yasuo Suzuki and Yoshihiro Kawaoda (2005), “Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus” Nature, 437, pp 1108 43 Richardson JC, Akkina RK (1991), “NS2 protein of influenza virus is found in purified virus and pgosphorylated in infected cells” Arch Virol, 116, pp 69-80 44 Rota PA, Wallis TR., MW Harmon, JS Rota, AP Kendal and K Nerome (1990), “Cocirculation of two distinct evolutionary lineages of influenza type B virus since 1983”, Virology, 175, pp 59-68 45 Shaw MW, Xu X., Y Li, S Normand, RT Ueki, et al (2002), “Reappearance and global spread of variants of influenza B/Victoria/2/87 lineage viruses in the 2000-2001 and the 2001-2002 seasons”, Virology, 303, pp 1-8 46 Skehel JJ, Wiley DC (2000), “Receptor binding and membrane fusion in virus entry: The influenza heamagglutinin” Annu Rev Bioche, 69, pp 531569 47 Steinhaer DA , Skehel JJ (2002), “Gennetic of Influenza viruses” Ann Rev Genet, 36, pp 305-332 48 Steinhaer DA (1999), “Role of haemegglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus”, Virology, 258, pp.1-20 49 Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, and Kumar S (2011), “MEGA 5: Molecular Evolutionary Genetics analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods”, Mol Biol Evol, 28, pp 2731-2739 50 Traynor K (2012), “First quadrivalent flu vaccine approved”, Am J Health Syst Pharm, 69(7), pp 538 51 Webster RG, Bean WJ, OT Gorman, TM Chambers and Y Kawaoka (1992), “Evolution and ecology of influenza A virus” Microbiol Rev., 56, pp 152-179 52 Wison IA, Skehel JJ., Wiley DC (1981), “Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at resolution” Nature, 289, pp 366-373 53 WHO (2013), Vaccines http://www.who.int/inflenza/vaccines/en/ 54 World Health Organization (May 01, 2015), “Cumulative number of confirmed human cases of avian influenza A(H5N1) reported to WHO, 2003-2015” http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/EN_GIP_20150501C umulativeNumberH5N1cases.pdf 55 Yasuda J, Nakada S, Kato A, Toyoda T and Ishihama A (1993), “Molecular assembly of influenza virus: Association of the NS2 protein with virion matrix” Virorlogy, 196, pp 249-255 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh kết điện di sản phẩm RT-PCR Kết điện di sản phẩm sàng lọc virus cúm A Kết điện di sản phẩm sàng lọc virus cúm B Kết điện di sản phẩm phân týp virus cúm A/H3N1, A/H1N1pdm09 Phụ lục 2: Hiệu giá HI chủng virus cúm mùa Hiệu giá HI chủng virus cúm mùa, 2012 ( Bộ sinh phẩm 2012-2013 TCYTTG) Kháng huyết chuẩn Kháng nguyên chuẩn A/H1N1pdm A/H3N2 09 B/Brisbane/60/2008 B/Wisconsin/01/2010 (B/Victoria) (B/Yamagata) ≥1280