Nghiên cứu sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn HBsAg sử dụng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn HBsAg sử dụng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm” với mục tiêu: 1.. Đánh giá chất lượng c

Viêm gan virus B (HBV), một căn bệnh diễn biến thầm lặng với cáctriệu chứng mơ hồ nhưng để lại các biến chứng nặng nề như xơ gan, ung thưgan Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) có khoảng 2 tỷ người đã bị lây nhiễmHBV và khoảng 400 triệu người bị nhiễm HBV mãn tính Ước tính mỗi năm

sẽ có thêm từ 10-30 triệu ca nhiễm mới HBV và có khoảng 1 triệu người chếtmỗi năm do bệnh viêm gan B và các biến chứng của nó Việt Nam nằm trongvùng lưu hành cao, tỷ lệ viêm gan B trong quần thể từ 10-15% đặc biệt cónhững vùng lên đến 20% [1, 2]

Được phát hiện bởi Blumberg vào năm 1965, kháng nguyên bề mặt củavirus viêm gan B đã được sử dụng như một dấu ấn của sự nhiễm virus viêmgan B [3] Kháng nguyên này được phát hiện bằng các phương pháp địnhtính, định lượng Xét nghiệm định tính và định lượng HBV được thực hiệnrộng rãi tại các phòng xét nghiệm từ công lập đến tư nhân, với các trang thiết

bị máy móc và hóa chất được cung cấp đa dạng Tuy nhiên độ chính xác và độtin cậy của kết quả xét nghiệm nói chung và xét nghiệm HBV nói riêng là vấn

đề cần được quan tâm Để đảm bảo vấn đề chất lượng xét nghiệm nói chung

và xét nghiệm HBV nói riêng, các phòng xét nghiệm bắt buộc phải xây dựngcho mình một quy trình kiểm soát chất lượng bao gồm cả nội kiểm tra chấtlượng và ngoại kiểm tra chất lượng [4]

Nội kiểm tra chất lượng là các quy trình được cán bộ phòng xét nghiệmthực hiện để giám sát liên tục và nhanh chóng quy trình xét nghiệm Việc nàyđược tiến hành thường quy hàng ngày, việc giám sát thường được sử dụng làdùng biểu đồ Levey-Jennings Thực hiện tốt nội kiểm tra đánh giá chất lượnggiúp phòng xét nghiệm có một kết quả xét nghiệm chính xác hơn

Chương trình đánh giá chất lượng phòng thí nghiệm từ bên ngoài giúpcho các phòng thí nghiệm theo dõi chất lượng một cách có hệ thống ở mức độQuốc gia Giúp cho nhà quản lý biết thực trạng của hệ thống và có các biệnpháp hỗ trợ kịp thời Ngoài ra tham gia chương trình giúp cho các phòng thínghiệm phát hiện các lỗi thông thường, hạn chế sai sót trong các khâu của quátrình xét nghiệm, nâng cao chất lượng xét nghiệm Thông qua chương trình,các phòng thí nghiệm tham gia tạo thành mạng lưới để trao đổi thông tin vàcập nhật các thông tin mới nhất về các vấn đề liên quan đến công tác xétnghiệm (cập nhật các sinh phẩm, các hướng dẫn, quy định mới ) Bên cạnh

đó thông qua các báo cáo tổng kết cho từng vòng của chương trình cũng giúp

Bộ y tế xác định được mức độ tin cậy trong công tác xét nghiệm của cácphòng thí nghiệm từ đó có các chính sách phát triển phù hợp [5]

Các chương trình nội kiểm và ngoại kiểm đã được triển khai tại nhiềuquốc gia trên thế giới với các đơn vị cung cấp có uy tín cao như RCPA (Úc),CLIA (Mỹ), BLQS (Thái Lan)… với đầy đủ các chương trình ngoại kiểm trachất lượng, đáp ứng đầy đủ nhu cầu của phòng xét nghiệm

Trong điều kiện hiện nay của Việt Nam, các chương trình ngoại kiểm

đã từng bước được triển khai song còn bị hạn chế do nhiều yếu tố Một trongnhững yếu tố đó là các bộ mẫu chuẩn, chúng ta phải mua hoàn toàn của nướcngoài nên giá thành còn cao Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

đề tài “Nghiên cứu sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn HBsAg sử dụng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm” với mục tiêu:

1. Nghiên cứu sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn xét nghiệm HBsAg.

2. Đánh giá chất lượng của mẫu huyết thanh chuẩn được sản xuất nhằm ứng dụng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Virus viêm gan B

1.1.1 Một số đặc điểm sinh học của HBV

HBV thuộc họ Hepadnaviridae, một họ gây viêm gan cho nhiều loàiđộng vật HBV là một virus DNA nhỏ với các đặc điểm về siêu cấu trúc, phân

tử, kháng nguyên và sinh học độc đáo, khác biệt với các họ virus đã được biết.Các đặc điểm sinh học đáng chú ý là tính hướng cơ quan (tropism) nổi bật đốivới tế bào gan và có khuynh hướng gây nhiễm virus tồn tại (tình trạng ngườimang mạn tính) [6] HBV là một virus bền vững, nó có thể sống và gây nhiễmtrùng trong vòng 6 tháng ở điều kiện nhiệt độ phòng [7]

1.1.2 Hình thái học và cấu trúc của HBV

 Hình thái học hạt virus hoàn chỉnh

HBV có 3 kiểu hạt trong máu của người nhiễm virus Virus hoàn chỉnh(virion, hạt Dane) có hình cầu, đường kính 42-45nm; các hạt cầu và các dạngsợi nhỏ hơn có đường kính khoảng 22nm chứa các protein và lipit vỏ ngoàiHBsAg [6]

Hình 1.1: Các dạng HBV trong huyết thanh dưới kính hiển vi điện tử

Nguồn: http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/hepb.html

 Cấu trúc của HBV virion [6]

Dùng phương pháp nhuộm âm bản, virion hấp phụ vào các rây của kínhhiển vi điện tử và một cấu trúc hai vỏ của virion hiện rõ

Hình 1.2: Cấu trúc của HBV virion

1.1.3 Thành phần cấu trúc kháng nguyên

hơn những hạt kích thước khoảng 42nm Đó là những virus còn nguyên vẹn

và có khả năng gây nhiễm [7]

 HBsAg: Sự hiện hữu của HBsAg là bằng chứng đầu tiên của nhiễm HBV, nó

xuất hiện trước các bằng chứng về sinh hóa của bệnh gan [8] Huyết thanh củangười mang virus nồng độ cao chứa một lượng khá lớn các hạt không gâynhiễm là các protein HBs dư thừa (HBsAg) Đó là các hạt hình cầu hoặc hìnhsợi Các hạt hình cầu có đường kính 17-25nm, chiếm đa số; chúng có dạngnhư là các túi nhỏ với thành dày độ 4nm và đường kính bên trong từ 10-15nm Các hạt hình sợi (hoặc hình ống) ít hơn, đường kính độ 20nm có chiềudài thay đổi Huyết thanh của người mang HBV với nồng độ virus huyết thấpthường là các hạt cầu HBs và các sợi HBs rất ít hoặc không có Hai cấu trúcvirus phụ này không chứa HBV DNA và vì thế không gây nhiễm [6]

 HBcAg (các hạt lõi trong gan): Các hạt lõi HBV trống không có vỏ ngoài

thường được thấy trong nhân tế bào gan là nơi chúng được tổng hợp và dự trữ(một số hạt lõi có thể được tổng hợp trong bào tương) Có hai loại hạt lõi: hạtlõi trống không chứa DNA và hạt lõi đầy có chứa DNA[6]

 HBeAg: Kháng nguyên này đại diện cho dạng tiết ra của HBcAg xuất hiện

trong quá trình ủ bệnh, giai đoạn tiền triệu và nhiễm trùng cấp Xuất hiện sauHBsAg 2-4 tuần, sự xuất hiện kháng nguyên này trong huyết thanh chỉ ra sựlây nhiễm Sự tồn tại dai dẳng của HBeAg trong huyết thanh sau 3 tháng dẫnđến tăng khả năng viêm gan B mạn tính[6, 8]

1.1.4 Dịch tễ học HBV

Theo WHO (1997), có khoảng trên 2 tỷ người nhiễm HBV trên thếgiới, hơn 350 triệu người mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ungthư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan Người ta ước tính trên thếgiới có hơn 50 triệu người nhiễm HBV mới xảy ra hàng năm [9]

Trên bản đồ dịch tễ của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ dân số ViệtNam mang kháng nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vàohàng các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới, tỷ lệ có HBsAgtrong cộng đồng nói chung vào khoảng 10-20% (Hoàng Thủy Nguyên,Nguyễn Thu Vân, 1992; Phạm Song và cs, 1996) cho thấy nước ta là nước códịch HBV địa phương cao [1, 2].

Căn cứ vào tần suất nhiễm HBV, tỷ lệ nhiễm virus toàn bộ, độ tuổinhiễm virus và cách truyền bệnh chủ yếu, người ta chia thành 3 khu vực với 3mức độ lưu hành rõ rệt: vùng nội dịch lưu hành cao, vùng nội dịch lưu hànhtrung bình và vùng nội dịch lưu hành thấp [9]

- Vùng nội dịch lưu hành cao (high endemic area)

Trong vùng dịch lưu hành cao có ≥ 8% người nhiễm HBV mạn và tronghuyết thanh của đa số người lớn (> 70%) đã chứng tỏ có nhiễm virus trước

đó Những vùng này gồm đa số các nước châu Á, trong đó có Việt Nam (trừNhật và Ấn Độ), châu Phi, Trung Đông, vùng châu thổ Amazon Nam Mỹ…phơi nhiễm HBV trong các vùng dịch lưu hành cao có thể đạt đến 100% [9]

- Vùng nội dịch lưu hành trung bình (intermediate endemic area)

Trong vùng dịch lưu hành trung bình, tần suất của người nhiễm HBVmạn từ 2-7% và 20-50% người lớn đã từng nhiễm HBV Những vùng nàygồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, miền Tây Á, Nhật, Đông Nam châu Âu

và hầu hết miền Trung và Nam Mỹ Trong các vùng này, nguy cơ cuộc sốngtrung bình của những người nhiễm HBV được ước tính từ 20-60% [9]

- Vùng nội dịch lưu hành thấp (low endemic area)

Tần suất người mang HBV mạn dưới 2% và tần suất người lớn đã từngnhiễm virus dưới 20% Những vùng này bao gồm Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc,New Zealand Tần suất của HBsAg từ dưới 0,1% ở Bắc Âu và 1% đến 5% ở

người trong số họ di cư từ các vùng có tần suất cao và trung bình [6].

Hình 1.3: Sự phân bố HBV trên thế giới

Nguồn: http://uscis.gov/graphics/shared/aboutus/statistics/yearbook/2002.pdf

1.1.5 Đặc điểm sinh bệnh học và biện pháp phòng ngừa – điều trị HBV

1.1.5.1 Con đường lây nhiễm

 Lây truyền qua đường ngoài tiêu hoá do tiếp xúc với máu, các vật phẩm của máu (dịch nhiễm virus)

Đây là con đường lây nhiễm thường gặp nhất, cả ở vùng dịch lưu hànhcao và thấp Việc sàng lọc máu hoặc các chế phẩm máu để loại HBsAg vàkhông dùng dung môi là huyết thanh cho vacxin hầu như đã loại bỏ nguyênnhân này ở các nước phát triển Tuy nhiên, các bệnh nhân nhận các yếu tốđông máu đậm đặc vẫn còn nguy cơ nhiễm virus do HBsAg ở mức độ thấp,không phát hiện được[6]

 Lây truyền qua đường sinh dục

Đây là con đường truyền nhiễm HBV đã được chứng minh và thường gặp

ở các nước phát triển nhất là trong nhóm đồng tính luyến ái Ở đường lây nhiễmnày thì nguy cơ nhiễm HBV thường tỷ lệ thuận với số lượng bạn tình và với tìnhtrạng nhiễm giang mai trước đó Sự kết hợp chặt chẽ với giang mai có thể dotính chất gây loét của giang mai, giúp nhiễm HBV hiệu quả hơn [6]

 Lây truyền từ mẹ sang con (truyền nhiễm chu sinh)

HBV được lây truyền chủ yếu trong lúc sinh hơn là lúc lây qua nhauthai Mức độ nặng và tiên lượng của tình trạng lây nhiễm này tuỳ thuộc vàohai yếu tố: mức độ nhân đôi của siêu vi và thời gian bị nhiễm HBV cấp tính ở

mẹ [6]

 Các đường lây truyền khác

Ngoài các đường lây nhiễm trên, HBV còn có thể lây nhiễm quanước bọt, tinh dịch hay lây nhiễm qua da nếu có tổn thương niêm mạc tạivùng tiếp xúc với HBV[6]

1.1.5.2 Chẩn đoán viêm gan B

 Chẩn đoán viêm virus B cấp

Các triệu chứng lâm sàng của viêm gan B thường mơ hồ, không đặchiệu như mệt mỏi, chán ăn, đau cơ… dễ nhầm với các bệnh lý khác Tuynhiên có một số điểm cần được chú ý khi chẩn đoán:

- Có tiền sử truyền máu hay các chế phẩm của máu, tiêm chích, quan hệtình dục không an toàn trong khoảng từ 4 tuần đến 6 tháng [6]

- Lâm sàng: có thể có các triệu chứng chán ăn, mệt mỏi, vàng da, tiểu ítsẫm màu, đau tức vùng gan, nôn, buồn nôn, phân bạc màu [6, 8]

hình, kèm theo có ngứa Tình trạng vàng da thường kéo dài trên 6 tuần, có khi3-4 tháng [6, 8].

- Thể viêm gan tối cấp: Người bệnh có biểu hiện suy gan cấp kèm theocác biểu hiện của bệnh lý não gan

- Cận lâm sàng:

+ AST, ALT tăng cao (thường tăng trên 5 lần so với bình thường)

+ Bilirubin tăng cao, chủ yếu là Bilirubin trực tiếp

+ HBsAg (+) hoặc (-) và anti-HBc IgM (+)

 Chẩn đoán viêm virus B mạn

- HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti HBc IgG (+)

- AST, ALT tăng từng đợt hoặc liên tục trên 6 tháng

- Có bằng chứng tổn thương mô bệnh học tiến triển, xơ gan (được xácđịnh bằng sinh thiết gan hoặc đo độ đàn hồi gan, chỉ số APRI) mà không docăn nguyên khác

1.1.5.3 Chỉ định điều trị

Chỉ định điều trị bằng thuốc kháng virus khi:

- ALT tăng trên 2 lần giá trị bình thường hoặc có bằng chứng xác nhận

có xơ hóa gan tiến triển/xơ gan bất kể ALT ở mức nào

- HBV-DNA ≥ 105 copies/ml (20.000 IU/ml) nếu HBeAg (+) hoặcHBVDNA ≥ 104 copies/ml (2.000 IU/ml) nếu HBeAg (-)

1.1.5.4 Theo dõi điều trị

Cần tư vấn cho bệnh nhân những nguy hiểm của HBV cũng như các giaiđoạn của điều trị nhằm đạt kết quả điều trị tốt nhất Một số điểm cần lưu ý:

- Tuân thủ điều trị: cần tư vấn cho bệnh nhân về lợi ích của việc tuânthủ điều trị và các biện pháp hỗ trợ tuân thủ điều trị

- Tháng đầu tiên sau khi bắt đầu điều trị: theo dõi AST, ALT, creatinine máu

- Sau mỗi 3-6 tháng trong quá trình điều trị: theo dõi AST, ALT,creatinine máu, HBeAg, Anti-HBe, HBV-DNA, có thể định lượng HBsAg.

- Nếu điều trị IFN hoặc Peg IFN: theo dõi công thức máu, glucose máu,ure máu, creatinin máu, chức năng tuyến giáp để phát hiện tác dụng khôngmong muốn của thuốc

- Sau khi ngưng điều trị: Xét nghiệm sau mỗi 3 - 6 tháng: AST, ALT,HBsAg, HBeAg, anti-HBe, HBV DNA để đánh giá tái phát [6, 8]

1.1.5.5 Biện pháp phòng ngừa

 Miễn dịch thụ động

Globulin miễn dịch (Ig – Immunoglobulin) có kháng thể kháng HBsvới hiệu giá cao (Hepatitis B immune globuline, HBIG) có khả năng gây miễndịch thụ động giúp ngăn chặn viêm nhiễm cấp tính và mạn tính nếu chúng ta

sử dụng HBIG ngay trong vòng 7 ngày sau phơi nhiễm HBIG cũng có khảnăng bảo vệ bệnh nhân khỏi tình trạng tái nhiễm HBV sau quá trình cấy ghépgan HBIG cũng được chỉ định cho những trẻ sơ sinh của những bà mẹ mangHBsAg dương tính [8]

 Miễn dịch chủ động:

Miễn dịch chủ động có khả năng tạo miễn dịch cao Vaccine VGB cóthể được sản xuất từ huyết tương của người mang HBsAg dương tính hoặcbằng phương pháp tái tổ hợp sử dụng động vật có vú hoặc nấm men mangplasmid có chứa HBs hoặc chứa gen preS1 và preS2 Gần đây, các nghiên cứudùng kết hợp tiêm chủng chủ động và thụ động cho thấy hiệu quả lên tới 90%.HBIG cùng với vacxin được khuyến cáo dùng trong tất cả các trường hợp nhưthế nhất là đứa trẻ của bà mẹ mang HBsAg (+) [6]

1.1.5.6 Các xét nghiệm chẩn đoán HBV

nghiệm phát hiện HBsAg và các kỹ thuật miễn dịch học để phát hiện khángnguyên và kháng thể của virus Bên cạnh đó kỹ thuật kính hiển vi điện tử cóthể được sử dụng để xác định HBV trong máu hoặc trong sinh thiết các tổchức gan.

 Phương pháp trực tiếp

Là phương pháp phát hiện hạt virus (hạt Dane) hoặc các thành phần cấutrúc của virus Cụ thể là phát hiện: hạt virus, DNA của virus, kháng nguyênHBsAg, kháng nguyên HBeAg, kháng nguyên HbcAg trong tế bào gan (kếthợp với làm sinh thiết gan)

 Phương pháp gián tiếp (phương pháp huyết thanh học)

- Ngưng kết hồng cầu thụ động: kháng nguyên hòa tan được hấp phụ lên bề mặt

những nền mượn như hạt bentonit, hạt latex nhưng thông dụng nhất là hồngcầu cừu Những hạt này ngưng kết với kháng thể nhờ sự hiện diện của khángnguyên dính vào bề mặt chúng Những hạt này khá lớn nên phản ứng dươngtính có thể khám phá bằng mắt thường Nếu dùng hồng cầu làm giá mang khángnguyên thì phản ứng được gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động Để pháthiện kháng nguyên, người ta gắn kháng thể lên nền mượn Khi kháng thể gặpkháng nguyên đặc hiệu, hiện tượng ngưng kết sẽ xuất hiện Loại này được gọi

là phản ứng ngưng kết thụ động ngược, phản ứng ngưng kết thụ động nhạyhơn phản ứng ngưng kết trực tiếp nhờ hình thể tương đối lớn của những hạtmang kháng nguyên và độ đặc hiệu cao hơn vì có thể tinh chế được các khángnguyên hoặc kháng thể trước khi gắn lên nền mượn [10, 11]

- Miễn dịch gắn enzym (ELISA – Enzyme linked immunosorbent assay): Kỹ

thuật này sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên cố định vào một tấmpolystyren Sau đó nó được dùng để bắt kháng nguyên hoặc kháng thể đốiứng ở dung dịch thử nghiệm và phức hợp được phát hiện nhờ enzyme gắn vớikháng thể hoặc kháng nguyên tác động lên cơ chất đặc hiệu Cơ chất của

enzyme thủy phân đo ở quang phổ kế, tỷ lệ với nồng độ của kháng thể hoặckháng nguyên không biết ở trong dung dịch thử nghiệm [12, 13].

- Miễn dịch huỳnh quang: những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein,

Rhodamin có thể kết hợp với kháng thể mà không phá hủy tính chất đặc hiệucủa kháng thể Kháng thể liên hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên

và phức hợp kháng nguyên – kháng thể có thể quan sát ở kính hiển vi huỳnhquang Kháng thể được liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang rồi cho tácdụng với kháng nguyên (phương pháp trực tiếp) hoặc kháng thể được cho tácdụng trực tiếp với kháng nguyên rồi cho kết hợp với kháng globulin ngườiliên hợp với Fluorescein Trước hết cho kháng nguyên cố định lên tiêu bản rồicho tác dụng với huyết thanh bệnh nhân, rửa để loại bỏ kháng thể thừa sau đónhỏ một giọt globulin người gắn Fluorescein rồi quan sát ở kính hiển vi huỳnhquang (phương pháp gián tiếp) [14]

- Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang: Kỹ thuật này được thựchiện trên máy tự động hoàn toàn, nguyên lý như sau:

+ Dùng kháng thể đã biết để phát hiện kháng nguyên chưa biết và ngược lại

+ Dùng hệ thống phát hiện là điện hóa phát quang để nhận biết sự hiệndiện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể

Kỹ thuật bao gồm các phản ứng:

+ Phản ứng miễn dịch: kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể đượcđánh dấu bằng ruthenium Sử dụng sự tương tác của biotin và streptavidin cùngvới các vi hạt có từ tính để gắn phức hợp kháng nguyên-kháng thể (đánh dấubằng ruthenium) vào pha rắn

hợp kháng nguyên- kháng thể đánh dấu bằng ruthenium Dưới tác dụng củađiện, phức hợp ruthenium phản ứng với tripropylamine (TPA) và phát quang.

Kết quả phản ứng điện hóa phát quang là tín hiệu ánh sáng được máyghi nhận và suy ra nồng độ ban đầu của kháng nguyên hoặc kháng thể cótrong mẫu thử Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang sử dụng chất đánhdấu là ruthenium khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học, vìvậy có khả năng phát hiện chất có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh,trong khoảng 18 phút Các kháng thể (hoặc kháng nguyên) gắn biotin vàchất đánh dấu ruthenium cùng vi hạt phủ streptavidin được ủ trong hỗn hợpphản ứng Khi đặt một điện thế lên điện cực buồng đo, phức hợp rutheniumtác dụng với prophylamine, chuyển sang trạng thái kích thích, và tín hiệuphát quang được hình thành Tín hiệu ánh sáng được đo và kết quả xétnghiệm được xác định qua đường chuẩn xét nghiệm đã được thiết lập Mộtđường cong quy chiếu được ghi nhớ trong một thanh đã mã hóa các thuốcthử và được xác định một lần nữa bởi máy phân tích tự động bởi mộtđường chuẩn ở hai điểm [10 , 11 , 15 ]

- Kỹ thuật sắc kí miễn dịch: Phức hợp kháng kháng thể gắn chất màu được

phân bố đều trên bản giấy sắc ký Kháng nguyên đặc thù của vi sinh vật đượcgắn cố định tại “vạch phản ứng” Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thểlên bản sắc ký, kháng thể đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp vớikháng kháng thể gắn màu, phức hợp miễn dịch kháng thể - kháng kháng thểgắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại “vạch phản ứng” dokháng thể kết hợp với kháng nguyên vi sinh vật, kết quả “vạch phản ứng”hiện màu Nếu trong huyết thanh không có kháng thể đặc hiệu, ở “vạch phản

ứng” kháng nguyên không thể giữ được kháng kháng thể gắn màu, vì vậykhông hiện màu [16, 17].

 Nhận định kết quả:

- Kết quả định tính: Kết quả định tính cho biết trong mẫu xét nghiệm có hay

không có kháng thể hoặc kháng nguyên Thông thường kết quả các phản ứngđược ký hiệu bằng các mức độ dương tính (+, + +, + + +) , không rõ dươngtính hay âm tính (+/-), âm tính (-) Các ký hiệu này tuy có tiêu chuẩn quy địnhnhưng phụ thuộc vào chủ quan của người đọc kết quả [18]

- Kết quả định lượng: Chẩn đoán gián tiếp các bệnh nhiễm trùng qua việc xác

định kháng thể trong huyết thanh được gọi là chẩn đoán huyết thanh học Kếtquả định lượng trong chẩn đoán huyết thanh cho biết hiệu giá kháng thể.Nồng độ kháng thể trong huyết thanh cao hay thấp được đánh giá qua hiệu giákháng thể

- Ranh giới hiệu giá: Là ranh giới giữa hiệu giá kháng thể bình thường và hiệu

giá bệnh lý Liên cầu thường cư trú ở hầu hết mọi người nên trong huyếtthanh của hầu hết mọi người đều có kháng thể kháng streptolysin O (ASO)

Vì thế người ta xem 1/200 (200 đơn vị /ml), là hiệu giá ranh giới Chỉ khi nàotrong huyết thanh có 400 đơn vị/ml trở lên mới là bệnh lý

- Kết quả dương tính giả: Hay gặp lúc làm phản ứng huyết thanh học vì kỹ

thuật và trong một vài trạng thái sinh lý bệnh lý của người bệnh

- Kết quả âm tính giả: Có nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tượng âm tính giả

như: các thành phần tham gia phản ứng không được chuẩn độ, lượng khángthể quá nhiều so với kháng nguyên…Để khắc phục hiện tượng dương tính giả,

âm tính giả phải chuẩn độ các thành phần tham gia phản ứng, đảm bảo đúngcác điều kiện của phản ứng (dung dịch đệm, nhiệt độ, thời gian ủ ) và phảiluôn luôn có chứng dương, chứng âm [16]

1.1.5.7 Ý nghĩa xét nghiệm HBsAg định lượng

theo dõi diễn biến tự nhiên và dự đoán hiệu quả điều trị viêm gan B mạn.Mức độ HBsAg huyết thanh ở bệnh nhân có HBeAg dương tính có khuynhhướng cao hơn ở bệnh nhân có HBeAg âm tính Các bệnh nhân viêm gan Bmạn với genotype D ở trạng thái HBeAg âm tính có số lượng HBV DNA thấp(<2000 IU/mL), HBsAg < 1000 IU/mL và ỏ bệnh nhân nhiêm HBV genotype

B hoặc C có HBsAg < 100 IU/mL được xác định là những người mang viruskhông hoạt động (inactive carriers) [19] Trong quá trình điều trị, qHBsAgđược sử dụng một cách hiệu quả để đánh giá đáp ứng điều trị HBV của cácthuốc tiêm như Inteferon (IFN), peginteferon (PEG-IFN) hoặc của các thuốcuống tương tự nucleos(t)ide (NA) qHBsAg cũng có thể được áp dụng để pháthiện các bệnh nhân cần tiếp tục điều trị, các bệnh nhân có triển vọng thải sạchHBsAg và các bệnh nhân ít có khả năng tái phát để dừng hoặc thay thế phác

đồ điều trị Việc định lượng HBsAg giúp các nhà lâm sàng có được các quyếtđịnh điều trị đúng cho bệnh nhân, nâng cao hiệu quả điều trị cũng như tránhđược các diễn biến xấu của nhiễm HBV [20]

1.2 Đảm bảo chất lượng xét nghiệm

1.2.1 Một số khái niệm về chất lượng

• Chất lượng (Quality): Là mức độ của tập hợp các đặc tính vốn có

đáp ứng các yêu cầu

• Quản lý chất lượng (Quality Management-QM): Là một loạt các

hoạt động có phối hợp để định hướng và kiểm soát một tổ chức vềchất lượng Việc định hướng và kiểm soát về chất lượng một tổ chứcnói chung bao gồm: chính sách chất lượng; mục tiêu chất lượng; hoạchđịnh chất lượng; kiểm soát chất lượng; đảm bảo chất lượng và cải tiếnchất lượng

• Kiểm soát chất lượng (Quality Control-QC): Các hoạt động và kỹ

thuật được sử dụng nhằm đáp ứng đầy đủ các yêu cầu chất lượng

• Đảm bảo chất lượng (Quality Assurance-QA): Tất cả các hoạt

động hệ thống được lập kế hoạch thiết yếu nhằm cung cấp độ tin cậy chắcchắn rằng sản phẩm hoặc dịch vụ thỏa mãn các yêu cầu chất lượng

• Đánh giá chất lượng bên ngoài (External Quality EQA): còn được gọi ngoại kiểm hay thử nghiệm thành thạo phòng thí

Assessment-nghiệm Việc xác định hoạt động thử nghiệm của phòng thí nghiệmbằng so sánh liên phòng

• So sánh liên phòng: Việc tổ chức, thực hiện và đánh giá các thử

nghiệm trên cùng một mẫu thử nghiệm hoặc mẫu thử nghiệm tương tựđược thực hiện bởi hai hay nhiều phòng thí nghiệm theo các điều kiệnxác định trước [21, 22]

1.2.2 Giới thiệu về hệ thống đảm bảo chất lượng

Hệ thống quản lý chất lượng (HTQLCL) do Viện tiêu chuẩn phòng thínghiệm và lâm sàng CLSI Hoa Kỳ đề xuất, hệ thống này bao gồm 12 thành

tố cơ bản bao trùm tất cả các hoạt động của phòng thí nghiệm [23 , 24 ]

Mô hình của HTQLCL hoàn toàn phù hợp với các tiêu chuẩn quốc tế(International Organization for Standardization -ISO) ISO 90001/ISO 15189/ISO

17025 Chính vì vậy, Tổ chức Y tế thế giới đã phối hợp với CLSI và CDCHoa Kỳ ban hành cuốn cẩm nang Quản lý hệ thống phòng thí nghiệm để cácphòng thí nghiệm của các nước trên thế giới có thể và áp dụng nhằm nâng caochất lượng [25]

Hình 1.4: Mô hình quản lý chất lượng [ 25 ]

Tổ chức: Để có hệ thống quản lý chất lượng có chức năng tốt,phòng thí nghiệm phải có cơ cấu tổ chức, quản lý nhằm thực hiện được cácchính sách về chất lượng

Nhân sự: Nguồn lực của phòng thí nghiệm là vấn đề quan trọngnhất, đó là những nhân viên đủ năng lực, năng động, có tầm nhìn và điềuquan trọng phải có sự khích lệ thúc đẩy các cán bộ tận tâm với công việc vàtuân thủ các quy định

Thiết bị: Thiết bị phải phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm, các thiết bịđảm bảo hoạt động tốt và có bảo dưỡng định kỳ

Mua sắm và kiểm kê: Quản lý về cung ứng sinh phẩm và vật tưphòng thí nghiệm nhằm đảm bảo các sinh phẩm và vật tư có chất lượng tốt,

sử dụng đúng mục đích

Kiểm soát quá trình: Bao gồm nhiều yếu tố để đảm bảo chất lượng củaphòng thí nghiệm trong quá trình thực hiện xét nghiệm Những yếu tố nàybao gồm kiểm soát chất lượng, thẩm định và công nhận

Quản lý thông tin: Các thông tin phòng thí nghiệm cần được quản lýcẩn thận đảm bảo sự chính xác và bí mật.

Tài liệu và hồ sơ: Tài liệu và hồ sơ luôn được lưu giữ cẩn thận đểđảm bảo sự chính xác và có thể đánh giá được

Quản lý sự cố: Phòng thí nghiệm luôn cần một hệ thống để phát hiệnnhững vấn đề và sự cố, hành động khắc phục, tìm hiểu nguyên nhân và đưa ranhững hành động để không tái diễn các sự cố

Đánh giá: Quá trình đánh giá chính là công cụ để kiểm soát việcthực hiện của phòng thí nghiệm và so sánh với các chuẩn mực để đánh giá

Cải tiến quá trình: Mục đích đầu tiên của HTQLCL là sự cải tiến liêntục các quá trình trong phòng thí nghiệm và sự cải tiến được thực hiện mộtcách hệ thống

Dịch vụ khách hàng: Đảm bảo khách hàng nhận được các dịch vụcần thiết cho họ

Cơ sở vật chất và an toàn: Cơ sở vật chất và an toàn bao gồm nhiều vấn

đề như: An ninh, An toàn, sức khỏe, môi trường làm việc [4, 5, 26, 27]

1.2.3 Sơ đồ hoạt động của phòng xét nghiệm

Hình 1.5: Sơ đồ hoạt động của phòng thí nghiệm [ 25 ]

Hoạt động của một phòng thí nghiệm được chia thành 3 giai đoạn:Giai đoạn trước xét nghiệm, giai đoạn trong xét nghiệm và giai đoạn sauxét nghiệm

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm

 Giai đoạn trước xét nghiệm

Đây là giai đoạn chuẩn bị cho việc làm xét nghiệm, chuẩn bị bệnh nhân,lấy mẫu bệnh phẩm, chuẩn bị thuốc thử Trong giai đoạn này các cán bộ cầnđảm bảo lấy và bảo quản bệnh phẩm đúng quy cách (dụng cụ khô, sạch,dùng chất chống đông thích hợp, ghi đúng tên bệnh nhân trên ống máu, gửikịp thời đến phòng xét nghiệm …) Những sai sót trong quá trình lấy vàbảo quản bệnh phẩm sẽ dẫn đến sai sót trong kết quả xét nghiệm như lấymáu vỡ hồng cầu, đưa m ẫ u máu đến phòng thí nghiệm c h ậ m sẽ làmnồng độ glucose trong máu giảm (mỗi giờ bị giảm 17% do hồng cầu tiêuthụ glucose) Ngoài ra đối với một số xét nghiệm việc biến động sinh lý,biến động giữa các cá thể như di truyền, tuổi tác, giới tính hay biến độngtrong bản thân cá thể như chế độ ăn uống, vận động, nhịp độ sinh học ,

biến động do tình trạng bệnh, biến động do lấy mẫu như vị trí lấy mẫu, thờigian lấy mẫu, điều kiện bảo quản, vận chuyển cũng đều ảnh hưởng đến kếtquả xét nghiệm [4, 21, 22].

 Giai đoạn xét nghiệm

Trong giai đoạn này việc biến động đối với kỹ thuật phân tích ảnhhưởng nhiều đến kết quả xét nghiệm Đó là việc biến động tại các cơ sở xétnghiệm do sai sót của các thiết bị và kỹ thuật, sai số trong phòng thí nghiệmhoặc trình độ tay nghề của cán bộ Những sai sót trong giai đoạn xét nghiệmthường xảy ra khi các đơn vị không có quy trình chuẩn hoặc có nhưngkhông tuân thủ cũng như các trang thiết bị không được hiệu chỉnh định

kỳ Vì vậy, giai đoạn này phòng thí nghiệm cần đảm bảo thực hiện xétnghiệm theo quy trình chuẩn thức phù hợp, nhằm đạt được kết quả với độchính xác cao, đáp ứng yêu cầu xét nghiệm Quy trình thực hiện xét nghiệmphải có tính chuẩn thức, được công nhận và được cập nhật Các quy trìnhphải được viết bằng ngôn ngữ dễ hiểu đối với nhân viên, theo mẫu quyđịnh và luôn được để sẵn trên bàn làm việc để tiện tham khảo Bên cạnh

đó việc đảm bảo chất lượng xét nghiệm cần được thực hiện thông qua việc sửdụng các mẫu nội kiểm tra và tham gia các chương trình ngoại kiểm tra vàđịnh kỳ hiệu chỉnh các trang thiết bị [4, 21, 22]

 Giai đoạn sau xét nghiệm

Sau khi đã hoàn thành xét nghiệm, việc đánh giá và ghi nhận kết quả,gửi trả kết quả đến nơi yêu cầu xét nghiệm là rất quan trọng Việc vào hồ sơxét nghiệm và trả kết quả cần tránh sai sót và chậm trễ, gây tổn hại đến

uy tín của phòng thí nghiệm Trả lời kết quả xét nghiệm cần đảm bảo đủthông tin và được lưu trữ ở phòng thí nghiệm để tiện tham khảo hoặc tracứu khi cần thiết [4, 21, 22]

1.2.5 Các sai số trong phòng xét nghiệm

ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm có thể chia thành các loại sau:

•Sai số thô bạo: thường do lỗi của nhân viên làm xét nghiệm trong

quá trình xử lý mẫu, sử dụng pipet, pha hoá chất thuốc thử, khôngtuân thủ đúng qui trình thao tác, nhầm lẫn dung dịch thuốc thử, tínhtoán sai…

•Sai số ngẫu nhiên: khi ta tiến hành làm một xét nghiệm trong điều

kiện như nhau và lặp lại nhiều lần thì kết quả xét nghiệm không thểcho giá trị như nhau mà có sự phân tán nhiều hoặc ít Sai số nàythường do yếu tố con người, máy móc thiếu bảo dưỡng và nhiễmbẩn Muốn hạn chế sai số này cần trang bị máy có độ chính xáccao và hoá chất có chất lượng tốt, chú ý bảo dưỡng kiểm tra máymóc, thuốc thử

•Sai số hệ thống: là các sai số lặp đi lặp lại trong cách lần thực

hiện Nguyên nhân gây ra sai số hệ thống có thể do máy móc,dụng cụ, hóa chất… dẫn đến kết quả có xu hướng luôn thấp hơnhoặc luôn cao hơn so với trị số mong muốn

Các sai số trên đặc biệt là sai số ngẫu nhiên và sai số hệ thống liênquan chặt chẽ đến độ chính xác và độ xác thực [4]

1.2.6 Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm

1.2.6.1 Khái niệm nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm

Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm (IQC – Internal Quality Control),gọi tắt là nội kiểm tra, là công cụ kiểm tra chất lượng hằng ngày trong nội bộmột phòng xét nghiệm, được thực hiện bởi nhân viên của phòng xét nghiệmnhằm đánh giá liên tục các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm, từ

đó đi đến quyết định liệu kết quả xét nghiệm có đủ tin cậy trước khi trả chobác sỹ lâm sàng hoặc bệnh nhân Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm là mộtphần của kiểm tra chất lượng (QC – Quality Control) nhằm góp phần vàocông tác bảo đảm chất lượng xét nghiệm [4]

1.2.6.2 Các thông số thống kê dùng trong nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm

Phòng xét nghiệm cần tự thiết lập các chỉ số thống kê: trung bình, SD,CV… và giới hạn kiểm soát để đánh giá chất lượng tương ứng với từngphương pháp, thiết bị xét nghiệm Đó là vì khoảng giới hạn kiểm soát đượccác nhà sản xuất đưa ra thường khá rộng và không phù hợp với thực tế củaphòng xét nghiệm, bên cạnh đó còn có sự khác nhau về phương pháp thiết bịcủa phòng xét nghiệm và nhà sản xuất Do đó, để đảm bảo chính xác nội kiểmtra chất lượng xét nghiệm, mỗi một phòng xét nghiệm cần tự xây dựng chomình một hệ thống chỉ số riêng Những thông số được sử dụng để đánh giá độchính xác: Giá trị trung bình (), độ lệch chuẩn (SD), hệ số phân tán (CV%),công thức tính như sau [28]:

Giá trị trung bình: tính theo công thức

= Trong đó: - : trị số trung bình

- xi : trị số thu được của một lần thực nghiệm

- n: tổng số lần thực nghiệm Trị số trung bình là chỉ số thống kê mô tả xu hướng trung tâm của sựphân bố của một dãy số liệu, biểu thị trị số tiêu biểu cho dãy số liệu Bất kỳ sựthay đổi trong tính chính xác chẳng hạn như sự thay đổi có hệ thống hoặc độlệch có thể được phản ánh trong sự thay đổi của giá trị trung bình, điều đó sẽđược thể hiện bởi sự thay đổi của sự phân bố các kết quả kiểm tra [29]

Độ lệch chuẩn SD:

2 1

( X) 1

n i i

x SD

2 1

( i X)

i

x SD

- n: số lượng các giá trị thực nghiệm

Độ lệch chuẩn là chỉ số thống kê mô tả sự phân tán của một dẫy số liệu,phản ánh trung bình khoảng cách của số liệu so với trị số trung bình Trongkhi giá trị trung bình là chỉ số mô tả xu hướng trung tâm, do đó liên quan đến

độ chính xác hoặc sai số hệ thống thì độ lệch chuẩn lại là giá trị đo lườngchiều rộng của sự phân bố và liên quan đến độ phân tán hoặc sai số ngẫunhiên Độ lệch chuẩn càng lớn thì dải phân bố càng rộng, sai số ngẫu nhiêncàng lớn và phương pháp càng thiếu chính xác Độ lệch chuẩn càng nhỏ, dảiphân bố hẹp, sai số ngẫu nhiên nhỏ hơn và độ chính xác cao hơn [29]

Hệ số biến thiên (CV – Coeficient of variation)

CV(%) = Trong đó: - CV là hệ số biến thiên (%)

- SD là độ lệch chuẩn

- là giá trị trung bình

Độ lệch chuẩn thường thay đổi theo nồng tức là nồng độ càng lớn thì độlệch chuẩn càng lớn Khi đó cần dùng hệ số biến thiên để đánh giá độ lệchchuẩn ở mỗi mức nồng độ quan tâm Hệ số biến thiên phản ánh tỉ số giữa độlệch chuẩn và giá trị trung bình, nó cung cấp cách đánh giá hiệu năng phươngpháp tốt hơn ở các khoảng nồng độ khác nhau [29]

1.2.6.3 Một số quy tắc và biểu đồ dùng trong nội kiểm

Biểu đồ Levey - Jennings:

Biểu đồ Levey - Jennings là biểu đồ kiểm soát chất lượng quan trọngnhất được sử dụng trong phòng xét nghiệm Nó có thể dùng để nội kiểm trahoặc ngoại kiểm tra chất lượng đều tốt Biểu đồ Levey - Jennings giúp pháthiện các loại sai số (sai số ngẫu nhiên và sai số hệ thống) Biểu đồ Levey -Jennings được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1952 bởi S.Levey và E.Jennings [23] Biểu đồ Levey - Jennings gồm có:

- Một đường ở giữa biểu đồ tương ứng với giá trị trung bình của các kếtquả xét nghiệm

- Hai đường ngang ở trên và dưới của đường trung bình tương ứng vớiđường giới hạn tin cậy trên ( + 2SD) và đường giới hạn tin cậy dưới ( − 2SD)

- Hai đường ngang trên và dưới của giới hạn tin cậy là đường giới hạnbáo động trên ( + 3SD) và đường giới hạn báo động dưới ( − 3SD) [29]

Quy tắc Westgard và QC đa quy tắc

Quy tắc Westgard được Jame Westgard đề nghị sử dụng Năm 1981,ông đã công bố trên tạp chí Hóa sinh lâm sàng một đề tài về kiểm tra chấtlượng phòng xét nghiệm, ông đưa ra quy tắc để đánh giá kết quả nội kiểm dựatrên biểu đồ kiểm soát chất lượng Levey Jennings [28]

QC đa quy tắc (Multirule QC) sử dụng kết hợp các tiêu chí quyết địnhhoặc các quy tắc kiểm soát để quyết định xem lần chạy phân tích là trong giớihạn hay ngoài giới hạn kiểm soát Chương trình QC đa quy tắc sử dụng phốihợp các quy tắc kiểm soát khác nhau để xét tính chấp nhận được hay khôngcủa lần chạy phân tích [29]

Một số quy tắc Westgard để kiểm định thông dụng nội kiểm tra chấtlượng xét nghiệm được thể hiện ở hình dưới đây

Hình 1.6: Các quy luật Westgard thông dụng

(https://www.westgard.com/mltirule.htm)Trong đó

động

12s Giá trị của một mẫu chứng nằm trên hoặc dưới

Cảnhbáo13s Giá trị của một mẫu chứng nằm trên hoặc dưới

22s

Giá trị của hai mẫu chứng nằm trên hoặc dưới 2SD

(các giá trị liên tục của cùng một mẫu chứng (qua

các lần chạy), trong cùng một lần chạy (qua các

mẫu chứng khác nhau)

SE Loại bỏ

R4s

Một giá trị của mẫu chứng 1 nằm trên 2SD và một

giá trị mẫu chứng 2 nằm dưới 2SD trong cùng một

lần chạy

RE Loại bỏ

41s

4 giá trị liên tục của mẫu chứng nằm trên hoặc

dưới 1SD (trong cùng một chất chứng hoặc các

mẫu chứng khác nhau)

SE Loại bỏ

10x 10 giá trị liên tục của mẫu chứng nằm về một phía

Chú thích: Lỗi hệ thống (SE: Systematic Error)

Lỗi ngẫu nhiên (RE: Random Error)

Ngoài các quy luật kiểm định thông dụng thì để kiểm tra chất lượng củamẫu huyết thanh nội kiểm còn có thể dùng các quy luật mở rộng như luật 6x,8x, 12x,7T,… [30]

1.2.7 Ngoại kiểm tra chất lương xét nghiệm

1.2.7.1 Chương trình ngoại kiểm

Chương trình đánh giá chất lượng phòng thí nghiệm từ bên ngoài(External qualiy assessment schemes –EQAS) hay còn gọi là chương trìnhngoại kiểm là chương trình đánh giá chất lượng các phòng thí nghiệm mộtcác định kỳ và thường xuyên

Tổ chức bên ngoài thường là phòng thí nghiệm chuẩn thức có uy tíncung cấp mẫu tới nhiều phòng thí nghiệm để thực hiện xét nghiệm và phântích, so sánh đánh giá và báo cáo kết quả tới các phòng thí nghiệm đã thamgia EQAS là hệ thống kiểm tra khách quan năng lực kỹ thuật của phòng thínghiệm do tổ chức bên ngoài thực hiện Quy định và tiêu chuẩn trong việc vậnhành và quản lý các chương trình ngoại kiểm theo khuyến cáo của ILAC-G13,

ISO 43-1, ISO 17043 [5, 31].

Phòng thí nghiệm kể cả các đơn vị đã được công nhận bởi các tổ chứccũng cần tham gia vào các chương trình ngoại kiểm, việc tham gia nàynhằm mục đích giúp phòng thí nghiệm so sánh năng lực của mình vớiphòng thí nghiệm khác và kiểm soát để đảm bảo chất lượng quá trình thửnghiệm Nếu những xét nghiệm nào không có sẵn trong chương trình ngoạikiểm trong nước, phòng thí nghiệm có thể tham gia vào các chương trìnhcủa Quốc tế hoặc thực hiện so sánh liên phòng thí nghiệm với các phòng thínghiệm khác Các kết quả đánh giá từ bên ngoài cần phải được lãnh đạophòng thí nghiệm xem xét và lưu hồ sơ, đây là cơ sở để cải thiện chấtlượng của đơn vị [5, 31]

Đánh giá chất lượng từ bên ngoài được sử dụng để mô tả một phương

với các phòng thí nghiệm khác, đánh giá chất lượng từ bên ngoài thuộcphạm trù ngoại kiểm tra nhưng trọng tâm chủ yếu là đánh giá về kết quảxét nghiệm của phòng thí nghiệm này so với các phòng thí nghiệm khác,xét nghiệm cùng một mẫu xét nghiệm với cùng kỹ thuật xét nghiệm.Chương trình ngoại kiểm tra thông thường được tổ chức bởi một phòng thínghiệm chuẩn thức, đơn vị này phân phối mẫu xét nghiệm cho các phòng thínghiệm thành viên cùng tham gia vào chương trình ngoại kiểm tra để làmxét nghiệm, sau đó thu thập các kết quả xét nghiệm để so sánh và đánh giákết quả của các phòng thí nghiệm thành viên Kết quả sai sót ở các phòng thínghiệm sẽ được nhà quản lý điều tra tìm hiểu các điểm không phù hợp và hỗtrợ khắc phục để nâng cao chất lượng Bên cạnh đó cũng khuyến cáo các cơ

sở sử dụng sinh phẩm phù hợp với các yêu cầu về chất lượng, điều kiện (Hình 1.7) Nhằm nâng cao chất lượng xét nghiệm, WHO đã đưa ra nhữnghướng dẫn kỹ thuật để triển khai chương trình ngoại kiểm cho các phòng thínghiệm nói chung và đặc biệt là các phòng thí nghiệm có làm xét nghiệmHBV nói riêng từ nhiều năm nay [32-34 ]

Hình 1.7: Vai trò của các đơn vị tham gia ngoại kiểm 1.2.7.2 Các hình thức ngoại kiểm tra

Có ba phương thức triển khai là thử nghiệm thành thạo (proficiencytesting – PT), kiểm tra lại/phân tích lại (rechecking/retesting) và đánh giátại chỗ (on-site evaluation) Trong đó thử nghiệm thành thạo là phương thứcđược sử dụng phổ biến cho mục tiêu đạt các tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩnquốc tế.

• Thử nghiệm thành thạo (Proficiency testing-PT): là việc xác định

hoạt động thử nghiệm của phòng thí nghiệm bằng so sánh liên phòng.Đơn vị tổ chức gửi các mẫu thử nghiệm giống nhau đến các phòng thí nghiệmtham gia Thử nghiệm thành thạo đánh giá việc thực hiện xét nghiệm của cácphòng thí nghiệm thông qua so sánh liên phòng thí nghiệm, nghĩa là đánhgiá các phòng thí nghiệm trên cùng một mẫu thử nghiệm hay những mẫuthử nghiệm tương tự được phân tích bởi hai hay nhiều phòng thí nghiệmtheo các điều kiện đã xác định trước Những đơn vị triển khai chương trìnhthử nghiệm thành thạo trong lĩnh vực xét nghiệm y khoa trên thế giới hiệnnay thường sử dụng thuật ngữ ngoại kiểm chất lượng (External Qualityassessment – EQA) tương tự như thuật ngữ thử nghiệm thành thạo Thuậtngữ này được giới chuyên môn công nhận và sử dụng một cách phổ biến ởnhiều quốc gia trên thế giới [4, 31]

• Kiểm tra lại (rechecking/retesting): Phòng thí nghiệm lựa chọn mẫu bệnh

phẩm ngẫu nhiễn gửi đến phòng thí nghiệm tham chiếu hoặc đơn vị kiểmchuẩn để phân tích và đánh giá lại các kết quả xét nghiệm mà phòng thínghiệm đã thực hiện

• Đánh giá tại chỗ (on-site evaluation): Đoàn đánh giá được lập bởi cơ quan

có thẩm quyền hoặc các tổ chức được công nhận sẽ đến đánh giá phòng thínghiệm định kỳ hoặc đột xuất Việc đánh giá theo các tiêu chí đã được phêduyệt [5]

1.2.7.3 Mục đích và ý nghĩa của ngoại kiểm tra

nghĩa quan trọng cho các đơn vị tham gia Đảm bảo sự tin cậy cho những người

sử dụng là bệnh nhân và bác sỹ điều trị về kết quả xét nghiệm là chính xác vàđáng tin cậy Đánh giá và so sánh kết quả xét nghiệm của các phòng thí nghiệmkhác nhau ở mức độ khu vực, quốc gia hoặc quốc tế Xác định được những sai

số về kết quả xét nghiệm và đề xuất những biện pháp khắc phục, sửa chữa.Khuyến khích việc sử dụng những phương pháp chuẩn, những sinh phẩm hóachất và máy xét nghiệm chất lượng tốt Tạo điều kiện cho các phòng thí nghiệmtrao đổi thông tin và hình thành mạng lưới các phòng thí nghiệm liên hệ vớinhau ở mức độ quốc gia và quốc tế [5, 25, 35]

Phương pháp thống kê cho phép những phòng thí nghiệm thành viêntheo dõi quá trình cải thiện chất lượng xét nghiệm của đơn vị trong một thờigian nhất định, đồng thời so sánh chất lượng kết quả xét nghiệm của mìnhvới những phòng thí nghiệm thành viên khác [5, 25, 35]

1.2.7.4 Các chương trình ngoại kiểm tra huyết thanh học

Đơn vị triển khai ngoại kiểm (cơ quan/ đơn vị kiểm chuẩn) là một tổchức độc lập có trách nhiệm và vai trò trong việc xây dựng, vận hành chươngtrình ngoại kiểm tra Một số đơn vị triển khai ngoại kiểm trên thế giới đượcbiết đến hiện nay như RCPA (Úc), CLIA (Mỹ), BLQS (Thái Lan), CMPT(Canada), MLE (Châu Âu) với đầy đủ các chương trình ngoại kiểm tra chấtlượng, đáp ứng đầy đủ nhu cầu của phòng xét nghiệm

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam đã thành lập và đưa vào hoạtđộng một số trung tâm ngoại kiểm tra như trung tâm kiểm chuẩn đại học Y HàNội, trung tâm kiểm chuẩn Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, Trungtâm kiểm chuẩn xét nghiệm thành phố Hồ Chí Minh… đã góp phần khôngnhỏ trong công tác đảm bảo chất lượng xét nghiệm với nhiều chương trình

ngoại kiểm tra như chương trình ngoại kiểm tra xét nghiệm sinh hóa, miễndịch, ngoại kiểm tra huyết thanh học (HIV, HBV, HCV, giang mai….).

1.3 Mẫu chuẩn dùng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm

1.3.1 Định nghĩa mẫu chuẩn

Mẫu chuẩn nói ở đây được hiểu như là vật liệu so sánh chuẩn(Certified Reference Materials - CRMs) Theo định nghĩa của tổ chức đolường pháp lý quốc tế (OIML): Mẫu chuẩn là một vật liệu hay một chất màmột hay nhiều tính chất của chúng đủ đồng nhất và được tạo nên để chuẩnhoá một dụng cụ, đánh giá một phương pháp đo hoặc để xác định giá trị đốivới các vật liệu Các giá trị chuẩn trong mẫu chuẩn được tạo nên bởi mộtquy trình kỹ thuật có giá trị và hoàn hảo nhất Mẫu chuẩn được sản xuất ratrong các dạng khác nhau và cho các mục tiêu sử dụng khác nhau [5, 25, 35]

Độ chính xác của các kết quả phân tích có thể đạt được dựa trên việc sửdụng hệ thống đo phân tích hoàn hảo và kỹ năng thuần thục của phân tíchviên cũng như tăng số phép đo lặp lại lên nhiều lần (để giảm thiểu các sai

số thô bạo và ngẫu nhiên) Trong khi đó độ đúng của các kết quả phân tíchchỉ có thể thu được khi loại trừ được sai số hệ thống do các chất có trong chấtnền và các yếu tố ảnh hưởng khác của chất nền gây ra Mẫu chuẩn được dùng

để loại trừ sai số hệ thống này [5, 24]

1.3.2 Yêu cầu về chất lượng đối với mẫu ngoại kiểm.

Mỗi bộ mẫu chuẩn cho chương trình ngoại kiểm có các yêu cầu khácnhau tuy nhiên do đặc thù gửi đến nhiều đơn vị để cùng đánh giá so sánh vớigiá trị chuẩn hoặc so sánh với nhau mà mẫu ngoại kiểm có các yêu cầu chungnhư sau:

- Độ đồng nhất: Mỗi chương trình ngoại kiểm tra khi triển khai việc gửi

mẫu được thực hiện đến nhiều phòng thí nghiệm cùng lúc và các kết quảphản hồi được so sánh vì vậy các mẫu cần đồng nhất

đảm bảo các đại lượng đo không bị thay đổi trong suốt quá trình nghiên cứu.Theo quy định của ISO 13528, thỏa thuận hài hòa quốc tế IUPAC và TCVN

8245 (ISO Guide 35), mẫu thử ngoại kiểm cần được thử trong các điều kiệnthay đổi xuất hiện trong quá trình triển khai chương trình ngoại kiểm nhưđiều kiện đóng gói, vận chuyển và xử lý mẫu khi được phân phối cho các đơn

vị tham gia [10, 20, 23-25].

Do vậy, việc sản xuất mẫu chuẩn là một quá trình rất công phu và phảituân thủ nghiêm ngặt các quy trình và quy định của ISO Guide 30, ISO Guide

35 và quy định của tổ chức đo lường pháp lý quốc tế (OIML) [10, 20, 23-25]

1.3.3 Các phương pháp sản xuất mẫu ngoại kiểm HBV

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp sản xuất mẫu ngoại kiểmHBV khác nhau như mẫu chuẩn sản xuất theo phương pháp mẫu huyếttương khô, mẫu huyết thanh thông thường, mẫu huyết tương [36, 37] … tùythuộc vào tình hình thực tế của mỗi quốc gia và chiến lược của nhà cungcấp Như tại Mỹ, gần đây Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tậtHoa Kỳ (CDC) đang cung cấp bộ mẫu ngoại kiểm sử dụng mẫu huyết tươngkhô cho nhiều nước Châu phi Với bộ mẫu này sẽ hạn chế được việc ảnhhưởng bởi nhiệt độ trong quá trình vận chuyển cũng như việc tiết kiệm đượcchi phí sản xuất cũng như lượng mẫu sử dụng cho sản xuất Một số phòngthí nghiệm trên thế giới vẫn sản xuất theo cách thông thường là huyết thanhhoặc huyết tương như Phòng thí nghiệm chuẩn thức Quốc gia Úc, phòng thínghiệm chuẩn thức Thái Lan, Hàn Quốc, Anh, Pháp… [37-40]

1.3.4 Phương pháp đánh giá chất lượng mẫu chuẩn

Có rất nhiều phương pháp đánh giá chất lượng mẫu ngoại kiểm khácnhau tùy thuộc vào yêu cầu của mẫu, tuy nhiên đối với chương trình ngoại

kiểm tra về huyết thanh học nói chung và huyết thanh học HBV nói riêngthì tính chất ổn định và đồng nhất của mẫu là những tiêu chí quan trọng đểđánh giá chất lượng của mẫu Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN ISO/IEC17043:2011 và theo hướng dẫn TCVN 7366 và TCVN 8245 việc nhà sảnxuất trước mỗi lô mẫu chuẩn gửi đến các đơn vị tham gia phải được đánhgiá độ đồng nhất thông qua việc lấy ngẫu nhiên 10% số lượng mẫu sản xuất.Bên cạnh đó việc đánh giá độ ổn định cũng là tiêu chí quan trọng cho các bộmẫu chuẩn [41-44].

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu huyết tương nghiên cứu là mẫu huyết tương dương tính với HBV.Nguồn mẫu huyết tương được lấy từ Trung tâm truyền máu bệnh viện Việt Đức

Tiêu chuẩn nhận mẫu:

+ Mẫu không tán huyết, đông vón

+ Thời gian bảo quản 1 tuần/2-80C, hoặc âm sâu từ < -200C + Nhiệt độ vận chuyển 2-80C (hoặc < -20C với mẫu cấp đông)

Tiêu chuẩn loại bỏ mẫu: mẫu bị loại nếu một trong các tiêu chuẩn trên

không đạt yêu cầu

Bộ mẫu chuẩn xây dựng là bộ mẫu xét nghiệm định lượng HBsAg.Mỗi loại mẫu xây dựng theo 2 mức khác nhau

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Dụng cụ vật tư tiêu hao sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê ở Bảng 2.1

Bảng 2.1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao Tên dụng cụ Hãng sản xuất Nước sản xuất

Bình thủy tinh các dung tích Việt NamChai đựng mẫu lưu tủ âm sâu 250ml Nalgene Hoa Kỳ

Máy móc, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được trình bày tại Bảng 2.2

Bảng 2.2: Máy móc và thiết bị sử dụng Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất

Hệ thống máy xét nghiệm

Hóa chất, sinh phẩm sử dụng trong đề tài được liệt kê trong Bảng 2.3

Bảng 2.3: Hóa chất sinh phẩm sử dụng Tên hóa chất Hãng sản xuất Nước sản xuất

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu được áp dụng theo khuyến cáo của Tổ chức Y tếthế giới về lựa chọn mẫu, xây dựng quy trình sản xuất [33], các nghiên cứu vềtách chiết và tinh chế HBsAg bằng cách sử dụng muối (NH4)2SO2 để kết tủaprotein, sắc ký trao đổi ion trên DEAE Cellulose của một số tác giả [45-48].

2.3.1 Xây dựng bộ mẫu chuẩn

Trong nghiên cứu này chúng tôi thiết kế bộ mẫu huyết thanh gồm 2

bộ mẫu như sau:

• Mẫu 1: mẫu có [HBsAg] trong khoảng 7,500 – 11,500 IU/ml

• Mẫu 2: mẫu có [HBsAg] trong khoảng 35 - 60 IU/ml

Đọc và biện luận kết quả test định lượng

Test định lượng HBsAg được chúng tôi tiến hành đo trên hệ thống máyxét nghiệm miễn dịch Cobas 6000 ở máy cobas e601 của Roche theo chươngtrình đo của máy

Nguyên lý xét nghiệm: nguyên lý bắt cặp (tổng thời gian xét nghiệm:

18 phút)

▪ Thời kỳ ủ đầu tiên: 50 µL mẫu thử, hai kháng thể đơn dòng khángHBsAg đánh dấu biotin, và hỗn hợp kháng thể đơn dòng kháng HBsAg vàkháng thể đa dòng kháng HBsAg đánh dấu phức hợp rutheniuma (Tris(2,2'-bipyridyl) ruthenium(II)-complex (Ru(bpy) tạo thành phức hợp bắt cặp

▪ Thời kỳ ủ thứ hai: Sau khi thêm các vi hạt phủ streptavidin, phức hợpmiễn dịch trên trở nên gắn kết với pha rắn thông qua sự tương tác giữa biotin

và streptavidin

▪ Hỗn hợp phản ứng đươcc̣chuyển tới buồng đo, ở đó các vi hạt đối từđược bắt giữ trên bề mặt của điện cực Những thành phần không gắn kết sẽ bịthải ra ngoài buồng đo bởi dung dịch ProCell/CleanCell M Cho điện áp vàođiện cực sẽ tạo nên sự phát quang hóa học được đo bằng bộ khuếch đại quang tử

▪ Các kết quả được xác định tự động nhờ phần mềm bằng cách so sánh tín

giá trị ngưỡng phản ứng thu được trước đó qua việc chuẩn xét nghiệm [49].

Đọc và biện luận kết quả test bán định lượng HBsAg [ 50 ]

Test bán định lượng HBsAg được chúng tôi tiến hành đo trên hệ thốngmáy xét nghiệm miễn dịch Cobas 6000 ở máy cobas e601 của Roche Vềnguyễn lý xét nghiệm cũng tương tự như đối với xét nghiệm định lượngHBsAg Kết quả được phân tích như sau:

 Máy tự động tính toán ngưỡng phản ứng dựa trên kết quả đo HBsAg II Cal1

và HBsAg II Cal2

 Mẫu có chỉ số ngưỡng phản ứng < 0,9 COI là mẫu không có phản ứng trongxét nghiệm Elecsys HBsAg II Các mẫu này được xem là âm tính đối vớiHBsAg và không cần xét nghiệm thêm

 Mẫu có chỉ số ngưỡng phản ứng từ 0,9 đến < 1,0 COI được xem như mấp méngưỡng trong xét nghiệm Elecsys HBsAg II

 Mẫu có chỉ số ngưỡng từ 1,0 COI trở nên được xem là mẫu có phản ứng

2.3.2 Kỹ thuật chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh

Các mẫu thu thập được là huyết tương từ các ngân hàng máu, do cácmẫu huyết tương này có chứa một số thành phần gây ảnh hưởng đến tínhchính xác của kết quả xét nghiệm HBsAg Vì vậy chúng tôi chuyển đổi mẫuhuyết tương này thành mẫu huyết thanh Chúng tôi sử dụng kỹ thuật kỹthuật phục hồi lại Canxi

- Pha dung dịch CaCl2 1Mol/lít bằng cách cho 1,5g CaCl2 vào 10mlnước cất

- Cho 1ml dung dịch CaCl2 mới pha vào 100ml huyết tương, trộn đều

và ủ ở bể ổn nhiệt trong 370C trong 1-2 giờ

- Nếu huyết tương không tạo thành cục tơ huyết, có thể cho thêmCaCl2 nhưng không vượt quá 1% của dung dịch 1Mol/lít và phải ủ lâu hơn

- Khi cục tơ huyết đã tạo thành mang chai mẫu ra nhiệt độ phòng chờ

1 giờ rồi cho vào tủ âm sâu tối thiểu âm 200C qua đêm

- Sau khi qua đêm tại nhiệt độ âm sâu, ngày hôm sau rã đông tự nhiêntại nhiệt độ phòng, phần dịch nổi thu được chính là huyết thanh [36]

2.3.3 Phương pháp cô đặc huyết thanh làm tăng nồng độ HBsAg

Huyết tương thu thập tại các đơn vị sẽ được xử lý chuyển đổi thànhhuyết thanh Phần huyết thanh này sẽ được cô đặc nhằm làm tăng nồng độHBsAg trong mẫu và được sử dụng để sản xuất các mẫu huyết thanh chuẩnHBsAg Quá trình này được thể hiện ở sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ cô đặc HBsAg Bước 1: Tủa protein bằng amonium sulfate bão hoà [46]

 Tủa huyết thanh bằng dung dịch amonium sulfate bão hòa theo tỉ lệ 1:1

Huyết thanh cóHBsAg

Tủa bằng dung dịch(NH4)2SO4 bão hòa

Rửa tủa bằng(NH4)2SO4 bão hòa

Thẩm tích bằng H2O vàđệm Tri-phosphat 0,1M

tại pH=7

Nhỏ từng giọt (NH4)2SO4 bão hòa vào bình đựng huyết thanh Sau khicho hết lượng (NH4)2SO4 vào tiếp tục khuấy 45 – 60 phút.

 Để qua đêm trong tủ lạnh ở 40C

 Cho kết tủa protein vào túi thẩm tích

 Cho thuốc sát trùng vào túi để bảo quản protein

 Buộc túi vào một que thủy tinh, gác que thủy tinh lên miệng bìnhthủy tinh để giữ túi thẩm tích luôn ở giữa bình thủy tinh

 Đặt bình thủy tinh chứa túi thẩm tích lên trên máy lắc ngang

 Cho vào đầy bình dung dịch đệm Triphosphat 0,1M và điều chỉnhđến pH = 7, bật máy lắc để bắt đầu thẩm tích Thay dung dịch đệm 2 tiếng 1lần Thẩm tích trong 12 – 24h

 Sau khi thẩm tích với dịch đệm Triphosphat, tiến hành thẩm tích vớinước cất trong 12h

 Phần thu được trong túi cellophane được cho vào bình chứa huyếtthanh chờ định lượng HBsAg, sản xuất huyết thanh chuẩn

2.3.4 Chuẩn bị huyết thanh sản xuất

Virut HBV tuy bền vững với nhiệt nhưng lại bị bất hoạt bởi formalin, vìvậy để đảm bảo an toàn, chai mẫu huyết thanh dùng làm nguyên liệu sảnxuất sẽ được cho thêm vào dung dịch formalin theo tỉ lệ 1/400 để bất hoạtvirus viêm gan B Các mẫu sau khi bất hoạt sẽ không có khả năng lây

nhiễm [7 , 17 ].

 Lọc mẫu

Mẫu chuẩn sử dụng để gửi đến các đơn vị cần có chất lượng tốt,trong, không tán huyết hay nhiễm khuẩn Chúng tôi sử dụng phin lọc 0,22micron để loại bỏ những vi sinh vật và những sợi tơ huyết nếu còn

 Cho chất bảo quản

Mặc dù phin lọc có thể loại bỏ vi khuẩn và nấm mốc, tuy nhiên huyếtthanh vẫn có thể dễ dàng bị nhiễm khuẩn ở các công đoạn sau Vì vậy, cácmẫu huyết thanh âm và dương tính được cho chất bảo quản như Thiomesal(0,01%), Proclin 300 Các mẫu này sau đó được khiểm tra khả năng khôngnhiễm khuẩn bằng môi trường thạch canh thang Theo dõi trong tủ ấm 370Ctrong vòng 14 ngày

2.3.5 Sản xuất mẫu huyết thanh kiểm chuẩn HBsAg

Huyết thanh thu được sau quy trình ở trên sẽ được định lượng HBsAgtrên hệ thống cobas 6000 Từ nồng độ ban đầu thu được, chúng tôi tiến hànhpha loãng mẫu bằng nước cất 2 lần hoặc tiếp tục cô đặc lần 2, lần 3… cho đếnkhi thu được huyết thanh có nồng độ đạt yêu cầu Mẫu huyết thanh sau khisản xuất sẽ được bảo quản ở 2 hình thức là bảo quản tại -300C và tại 00C Mẫuđược sản xuất theo sơ đồ dưới đây Việc định lượng HBsAg ở các mẫu huyếttương thu thập được sau khi trộn mẫu và xử lý với Canxi để chuyển huyếttương thành huyết thanh không có giá trị sử dụng quá trình sản xuất mẫuchuẩn Do đó để giảm thiểu chi phí cho quá trình sản xuất mẫu, chúng tôi sửdụng test bán định lượng nồng độ HBsAg trong mẫu

2.3.6 Sơ đồ nghiên cứu sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn

Sơ đồ 2.2 Sản xuất mẫu huyết thanh kiểm chuẩn HBV

Kết tủa thu được

Huyết thanh mẫu mức 1

Định lượng HBsAg lần 3

Định lượng HBsAg Lần 2

- Bất hoạt Virus

- Thêm bảo quản

- Lọc mẫu

Huyết thanh sau cô đặc

Huyết thanh mẫu mức 2

Chia 60 lọ 1mL, đông khôDán nhãn và đưa đi bảo quản

Đánh giá độ đồng nhất Đánh giá độ ổn định Đánh giá độ đồng nhất

Viết báo cáo

2.3.7 Đông khô mẫu huyết thanh xét nghiệm

Đông khô là quá trình khiến sản phẩm đóng thành thể rắn rồi qua xử lýchân không thăng hoa (sublimes) thành dạng hơi rồi ngưng tụ thành nước vàthải ra ngoài, sản phẩm trở thành dạng khô [51] Quy trình đông khô đượctiến hành tại bộ môn Mô - Phôi học trường Đại học Y Hà Nội theo hai bướcsau đây:

- Bước 1: Đông lạnh huyết thanh ở -750C trong 12 giờ

- Bước 2: Đông khô huyết thanh ở -450C và áp suất chân không đạt0,04 mbar Sử dụng máy LY3-TTE/DM8 của Hà Lan

Thời gian đông khô của các lọ mẫu huyết thanh khoảng 2 tới 3 ngày.Sản phẩm cuối cùng thu được sau quá trình đông khô có tỷ lệ ngậm nước

<5% Với phương pháp này các cấu trúc và đặc điểm của kháng nguyên sẽđược giữ ổn định làm cho việc bảo quản mẫu trở nên thuận lợi khi muốn lưugiữ trong thời gian lâu dài Với nguyên lý làm nước thăng hoa ngay ở trạngthái rắn (đông đá), giữ lại các thành phần hữu hình nên việc hoàn nguyên mẫuhuyết thanh đông khô cũng vô cùng đơn giản được thực hiện theo nguyên tắc:

“bù lại lượng nước đã thăng hoa trong quá trình đông khô” để hoàn nguyênmẫu ban đầu [51]

2.3.8 Đánh giá chất lượng mẫu sản xuất

2.3.8.1 Đánh giá độ đồng nhất

Sau khi các mẫu được xác định nồng độ HBsAg phù hợp sẽ được đánhgiá độ đồng nhất Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN ISO/IEC 17043:2011

và theo hướng dẫn TCVN 7366 và TCVN 8245 việc nhà sản xuất trước mỗi

lô mẫu chuẩn gửi đến các đơn vị tham gia phải được đánh giá độ đồng nhấtthông qua việc lấy ngẫu nhiên 10% số lượng mẫu sản xuất hoặc lấy từ 10 đến

30 đơn vị mẫu ngẫu nhiên trong lô mẫu sản xuất [41-44]