Nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của cây Schefflera Petelotti và Schefflera Hypoleuca ở Việt Nam

Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG *** NGUYỄN VŨ TRƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY SCHEFFLERA PETELOTTI VÀ SCHEFFLERA HYPOLEUCA Ở VIỆT NAM Chuyên ngành : Hóa Hữu Mã số : 60.44.27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng, 2011 Footer Page of 126 Header Page of 126 Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG *** Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thị Hoàng Anh Phản biện : GS.TS Đào Hùng Cường Phản biện : TS Trịnh Đình Chính Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp Đại học Đà Nẵng ngày 27 tháng năm 2011 * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU Lý chọn ñề tài Những thay ñổi thời tiết, thiên tai, ô nhiễm môi trường,… ñã ảnh hưởng nghiêm trọng ñến sức khỏe người sống Để ngày nâng cao sức khỏe chất lượng sống cộng ñồng, nhiệm vụ ñặt cho nhà hóa học nhà y dược học phải nghiên cứu, phát loại thuốc mới, hiệu cao Một hướng nghiên cứu ñược nhà khoa học lựa chọn ñã thu ñược nhiều thành tựu ñó tìm kiếm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học biến ñổi cấu trúc hóa học chúng ñể ñạt ñược chất có hoạt tính mong muốn cao góp phần giải vấn ñề sức khỏe cộng ñồng Ở Việt Nam, chi Schefflera chi lớn thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae) với khoảng 50 loài, ñó có nhiều loài ñược dùng làm thuốc chữa bệnh Mặc dù chi Schefflera có nhiều giá trị sử dụng nước ta công trình nghiên cứu thành phần hoá học, hoạt tính sinh học thuộc chi chưa ñược nghiên cứu cách hệ thống Do vậy, chọn ñề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học thăm dò hoạt tính sinh học Schefflera petelotti Schefflera hypoleuca Việt Nam” Mục ñích nghiên cứu - Nghiên cứu thành phần hóa học Schefflera petelotti Schefflera hypoleuca thuộc chi Schefflera - Thử hoạt tính sinh học chất tách ñược từ Footer Page of 126 Header Page of 126 Đối tượng phạm vi nghiên cứu Điều tra sơ bộ, thu thập, xử lí nguyên liệu phận từ hai loài Schefflera nói Qua trình nghiên cứu sơ ban ñầu hai loài Schefflera petelotti Schefflera hypoleuca, với mục ñích ưu tiên nghiên cứu ñã có nhiều ứng dụng rộng rãi thuốc dân gian sống; mặt khác, thời gian thực ñề tài có hạn nên ñịnh chọn hướng: nghiên cứu thành phần hoá học thăm dò hoạt tính sinh học Schefflera petelotti Trong ñề tài này, ñịnh chọn vỏ Schefflera petelotti ñể tiến hành nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu * Lý thuyết - Tìm hiểu chung số hợp chất thiên nhiên - Tìm hiểu tình hình nghiên cứu số loài thuộc chi Schefflera - Tìm hiểu loài Schefflera petelotti * Thực nghiệm - Thu thập xử lý mẫu - Chiết mẫu vỏ Schefflera petelotti với dung môi có ñộ phân cực khác -Tách, tinh chế xác ñịnh cấu trúc chất từ dịch chiết - Thử hoạt tính sinh học chất tách ñược Phương pháp nghiên cứu * Thu thập xử lý mẫu * Chiết tách chất - Chiết mẫu quy trình thường dùng ñối với mẫu thực vật Footer Page of 126 Header Page of 126 - Sử dụng phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC),… với dung môi thích hợp ñể phân lập chất * Các phương pháp xác ñịnh cấu trúc hợp chất tách ñược Kết hợp phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (EI ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR): H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY,… ñể xác ñịnh cấu trúc hóa học chất tách ñược Trong trường hợp cần thiết ñiều chế dẫn xuất chất tách ñược ñể làm sáng tỏ cấu trúc chất * Thử hoạt tính sinh học dịch chiết chất tách ñược Thử hoạt tính sinh học chất tách ñược hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, gây ñộc tế bào,… Ý nghĩa khoa học tính thực tiễn ñề tài - Những kết thành phần hóa học hoạt tính sinh học Schefflera petelotti ñóng góp vào kho tàng hợp chất thiên nhiên Việt Nam giới - Tìm hiểu ñặc trưng cấu trúc bật hợp chất có hoạt tính khả biến ñổi cấu trúc ñể có hoạt tính tốt - Tạo sở khoa học cho việc sử dụng nguồn thực vật Việt Nam cách hiệu Bố cục luận văn Luận văn gồm có 80 trang, ñó có bảng 22 hình Phần mở ñầu trang, kết luận trang tài liệu tham khảo gồm trang Nội dung luận văn chia thành chương: Footer Page of 126 Header Page of 126 Chương Tổng quan: 28 trang Chương Thực nghiệm: 12 trang Chương Kết thảo luận: 27 trang Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét chi Schefflera [1] Chi Chân chim (Schefflera J R Forster J G Forster) có 400 loài, hầu hết gỗ bụi, phân bố chủ yếu vùng nhiệt ñới cận nhiệt ñới châu Á như: Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Sri Lanca, Philippin, Indonesia, New Zealand, Singapo ñến tận Australia số ñảo Thái Bình Dương Ở Việt Nam, chi có 45 loài, nhiều loài ñược sử dụng làm thuốc làm cảnh, ñó phải kể ñến loài ngũ gia bì chân chim [Scheffera octophylla (Lour) Harms] Cây phân bố rải rác hầu hết tỉnh miền núi phía bắc (từ Hà Tĩnh trở ra) Ở phía Nam gặp tỉnh Gia Lai, Kon Tum, Đắc Lắc Côn Đảo Vùng phân bố giới rộng, từ Nhật Bản, Đài Loan qua phần Nam Trung Quốc tới Mianma, xuống nước Đông Dương, Thái Lan Philippin Các loài thuộc chi chân chim thường thân gỗ cao 510m, có Lá kép chân vịt mọc so le, gồm 6-8 chét hình mác trái xoan, hình cọ, dài 6-15cm, rộng 3-6cm Cụm hoa chùm tán mọc ñầu cành; hoa nhỏ màu trắng thơm, ñài, cánh hoa, nhị, bầu có 6-8 ô Quả mọng, hình cầu, ñường kính 34mm, có núm nhọn, chín màu tím ñen Mùa hoa tháng 2-7 1.2 Tình hình nghiên cứu số loài thuộc chi Schefflera Trên giới hầu hết nghiên cứu chi Schefflera tập trung vào loài Schefflera octophylla Ngoài ra, có số công trình nghiên cứu mặt hóa học loài Schefflera arboricola, Footer Page of 126 Header Page of 126 Schefflera venulosa Các loài lại chưa ñược nghiên cứu hoá học lẫn hoạt tính sinh học Theo số tài liệu, hợp chất ñược tìm thấy loài thuộc chi tritecpenoit, tritecpenoit glycozit Dưới ñây giới thiệu số loài thuộc chi Schefflera ñã ñược nghiên cứu giới thành phần hoá học hoạt tính sinh học 1.2.1 Cây Ngũ gia bì chân chim [Schefflera octophylla (Lour.) Harms] 1.2.1.1 Đặc ñiểm thực vật [1] 1.2.1.2 Ứng dụng y học dân gian [3], [4], [5], [6] 1.2.1.3 Tình hình nghiên cứu 1.2.2 Schefflera arboricola (Hayata) Merr 1.2.2.1 Đặc ñiểm thực vật 1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu 1.2.3 Schefflera bodinieri (Levi.) Rehd 1.2.3.1 Đặc ñiểm thực vật 1.2.3.2 Tình hình nghiên cứu 1.2.4 Loài Schefflera petelotti Merr Tên tiếng Việt: Chân chim núi 1.2.4.1 Đặc ñiểm thực vật Cây nhỏ cao – m; nhánh non có lông vàng; thân mang nhiều vết sẹo cuống rụng ñể lại Lá kép có chét xoan rộng, dài ñến 18 (30) cm, rộng 11cm; mép phía có to, mặt vàng bóng, mặt màu vàng xỉn; gân phụ – cặp; cuống dài 20 cm, có rãnh dọc mảnh Cụm hoa nhánh, mang nhánh dài 10 cm, có lông vàng, cuống tán dài 8-12 mm, cuống hoa – mm; nụ hoa nhỏ Quả nhỏ, hình cầu [1] Footer Page of 126 Header Page of 126 1.2.4.2 Hình ảnh Schefflera petelotti Cây Lá Hình 1.2 Một số hình ảnh loài Schefflera petelotti 1.2.4.3 Tình hình nghiên cứu Theo tra cứu tài liệu chúng tôi, Việt Nam giới chưa thấy có công trình công bố thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Schefflera petelotti Vì khuôn khổ luận văn tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học thăm dò hoạt tính sinh học số chất phân lập ñược từ loài 1.3 Hoạt tính sinh học số loài thuộc chi Schefflera Léon Azefack Tapondjou cộng ñã khảo sát hoạt tính ñộc tế bào ñối với dòng tế bào ung thư người HCT 116 HT-29 phép thử MTT [18] hợp chất tổng số 13 hợp chất triterpen triterpen glycosid phân lập từ loài Schefflera abyssinica [35] Năm hợp chất ñược ñưa thử hoạt tính có cấu trúc là: axit 3-O-βD-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-oleanolic (fatsiazit C1), axit 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L arabinopyranosyloleanolic (guaianin N), 3-O-α-L-arabinopyranosyl-hederagenin-28O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D- Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 10 glucopyranosyl este (caulosid D), axit 3-O-β-D-glucopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-oleanolic-28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl este (ciwujianozit A1) 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-Larabinopyranosyl-hederagenin-28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl este Kết cho thấy hai saponin fatsiazit C1 guaianin N có hoạt tính ñộc với hai dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 < µg/ml, saponin lại hoạt tính (IC50 > 100 µg/ml Giá trị IC50 chất ñối chứng dương, paclitaxel ñối với dòng tế bào ung thư CT 116 HT-29 9,9 ± 6,3 14,4 ± 8,4 ng/ml Các kết nghiên cứu phù hợp với kết ñã công bố tác giả Quertin-Leclercq [49] monodesmosid saponin có hoạt tính ñộc tế bào bidesmosid không ñối với dòng tế bào ung thư thử nghiệm Năm 2005, Yaolan Li (Trung Quốc) ñã phát thấy dẫn xuất axit caffeoylquinic phân lập từ loài Schefflera heptaphylla (L.) có hoạt tính kháng virut ñường hô hấp (RSV- respiratory syncytial virus) hiệu Các dẫn xuất ñó là: axit 3,4-ñi-O-caffeoylquinic, axit 3,5-ñi-O-caffeoylquinic axit 3-O-caffeoylquinic Tuy dẫn xuất có hoạt tính tốt với virut ñường hô hấp (RSV) lại hoạt tính với loại virut khác virut cúm A (Flu A), virut ñường ruột gây bệnh bại liệt, viêm màng não (Cox B3) virut herpes giản ñơn typ (HSV-1) Các nghiên cứu nhóm ñã ñi ñến giả thiết hợp chất thể hoạt tính kháng RSV thông qua việc ức chế trình hợp virut-tế bào (virus-cell fusion) giai ñoạn ñầu ức chế trình hợp tế bào-tế bào (virus-virus fusion) cuối chu kỳ tái tạo RSV [63] Footer Page 10 of 126 Header Page 12 of 126 12 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp ñiều chế cặn chiết 2.2.2 Phương pháp tách tinh chế chất 2.2.2.1 Cách tiến hành sắc ký cột Cặn chiết etyl axetat Lắp cột (Φ= 4cm; d= 60cm) vào giá theo chiều thẳng ñứng, lót lớp mỏng ñáy cột Từ từ cho silicagel (cỡ hạt 0,063 – 0,200mm, Merck) vào cốc ñã chứa dung môi ñiclometan:metanol tỉ lệ 99:1 khuấy ñều cho hết bọt khí ñể tạo thể ñồng Cho dung môi ñiclometan:metanol tỉ lệ 99:1 vào khoảng 1/3 cột rót silicagel vào cột, dùng cao su gõ nhẹ vào thành cột cho chặt cột Rửa giải cột nhiều lần hệ dung môi trên, ñể ổn ñịnh thời gian hạ dung môi xuống cách bề mặt silica gel ñoạn ñủ ñể cho mẫu vào Cặn chiết etyl axetat (8 gam) ñược hoà tan với dung môi metanol bình cầu, cho silica gel, khuấy ñều Dùng máy cô quay ñể ñuổi kiệt dung môi; lại mẫu chất ñã bám dính silica gel Tán rời hạt mẫu chất silica gel Dùng phễu thủy tinh cho mẫu chất ñã ñính với silica gel vào cột cho hạn chế thấp bọt khí hạt Từ từ mở khóa cho dung môi chảy vừa ñến bề mặt mẫu chất Cho nhẹ nhàng dung môi vào cột phểu nhỏ giọt, cho lớp mỏng lên bề mặt chất ñể tránh xáo trộn bề mặt silica gel cột cho dung môi rửa giải vào Sau ñó rửa giải hệ dung môi CH2Cl2:CH3OH với tỉ lệ thể tích tăng dần ñộ phân cực từ 99:1 ñến 70:30 Theo dõi trình rửa giải sắc kí mỏng, phân ñoạn có thành phần giống ñược gộp Footer Page 12 of 126 Header Page 13 of 126 13 lại với nhau, cất loại dung môi Các phân ñoạn thu ñược tiếp tục ñược tinh chế phương pháp khác ñể nhận ñược chất Cặn chiết metanol Các thao tác cho trình chuẩn bị chạy cột ñối với cặn chiết metanol tương tự ñối với cặn chiết etyl axetat Trong trường hợp hệ dung môi ban ñầu trình rửa giải hệ ñiclometan:metanol tỉ lệ 95:5 Cặn chiết metanol (40 gam) hoà tan vào dung môi metanol, thêm tiếp silica gel Hỗn hợp ñược quay khô áp suất thấp, thu ñược mẫu chất ñã ñược ñính silica gel Quá trình cho mẫu vào cột hoàn toàn tương tự cặn chiết etyl axetat Sau ñó rửa giải hệ dung môi CH2Cl2:CH3OH với tỉ lệ thể tích khác nhau: 95:5 ñến 30:70 ñổi hệ dung môi CH3OH:H2O theo tỉ lệ 90:10 ñể rửa cột 2.2.2.2 Sắc ký lớp mỏng 2.2.2.3 Kết tinh 2.2.3 Phương pháp xác ñịnh cấu trúc hóa học chất 2.2.4 Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học 2.2.4.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh 2.2.4.2 Hoạt tính gây ñộc tế bào 2.3 Phân lập tinh chế chất 2.3.1 Chiết mẫu thực vật phân lập chất từ vỏ Schefflera petelotti Mẫu vỏ Schefflera petelotti thu hái ñược rửa với nước, ñể ráo, làm khô tự nhiên nơi thoáng gió Sau ñó ñưa vào tủ sấy 400C thu ñược vỏ khô (1,1 kg) Footer Page 13 of 126 Header Page 14 of 126 14 Mẫu vỏ khô ñược nghiền nhỏ ngâm chiết lần dung môi n-hexan nhiệt ñộ phòng, gộp dịch chiết, cất loại dung môi áp suất giảm thu ñược cặn chiết n-hexan (4,4 gam) Sau ñó bột vỏ tiếp tục ñược chiết lần dung môi etyl axetat nhiệt ñộ phòng, lọc lấy dịch chiết, cất loại dung môi áp suất giảm, thu ñược cặn chiết etyl axetat (10,9 gam) Cuối bã vỏ ñược ngâm chiết tương tự với dung môi metanol, cất loại dung môi, thu ñược cặn chiết metanol (91 gam) Qui trình chiết phân lập chất từ vỏ Schefflera petelotti ñược trình bày theo hình 2.1, 2.2 2.3 2.3.1.1 Phân lập chất từ cặn chiết etyl axetat Cặn chiết etyl axetat (8 gam) ñược tinh chế qua cột silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/CH3OH, tỉ lệ tăng dần từ 99:1 ñến 70:30 thu ñược phân ñoạn, kí hiệu SPE1 – SPE7 Chất SPE322 Phân ñoạn SPE3 (0,5g) ñược ñưa lên cột silica gel, giải hấp hỗn hợp ñiclometan/metanol (99:1) thu ñược phân ñoạn Kết tinh phân ñoạn hỗn hợp ñiclometan/metanol tỉ lệ 98:2 thu ñược 26 mg chất (SPE322) dạng kết tinh hình kim, màu trắng; Rf = 0,5 hệ dung môi n-hexan/etyl axetat = 90:10 IR (KBr) νmax (cm-1): 3454, 2944, 2866, 1709, 1641, 1464, 1376, 1052 Chất SPE433 Phân ñoạn SPE4 (0,64 g) ñược ñưa lên cột silica gel, giải hấp hỗn hợp diclometan/metanol (95:5) thu ñược phân ñoạn Kết tinh phân ñoạn hỗn hợp ñiclometan/metanol (80:20) thu ñược 30,2 mg chất (SPE433) dạng kết tinh vô ñịnh hình, màu trắng; Rf = 0,4 hệ dung môi ñiclometan/metanol = 95:5 IR (KBr) νmax (cm1 ): 3416, 2939, 2867, 1689, 1463, 1280, 1057, 828 Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 15 Chất SPE544 Tinh chế phân ñoạn SPE5 (0,71 g) cột silica gel, giải hấp với hỗn hợp diclometan/metanol (95:5) thu ñược phân ñoạn Cô quay khô phân ñoạn 4, hòa tan vào etylacetat thu ñược kết tủa trắng, hòa tan kết tủa kết tinh lại hỗn hợp diclometan/metanol (1:1) thu ñược 27,4 mg chất (SPE544) dạng kết tinh vô ñịnh hình, màu trắng; Rf = 0,38 hệ dung môi ñiclometan/metanol = 90:10 IR (KBr) νmax (cm-1): 3430, 2939, 1644, 1029, 999 2.3.1.2 Phân lập chất từ cặn chiết metanol Cặn chiết metanol (40 gam) ñược tinh chế qua cột silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:CH3OH, tỉ lệ CH3OH tăng dần từ 100% thu ñược 17 phân ñoạn, kí hiệu SP1 – SP17 Chất SPM1 Phân ñoạn SP9 (134 mg) ñược tiếp tục làm cột silica gel, hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:CH3OH (98:2 → 30:70) thu ñược phân ñoạn, ký hiệu SP91 – SP95 Phân ñoạn SP92 ñược tinh chế cách lọc lấy phần dịch suốt, cho dung môi tự bay hơi, ñược kết tủa màu trắng, rửa kết tủa lần dung môi CH2Cl2 thu ñược 27 mg chất (SPM1); Rf = 0,51 hệ dung môi ñiclometan/metanol = 95:5 IR (KBr) νmax (cm ): 3421, 2932, 2858, -1 1718, 1459, 1379, 1039, 753 2.3.2 Thử hoạt tính sinh học chất tách ñược Chất (SPE433) ñược tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh, ñộc tế bào với dòng ung thư người Phòng thử hoạt tính sinh học thuộc Viện Hóa học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 16 Vỏ S petelotti (1,1 kg) Phơi khô, nghiền nhỏ Chiết kiệt với n-hexan to phòng Cất quay chân không, loại nhexan Cặn n-Hexan (4,4g) Bột vỏ lại Chiết kiệt với EtOAc to phòng Cất quay chân không, loại EtOAc Cặn EtOAc (10,9g) Bột vỏ lại Chiết kiệt với MeOH to phòng Cất quay chân không, loại MeOH Cặn MeOH Bột lại bỏ (91 g) Hình 2.1 Quy trình chiết vỏ Schefflera petelotti Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 17 Cặn chiết EtOAc (8g) SKC silica gel Hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (99:1 → 70:30), thu ñược phân ñoạn (SPE1-SPE7) SPE3 (0,5g) SPE4 (0,64g) SKC silica gel CH2Cl2:MeOH (99:1), thu ñược phân ñoạn (SPE31-SPE3) SPE32 SKC silica gel CH2Cl2:MeOH (95:5), thu ñược phân ñoạn (SPE41-SPE47) Kết tinh phân ñoạn hỗn hợp CH2Cl2:MeOH (8:2) SPE433 (30,2mg) SKC silica gel CH2Cl2:MeOH (95:5), thu ñược phân ñoạn (SPE51-SPE54) SPE54 SPE4 Kết tinh phân ñoạn hỗn hợp CH2Cl2:MeOH (98:2) SPE322 (26mg) SPE5 (0,71g) Cô quay phân ñoạn 4, hoà tan vào etylaxetat, thu ñược kết tủa trắng Hoà tan kết tủa kết tinh lại hỗn hợp CH2Cl2:MeOH (1:1) SPE544 (27,4mg) Hình 2.2 Quy trình tách, phân lập chất từ cặn chiết etyl axetat vỏ Schefflera petelotti Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 Cao MeOH (40 g) Lấy 40g cao metanol tiếp tục tinh chế SKC silica gel, hệ CH2Cl2:MeOH (tỉ lệ MeOH tăng dần từ 5-100%), thu ñược 17 phân ñoạn (SP1-SP17) - Lọc lấy phần dịch, cho bay hơi, thu ñược kết tinh SP9 (134mg) SKC silica gel CH2Cl2:MeOH (98:2 → 3:7), thu ñược phân ñoạn (SP91 - SP95) SPM1 (27 mg) 18 SP92 Hình 2.3 Quy trình tách, phân lập chất từ cặn chiết metanol vỏ Schefflera petelotti Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thành phần hóa học cặn chiết etyl axetat vỏ Schefflera petelotti Cặn chiết etyl axetat ñược tinh chế cách sử dụng phương pháp sắc ký cột silica gel kết tinh nhiều lần với hệ dung môi thích hợp ñã phân lập ñược chất ký hiệu (SPE322), (SPE433) (SPE544) Cấu trúc ba chất ñược xác ñịnh sau 3.1.1 Chất (SPE322): β-sitosterol Chất (SPE322) thu ñược dạng kết tinh hình kim, màu trắng Cấu trúc chất ñược xác ñịnh β-sitosterol nhờ so sánh mỏng phân tích số liệu phổ IR (ñưa mục 2.3.1.1 phần thực nghiệm) với chất chuẩn (SPE322): β-sitosterol 3.1.2 Chất (SPE433): Axit 3α-hyñroxy-20- demethylisoaleuritolic-14(15)-en-28,30-ñioic (SPE433): Axit 3α-hyñroxy-20-demethylisoaleuritolic -14(15)-en-28,30-ñioic Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 20 Chất (SPE433) thu ñược dạng bột vô ñịnh hình, màu trắng Phổ hồng ngoại cho ñỉnh hấp thụ ñặc trưng 3416cm-1 (OH), 1689cm-1 (C=O nhóm axit) Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử m/z = 486 [M]+ Số liệu phổ khối kết hợp với phổ DEPT cho phép ñưa công thức phân tử chất (SPE433) C30H46O5 Phổ 1H- C-NMR cho thấy tín hiệu singlet δH 13 0,87; 0,86; 0,82; 0,79; 0,78; 0,73 nhóm methyl bậc bốn; nối ñôi bị ba lần thể qua tín hiệu δH = 5,52 m δC = 125,08; 136,6; nhóm hyñroxy methin δH = 4,16 (br s) δC = 73,56 Ngoài phân tử chất (SPE433) chứa nhóm cacboxyl δC = 176,54 178,47 Bên cạnh tín hiệu trên, phổ NMR cho thấy phân tử có 10 nhóm CH2, nhóm CH carbon bậc bốn Các số liệu phổ phân tích cho phép dự ñoán cấu trúc (SPE433) tritecpen khung axit 14-taraxeren-28-oic Độ dịch chuyển hóa học nhóm hyñroxy metin δC = 73,56 chứng tỏ nhóm hyñroxy vị trí 3α so sánh với chất khác có nhóm 3β-OH [53] Tín hiệu carbon δC = 178,47 ñặc trưng cho nhóm cacboxylic gắn vào C-17, tín hiệu δC = 176,54 ñược gán cho C-30 so sánh với tài liệu [45] Các số liệu phổ (SPE433) hoàn toàn ñồng với số liệu chất axit 3α-hyñroxy-20-demethylisoaleuritolic-14(15)-en- 28,30-ñioic Chất ñã ñược tác giả Min Zhu cộng phân lập lần ñầu tiên từ Schefflera bodinieri vào năm 1996 [45] Số liệu C-NMR chất (SPE433) chất so sánh tài liệu ñược ñưa 13 bảng 3.1 Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 21 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ13C-NMR [DMSO, 125MHz) chất (SPE433) Vị SPE433 Tài liệu [5] Vị SPE433 Tài liệu [45] trí 10 11 12 13 14 15 32,88 t 23,65 t 73,56 d 36,90 s 46,21 d 25,22 t 33,01 t 36,67 s 48,18 d 36,67 s 17,74 t 43,16 t 46,21 d 136,60 s 125,08 d (DMSO) 33,11 23,98 73,76 37,11 46,4 25,45 33,54 36,9 48,4 36,9 18,0 43,01 46,4 136,8 125,4 trí 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 23,76 t 55,18 s 40,0 s 31,64 t 30,34 s 35,93 t 22,37 t 33,32 q 17,96 q 15,83 q 22,39 q 23,34 q 178,47 s 28,58 q 176,54 s (DMSO) 23,9 55,35 40,18 31,85 30,57 36,17 22,58 33,25 18,2 16,1 22,5 23,6 178,7 28,8 176,8 3.1.3 Chất (SPE544): β-sitosterol – glucozit (SPE544): β-sitosterol – glucozit Chất (SPE544) thu ñược dạng chất bột, màu trắng So sánh giá trị Rf mỏng phổ IR chất (SPE544) (xem phần thực nghiệm 2.3.1.1) với β-sitosterol glucozit chuẩn thấy chúng hoàn toàn ñồng Vì cấu trúc chất (SPE544) ñược xác ñịnh β-sitosterol glucozit Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 22 3.2 Thành phần hóa học cặn chiết metanol vỏ Schefflera petelotti Cặn chiết metanol ñược tinh chế sắc ký cột silica gel với hệ dung môi thích hợp thu ñược hợp chất (SPM1) dạng tinh thể hình kim, màu trắng Phổ hồng ngoại cho ñỉnh hấp thụ ñặc trưng 3530cm-1 (OH), 1711cm-1 (C=O) Phổ khối (ESI-MS) cho pic ion phân tử m/z = 458 [M]+ Số liệu phổ khối kết hợp với liệu 13C-NMR DEPT cho phép xác ñịnh công thức phân tử chất (SPM1) C30H50O3 (SPM1): 7,29-ñihyñroxy-friedelan-3-on Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu nhóm metyl, ñó có tín hiệu singlet δH = 0,67; 0,84; 0,88; 1,03; 1,10 1,11 (mỗi tín hiệu 3H, s, CH3-24, 25, 26, 27, 28 30) tín hiệu doublet δH = 0,75 với J = 6,7Hz (H-23) Phổ 1H- 13C-NMR cho thấy phân tử (SPM1) có mặt nhóm hyñroxymetin (>CH-OH) thể tín hiệu δH = 3,85 (1H, m) δC = 66,31 nhóm hyñroxymetylen (-CH2OH): δH = 3,16 (1H, m); 3,11 (1H, m) δC = 69,71 Ngoài ra, tín hiệu nhóm hyñroxy ñược phát rõ δH = 3,96 (d, 6,5Hz) 4,48 (t, 5,1Hz) phổ 1HNMR ño dung môi DMSO Phổ 13C-NMR cho thấy có mặt nhóm xeton δC = 211,65 phân tử Từ phân tích liệu phổ cho phép dự ñoán (SPM1) tritecpen khung friedelan-3-on với nhóm hyñroxyl Vị trí nhóm hyñroxy thứ ñược xác ñịnh gắn C-7 nhờ phân Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 23 tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR): tín hiệu proton nhóm hyñroxymetin δH = 3,85 (H-7) có tương tác với proton δH = 1,39 (H-8); 1,35 (H-6A); 1,80 (H-6B) 3,96 (OH7) phổ 1H-1H-COSY Các tương tác qua liên kết C-7 (66,32 ppm) với H-8 2H-6 phổ HMBC khẳng ñịnh kết luận Nhóm hyñroxy thứ hai ñược xác ñịnh C-29 tương tác qua liên kết C-29 (69,71 ppm) 2H-19 (1,49; 1,09 ppm); 3H-30 (0,88 ppm) phổ HMBC Các tương tác tín hiệu C=O 211,65ppm với proton δH = 2,36; 2,17 (2H-2) 0,75 (3H-23) phổ HMBC khẳng ñịnh thêm cho kết luận nhóm xeton gắn C-3 Cấu trúc chất (SPM1) ñược xác ñịnh 7,29-ñihyñroxyfriedelan-3-on nhờ so sánh số liệu phổ với tài liệu ñã công bố [58] Tác giả Trần Thị Minh cộng ñã phân lập chất 7α,29ñihydroxy-friedelan-3-on lần ñầu tiên từ Salacia chinensis Tuy nhiên cấu hình nhóm 7-OH chất (SPM1) chưa ñược khẳng ñịnh số tương tác JH-8/H-7 chất (SPM1) chất 7α,29ñihyñroxy-friedelan-3-on không ñồng H-8 thể tín hiệu doublet với JH-8/H-7 = 10,2Hz chất (SPM1), 7α,29ñihyñroxy-friedelan-3-on 5,0Hz Với khác dự ñoán cấu hình nhóm 7-OH chất (SPM1) β Tuy nhiên ñể khẳng ñịnh xác cần có số liệu phổ NOESY Vì ñiều kiện thời gian nên luận văn chưa kết luận ñược cấu hình nhóm 7-OH Theo tra cứu tài liệu ñây lần ñầu tiên chất 7,29-dihydroxy-friedelan-3-on ñược tìm thấy chi Schefflera Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 24 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 13C-NMR chất (SPM1) (125MHz, DMSO) Vị trí 10 11 12 13 14 15 SPM1 21,36 t 40,45 t 211,65 s 56,88 d 41,84 s 51,81 t 66,31 d 57,38 d 38,23 s 57,48 d 35,38 t 29,91 t 38,23 s 41,84 s 33,84 t Tài liệu [58] Vị SPM1 Tài liệu [58] (CD3OD) 21,9 41,2 212,3 58,3 42,6 52,3 68,8 58,7 39,1 58,9 35,9 30,4 40,1 40,4 35,4 trí 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (DMSO) 36,15 t 29,12 s 41,89 d 29,24 t 33,07 s 27,85 t 38,01 t 6,81 q 15,50 q 18,71 q 19,82 q 18,86 q 31,69 q 69,71 t 29,48 q (CD3OD) 36,1 29,7 42,4 29,5 33,5 28,0 38,3 6,90 15,9 18,9 20,8 19,0 31,9 71,4 29,1 3.3 Kết thử hoạt tính sinh học dịch chiết vỏ Schefflera petelotti Chất (SPE433) ñược thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh ñộc tế bào Phòng thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học, Viện Khoa học công nghệ Việt nam 3.3.1 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh Chất (SPE433) ñược thử hoạt tính kháng chủng vi sinh vật nấm sau: Gram (+): Lactobacillus fermentum Bacillus subfilis Staphylococcus aureus Candida albicans (Ca) Gram (-): Salmonella enterica Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 25 Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Nấm: Candida albican Kết chất SPE433 hoạt tính kháng loài vi sinh vật kiểm ñịnh ñem thử (IC50 > 128 µg/ml) 3.3.2 Kết thử hoạt tính ñộc tế bào Chất (SPE433) ñược thử hoạt tính ñộc tế bào với dòng tế bào ung thư người sau: - Ung thư biểu mô (KB), - Ung thư gan (HepG2) - Ung thư phổi (Lu) - Ung thư vú (MCF7) Kết cho thấy chất (SPE433) có hoạt tính ñộc với dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 ñược ñưa bảng ñây Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính ñộc tế bào Giá trị IC50 (µg/ml) mẫu thử dòng Tên mẫu tế bào KB HepG2 Lu MCF7 SPE433 17,88 22,15 8,0 3,5 Ellipticin 0,62-1,25 0,62-1,25 0,62-1,25 0,62-1,25 Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Trong trình thực ñề tài nghiên cứu, ñã ñạt ñược số kết sau: - Cặn chiết etyl axetat vỏ Schefflera petelotti ñã ñược tinh chế sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel thu ñược ba chất (SPE322), (SPE433), (SPE544) chất (SPM1) từ cặn chiết metanol - Cấu trúc hai chất (SPE433) (SPM1) phân lập ñược xác ñịnh axit 3α-hyñroxy-20-demethylisoaleuritolic-14(15)-en-28,30ñioic 7,29-ñihydroxy-friedelan-3-on số liệu phổ hồng ngoại, phổ khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13 C-NMR kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo - Cấu trúc hai chất lại (SPE322) (SPE544) β-sitosterol β-sitosterol-glucozit ñược xác ñịnh nhờ so sánh mỏng phân tích số liệu phổ IR với chất chuẩn - Theo tra cứu tài liệu ñây lần ñầu tiên chất 7,29-ñihyñroxy-friedelan-3-on ñược tìm thấy chi Schefflera - Kết thử hoạt tính sinh học cho thấy chất (SPE433) có hoạt tính ñộc tế bào ñáng quan tâm ñối với dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu), ung thư vú (MCF7) với giá trị IC50 17,88; 22,15; 8; 3,5 (µg/ml) Kiến nghị: Trong khuôn khổ luận văn thạc sĩ khảo sát thành phần hóa học cặn chiết etyl axetat phần cặn chiết metanol, nhiên cặn chiết n-hexan metanol có hoạt tính ñáng quan tâm Vì tiếp tục nghiên cứu cặn chiết nhexan metanol cần thiết Footer Page 26 of 126 ... thành phần hóa học thăm dò hoạt tính sinh học Schefflera petelotti Schefflera hypoleuca Việt Nam Mục ñích nghiên cứu - Nghiên cứu thành phần hóa học Schefflera petelotti Schefflera hypoleuca. .. thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Schefflera petelotti Vì khuôn khổ luận văn tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học thăm dò hoạt tính sinh học số chất phân lập ñược từ loài 1.3 Hoạt tính. .. hướng: nghiên cứu thành phần hoá học thăm dò hoạt tính sinh học Schefflera petelotti Trong ñề tài này, ñịnh chọn vỏ Schefflera petelotti ñể tiến hành nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên