Thực hành hóa sinh học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CHẾ BIẾN BỘ MÔN HÓA – VI SINH THỰC HÀNH HÓA SINH HỌC (Tài liệu lưu hành nội bộ) Th.S: Phạm Thị Mai Nha Trang 2011 BÀI SACCARIT Saccarit (hay gọi glucid hay cacbohydrat) thành phần quan trọng thể sinh vật Nó vừa cung cấp lượng vừa có vai trò cấu trúc bảo vệ thể Dựa vào cấu trúc người ta phân saccarit thành nhóm: monosaccarit; disaccarit; polisaccarit Dựa vào tính chất hóa học đặc trưng loại monosaccarit (andoz xetoz) mà thực phản ứng hóa học để định tính định lượng chúng Trong phản ứng quan trọng dùng nhiều phản ứng khử ion kim loại Polisaccarit monosaccarit liên kết với tạo thành Do tính chất hóa học đơn phân, liên kết đơn phân định tính chất hóa học loại polisaccarit Có nhiều phương pháp để định tính định lượng saccarit, giáo trình giới thiệu số phản ứng định tính định lượng quan trọng saccarit I MỤC TIÊU Sau học xong sinh viên cần đạt mục tiêu sau: - Biết cách pha hóa chất, thao tác thí nghiệm thành thạo - Biết tự bố trí thí nghiệm, giải thích tượng thí nghiệm - Áp dụng quy tắc thí nghiệm vào trường hợp thực tế cụ thể II CÔNG VIỆC SINH VIÊN CHUẨN BỊ TRƯỚC KHI LÊN LỚP - Đọc kỹ lại phần lý thuyết có liên quan - Đọc trước thao tác cách bố trí thí nghiệm III MỘT SỐ THÍ NGHIỆM GIỚI THIỆU Phản ứng Glucose với thuốc thử Fehling 1.1 Nguyên lý Trong thuốc thử fehling Cu2+ dạng kết hợp với muối kali natritactrat bị monosaccarit disaccarit khử thành Cu+ 1.2 Dụng cụ, hóa chất bước tiến hành thí nghiệm * Hóa chất: - dung dịch Glucoz 1% - Thuốc thử Fehling * Cách pha hóa chất: Thuốc thử Fheling gồm thành phần: Fehling A Fehling B Cách pha sau:- Dung dịch Fehling A: Hòa tan 40g CuSO4.5H2O nước cất, định mức đến lít - Dung dịch Fehling B: Hòa tan 20g kalinatritactrat (C4H4O6NaK.4H2O 150g NaOH nước cất, định mức đến lít Pha thuốc thử A với thuốc thử B theo tỷ lệ 1:1, lắc thu dung dịch trong, màu xanh biếc Đó thuốc thử Fehling (chú ý pha thuốc thử trước dùng) * Các bước tiến hành thí nghiệm Lấy ống nghiệm, cho vào ống: 1ml glucoz 1% + 1ml thuốc thử Fehling Đun ống khoảng 10 phút nồi cách thủy sôi (hoặc đun đến vừa sôi lửa đèn cồn) Ống để nhiệt độ phòng Quan sát kết quả, so sánh tượng giải thích KIỂM TRA TÍNH KHỬ CỦA MỘT SỐ DISACCARIT 2.1 Nguyên lý Disaccarit gồm monosaccarit cấu tạo nên Tùy vào công thức cấu tạo (cách kết hợp hai monosaccarit) mà disaccarit có tính chất hóa học khác nhau, có tính khử tính khử Một số disaccarit phổ biến là: saccarose, lactose, mantose Saccarose disaccarit gồm monosaccarit cấu tạo nên -D-Glucose -D-Fructose Mantoz (đường mạch nha), cấu tạo từ phân tử -DGlucoz Lactoz (đường sữa) disaccarit cấu tạo nên từ phân tử -Dgalactoz -D-Glucoz Bằng cách tiến hành thí nghiệm kết luận disaccarit có tính khử 2.2 Dụng cụ, hóa chất cách tiến hành thí nghiệm * Dụng cụ: chuẩn bị ống nghiệm sạch, pipet, nồi cách thủy * Hóa chất: thuốc thử Fehling (pha trên), dung dịch HCl đặc, dung dịch saccarose 1%, mantose 1%, lactose 1% * Cách tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm 1: Lấy ống nghiệm sạch, đánh số để nhận biết, cho vào ống 1ml dung dịch disaccarit tương ứng + 1ml dung dịch Fehling Đun ống nghiệm nồi cách thủy sôi khoảng 10 phút Lấy quan sát, so sách tượng, kết luận đường có tính khử? giải thích? Thí nghiệm Sau tiến hành thí nghiệm Tiến hành làm thí nghiệm với đường tính khử thí nghiệm Thí nghiệm với loại đường cần ống nghiệm Cho vào ống 1ml dung dịch đường cần làm thí nghiệm Ống cho thêm giọt nước cất, ống cho thêm giọt HCl đặc Đun hai ống nghiệm nồi cách thủy sôi khoảng 10 phút Lấy cho thêm vào ống 1-2ml dung dịch Fehling, tiếp tục đun nồi cách thủy khoảng 5-10 phút Lấy quan sát tượng giải thích Kiểm tra tính khử tinh bột 3.1 Nguyên lý Tinh bột thuộc nhóm polisaccarit, đơn phân cấu tạo nên Glucoz Khi có tác nhân xúc tác thích hợp tinh bột bị thủy phân tạo thành đơn phân Tinh bột bị thủy phân môi trường axit đun nóng xúc tác enzyme đặc hiệu 3.2 Dụng cụ, hóa chất cách tiến hành thí nghiệm * Dụng cụ: chuẩn bị ống nghiệm sạch, pipet, nồi cách thủy * Hóa chất: thuốc thử Fehling (pha trên), dung dịch HCl đặc, dung dịch tinh bột 1%.: hòa tan 1g tinh bột nước cất, thêm vào nước cất khoảng 800C, khuấy đều, tiếp tục đun sôi, để nguội, thêm nước cất đến 100ml * Cách tiến hành thí nghiệm Cho vào ống nghiệm, ống ml dung dịch tinh bột 1% Ống cho thêm giọt nước cất, ống cho thêm giọt HCl đặc, ống cho thêm 1ml dịch enzyme (nước súc miệng) Đun ống 1, nồi cách thủy sôi khoảng 30 phút; ống để nhiệt độ phòng (hoặc ủ 370C) 30 phút Lấy ống nghiệm ra, cho vào ống, ống 1ml dung dịch Fehling Đun ống nồi cách thủy 10 phút Quan sát tượng, kết luận giải thích tượng PHẢN ỨNG CỦA TINH BỘT VỚI IOD 4.1 Nguyên lý Tính chất hóa học đặc trưng tinh bột tạo phức màu xanh với iod Tính chất thành phần amiloz tinh bột định Màu xanh bị đun nóng hồi phục lại sau làm lạnh Tuy nhiên đun nóng mạnh đến mức dung dịch trắng hoàn toàn màu xanh không hồi phục dù có làm lạnh dung dịch 4.2 Dụng cụ, hóa chất cách tiến hành thí nghiệm * Dụng cụ, hóa chất * Dụng cụ: ống nghiệm sạch, đèn cồn *Hóa chất: thuốc thử Liugon, dung dịch tinh bột 1% * Cách làm: cho vào ống nghiệm ml dung dịch tinh bột, thêm vài giọt thuốc thử Liugon, quan sát màu giải thích Đun nóng hỗn hợp trên đèn cồn đến dung dịch vừa màu xanh đen, lấy làm lạnh, quan sát giải thích Tiếp tục đun lửa đèn cồn, lần kỹ (sau dung dịch mầu đun tiếp khoảng phút đun nồi cách thủy sôi khoảng 40 phút), lấy làm lạnh, quan sát màu giải thích Tiếp tục cho thêm 1- giọt Liugon vào ống nghiệm  quan sát màu giải thích tượng ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO PHƯƠNG PHÁP BERTRAND a) Cơ sở lý thuyết phương pháp Tất đường có nhóm andehit hay nhóm xeto tự do, điều kiện định có khả tham gia vào phản ứng oxi hóa – khử với ion kim loại gọi đường khử Phương pháp dựa khả khử dung dịch Cu2+ môi trường kiềm để định lượng loại andoz hay xetoz hay disaccarit có tính khử Quá trình định lượng đường khử tiến hành theo bước sau: - Đun dung dịch kiềm Cu2+ (dung dịch Fehling) với dung dịch đường để tạo thành Cu2O - Sau rửa sạch, kết tủa Cu2O hòa tan dung dịch sắt III sunfat Phản ứng xảy sau: Cu2O +Fe2(SO4)3 + H2SO4 = 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O - Chuẩn độ Fe2+ dung dịch KMnO4 0,1N: 10FeSO4 + 2KMnO4 +8H2SO4 = Fe2(SO4)3 + K2SO4 + MnSO4 + 8H2O Chuẩn độ Fe2+ dung dịch KMnO4 0,1N Từ lượng KMnO4 chuẩn độ tính lượng đồng (Cu2O) Đối chiếu vơi bảng Bertrand tính lượng đường tương ứng Bảng Bertrand thành lập dựa vào thực nghiệm b) Tiến hành thí nghiệm - Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch Fehling có công thức pha dung dịch KMnO4 0,1N; dung dịch Fe2(SO4)3 H2SO4 - Cách làm:  Chuẩn bị dịch đường khử: Cân lượng chất thử nghiền nhỏ (ghi lại khối lượng cân được), cho nước tiếp tục nghiền Sau dồn tất vào cốc thủy tinh đun cách thủy 800C 15 phút, lắc đun, đem kết tủa protein chì axetat Loại axetat Na2HPO4 Na2SO4 Sau lọc qua giấy lọc đo thể tích dịch lọc thu Dịch sử dụng để định lượng đường khử  Cho vào bình tam giác 10ml dịch lọc + 20ml hỗn hợp Fehling Đậy bình miếng kính đặt bếp điện đun sôi nhanh Đun phút kể từ xuất bọt  Làm lạnh, lọc qua giấy lọc Buchner với lớp giấy lọc dày Chú ý giữ kết tủa lại bình lớp oxit (ở giấy lọc bình) phải có lớp nước để Cu2O không bị oxi hóa bới oxi không khí  Đặt phễu Buchner bình nón có chứa kết tủa Đổ vào phễu 15ml dung dịch Fe2(SO4)3 H2SO4 chảy từ từ xuống bình, lắc, quan sát xem kết tủa phễu bình hòa tan hết chưa, chưa tiếp tục thêm dung dịch Fe2(SO4)3 Sau phản ứng kết thúc, rửa phễu nước nóng nước rửa không phản ứng axit giấy quỳ  Chuẩn độ dung dịch bình (Fe2+) dung dịch KMnO4 xuất màu hồng bền 30 giây - Tính kết quả: Từ lượng KMnO4 dùng để chuẩn độ tìm lượng đồng Từ lượng đồng tra bảng tìm thấy lượng đường tương ứng Từ kết tính % đường theo dung dịch: X(mg%)  a.100 20 a- Số mg đường nhận IV VIẾT BÁO CÁO SV viết báo cáo trình bày trình làm thí nghiệm, kết thu được, tính toán giải thích tượng BÀI 2: LIPIT (Glyceride) Lipit hợp chất hữu có tế bào sống, không tan nước, tan dung môi hữu không phân cực như: clorofom, ete, xăng, benzen… Lipit chia thành nhóm Lipit đơn giản lipit phức tạp Sau số phương pháp định tính Lipit Mỡ trung tính ete glixerol axit béo cao Tùy theo thành phần axit béo phân tử mà mỡ tồn trạng thái lỏng hay rắn nhiệt độ thường Tính tan tạo thành nhũ tương mỡ - Dụng cụ: chuẩn bị ống nghiệm - Hóa chất: dầu thực vật, etanol, xăng, dung dịch xà phòng - Cách tiến hành thí nghiệm: đánh số thứ tự cho ống nghiệm Lần lượt cho vào ống 2ml nước, 2ml etanol, 2ml xăng, 2ml dung dịch xà phòng Thêm vào ống vài giọt dầu thực vật, lắc đều, quan sát tượng, so sánh tính tan tạo nhũ tương dầu thực vật loại dung môi giải thích Phản ứng phân biệt thành phần cấu tạo mỡ a) Phản ứng xà phòng hóa Dưới tác dụng kiềm, mỡ bị thủy phân tạo thành glixerin axit béo Các axit béo phản ứng với xút để tạo thành xà phòng - Hóa chất: dầu ăn, dung dịch NaOH 40% cồn - Cách tiến hành thí nghiệm: cho vào cốc mỏ 50ml: 2ml dầu ăn + 10ml dung dịch NaOH 40% cồn Vừa đun vừa khuấy khoảng 15 – 20 phút đến thấy váng màu vàng nhạt Lấy đũa thủy tinh vớt váng cho vào ống nghiệm, thêm nước cất, lắc mạnh thấy bọt xà phòng b) Sự tạo thành axit béo tự Xà phòng muối axit béo Dưới tác dụng axit vô đặc, axit béo giải phóng, không tan nước mà mặt nước - Hóa chất: Dung dịch xà phòng 2%, H2SO4 đặc HCl đặc - Cách tiến hành thí nghiệm: cho vào bình tam giác 20ml dung dịch xà phòng, thêm H2SO4 đặc HCl đặc môi trường có pH axit (thử giấy quỳ) Dung dịch trở nên đục axit béo giải phóng Đun dung dịch tới sôi axit béo mặt nước (hoặc đun dung dịch nồi cách thủy khoảng 30 phút) Xác định số số lipit a) Xác định số axit - Chỉ số axit tổng số mg KOH cần thiết để trung hòa axit béo tự có 1g lipit Chỉ số đánh giá độ tươi mỡ, dầu Chỉ số tăng theo thời gian bảo quản dầu mỡ - Cách làm: Cân xác 1g dầu ăn vào ống thủy tinh, thêm 10ml cồn để hòa tan axit béo tự (có thể đun hỗn hợp nồi cách thủy để hòa tan hoàn toàn axit béo tự do) Sau cho vài giọt phenolphtalein chuẩn độ axit béo tự KOH 0,01N có màu hồng nhạt Chỉ số: XA = A.f.0,56 Trong đó: 0,56 : Số mg KOH tương ứng với 1ml KOH 0,01N A : Số ml dung dịch KOH dùng f : Hệ số hiệu chỉnh dung dịch KOH 0,01N b) Xác định số xà phòng hóa - Chỉ số xà phòng hóa số mg KOH cần thiết để trung hòa axit béo tự axit béo có liên kết este gliceride - Hóa chất: Dầu ăn; dung dịch KOH 0,5N; phenolphtalein; HCl 0,5N - Cách làm: Lấy bình tam giác 50ml, cho vào 1g dầu ăn, thêm 10ml KOH 0,5N cồn Đậy bình kính, đun bình nồi cách thủy khoảng 50 – 60 phút Phản ứng xem kết thúc dung dịch bình trở nên suốt Sau xà phòng hóa xong, lấy bình làm nguội cho thêm vào bình vài giọt phenolphtalein chuẩn độ dung dịch HCl 0,5N - Tính kết quả: 1ml dung dịch KOH 0,5N tương ứng với 28mg KOH Lượng mg KOH dung để trung hòa tất axit béo 1g dầu thí nghiệm là: X(mg) = Trong đó: 15  B .28 a 15- Lượng KOH 0,5N ban đầu B- Lượng HCl 0,5N dùng để chuẩn độ a: Khối lượng dầu lấy làm thí nghiệm (tính g) (trong TN a=1) Định lượng Liptit phương pháp Soxlet - Nguyên liệu hóa chất: Mẫu cần định lượng Lipit; Ete ethylic loại nước Peroxyd - Dụng cụ: Cối xay sứ, giấy Whatman số 1, Soxlet, cân, bình hút ẩm - Cách làm: Nguyên liệu xấy khô đến trọng lượng không đổi 1001050C Cân xác mg mẫu (VD m=5, thêm 5-10g Na2SO4 Na2HPO4 sấy khô nhiệt độ 100-1050C 6-8h) Giã nhỏ chuyển vào bột mẫu vào túi giấy Cho dung môi vào bình cầu (khoảng 1/3 thể tích bình cầu), đặt gói nguyên liệu vào phận Sexlet Lắp ống sinh hàn, sau đặt thiết bị vào nồi cách thủy (34-360C) chiết rút hết lipit khỏi mẫu (6-8h) Sau chiết rút xong, lấy gói mẫu sấy 20 -300C để loại dung môi, sấy 100-1050C trọng lượng không đổi Chú ý: Thí nghiệm phải thực tủ hút Sau thí nghiệm xong, ete dư chưng cất thu hồi để sử dụng lần sau - Kết quả: Lượng chất béo có 100g nguyên liệu tính theo công thức: X  A  B .100 C A- Trọng lượng gói nguyên liệu trước chiết rút lipit (g) B- Trọng lượng gói nguyên liệu sau chiết rút lipit (g) C- Lượng nguyên liệu lấy để xác định Lipit - Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch Riboflavin 0,015% (giữ tối), HCl đặc Zn kim loại - Cách làm: cho vào ống nghiệm 1ml Dung dịch Riboflavin 0,015%, 10 giọt HCl đặc, viên Zn, lắc nhẹ, quan sát tượng Giải thích tượng quan sát b) Phản ứng với AgNO3 Trong môi trường trung tính hay axit yếu (pH = 6,5 – 7,2), riboflavin phản ứng với AgNO3 tạo thành hợp chất hồng hay đỏ - Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch Riboflavin 0,015% (giữ tối), AgNO3 (bảo quản lọ nâu) - Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml Dung dịch Riboflavin 0,015%, thêm 0,5 ml AgNO3, quan sát xuất màu hồng hay đỏ (cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ riboflavin dung dịch) Vitamin B5 (axit nicotinic, nicotinamit hay Vitamin PP) a) Phản ứng với đồng axetat Trong môi trường axit yếu axit nicotinic phản ứng với muối đồng (CH3COO)2Cu tạo thành muối nicotinat, kết tủa màu xanh đặc trưng Phản ứng xảy sau - Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch axit nicotinic 1%, CH3COOH 15%, (CH3COO)2Cu - Cách làm: Cho vào ống nghiệm 20 giọt CH3COOH 15%, đun hỗn hợp đến sôi, thêm 10 – 20 giọt (CH3COO)2Cu Quan sát hình thành kết tủa với màu đặc trưng b) Phản ứng với NaOH Khi đun nóng nicotinamic với NaOH tạo thành natri nicotinat giải phóng NH3: - Nguyên liệu hóa chất: nicotinamic dạng bột NaOH 40% - Cách làm: cho bột nicotinamic vào ống nghiệm, thêm 2ml nước 1ml NaOH 40%, đun sôi phút nồi cách thủy, mùi đặc biệt xuất Dùng mảu quỳ đặt miệng ống nghiệm quan sát đổi màu giấy thị VitaminB6 (piridoxin) Phản ứng với FeCl3 Dưới tác dụng FeCl3 piridoxin tạo thành phức chất có màu đặc trưng - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch piridoxin 1%, FeCl35% - Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch piridoxin 1%, thêm giọt FeCl3, lắc đều, quan sát xuất màu phức chất Giải thích Vitamin C (axit ascocbic) Vitamin C hợp chất không no, có khả phân ly cho ion H+, có tính axit có tên axit ascocbic Vitamin C tồn hai dạng: dạng oxi hóa dạng khử theo phản ứng sau: Vitamin C có nhiều rau, quả, tham gia tích cực vào trình oxi hóa – khử Có thể tiến hành định tính định lượng Vitamin C theo tính chất khử Khi tham gia phản ứng oxi hóa – khử Vitamin C khử số chất từ dạng có màu thành không màu từ dạng hóa trị cao xuống hóa trị thấp như: kali ferixianua K3[Fe(CN)6], xanh metylen, dung dịch iod,… a) Phản ứng khử K3[Fe(CN)6 Axit ascocbic khử K3[Fe(CN)6] thành K4[Fe(CN)6] sau K4[Fe(CN)6] tác dụng với Fe3+ tạo thành hợp chất Fe4[Fe(CN)6]3 có màu xanh biển đến màu xanh Phản ứng xảy sau: 3K4Fe(CN)6 + 4FeCl3 = 2Fe4[Fe(CN)6]3 +12KCl (xanh nước biển) Nguyên liệu hóa chất: dung dịch Vitamin C 0,1%, K3[Fe(CN)6]1% KOH 5%, FeCl3 1%, xanh metylen 0,01%, HCl 10%, dung dịch iod 0,01N, NaOH 5% - Cách làm: Cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch Vitamin C, giọt dung dịch KOH 5%, 1ml dung dịch K3[Fe(CN)6] 1%, lắc mạnh hỗn hợp ống Sau thêm vào ống nghiệm – giọt dung dịch HCl 10% 0,5ml dung dịch FeCl3, lắc nhẹ Quan sát xuất kết tủa, màu giải thích b) Phản ứng với iod - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch Vitamin C0,1%, dung dịch iod 0,01N, NaOH 5% - Cách làm: Lấy ống nghiệm, cho vào ống I: 2ml dung dịch Vitamin C, ống II: 2ml nước cất Sau thêm vào ống giọt dung dịch iod 0,01N, lắc Quan sát, giải thích khác biệt ống c) Phản ứng với xanh metylen - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch Vitamin C 0,1%, dung dịch xanh metylen 0,01%, NaOH 5% - Cách làm: Lấy ống nghiệm, cho vào ống I: 1ml dung dịch Vitamin C, ống II: 1ml nước cất Sau thêm vào ống – giọt xanh metylen 2-3 giọt NaOH 5% Lắc quan sát màu hai ống Nếu thay đổi màu, đặt hai ống nghiệm vào nồi cách thủy 37 – 400C Quan sát màu dung dịch ống nghiệm sau vài phút, giải thích kết Viết báo cáo Bài PROTEIN VÀ AMINO ACID Phản ứng kết tủa thuận nghịch protein a) Kết tủa muối trung tính Muối trung tính vừa làm trung hòa điện tích (do ion tác dụng tương hỗ với nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hidrat phân tử keo Các protein khác bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, dùng muối để tách riêng protein khỏi hỗn hợp chúng - Nguyên liệu hóa chất: Lòng trắng trứng không pha loãng, (NH4)2SO4 bão hòa, NaCl bão hòa, tinh thể (NH4)2SO4 - Cách làm: Cho vào ống nghiệm 5ml lòng trắng trứng không pha loãng, (NH4)2SO4 bão hòa, lắc xuất kết tủa globulin Để phút, lọc (thấm ướt giấy lọc dịch (NH4)2SO4) Cho vào dịch lọc 3g tinh thể (NH4)2SO4 (nếu dịch lọc 4ml), lắc, anbumin kết tủa, lọc, thu lấy kết tủa Cho riêng kết tủa globulin anbumin vào ống nghiệm tương ứng, thêm vào ống khoảng – ml nước cất, lắc, quan sát so sánh hòa tan kết tủa b) Kết tủa dung môi hữu Nếu tiến hành kết tủa protein nhiệt độ thấp (0-40C) lấy kết tủa nhanh khỏi dung môi, protein không bị biến tính (có thể hòa tan lại) Nếu nhiệt độ cao (20-300C) kết tủa bị giữ lâu dung môi hữu protein bị biến tính - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 1%, etanol 96%, axeton, NaCl bão hòa - Cách làm: Lấy ống nghiệm, cho vào ống 1ml dung dịch lòng trắng trứng 1%, làm lạnh nước đá Thêm vào ống I: 2ml etanol 96% lạnh, ống II: 2ml axeton lạnh, quan sát; cho thêm vào hai ống vài giọt dung dịch NaCl bão hòa, kết tủa lắng xuống đáy ống nhanh Sau kết tủa lắng xuống đáy ống, gạn bỏ lớp dung môi, thêm nước vào, lắc đều, kết tủa tan Làm lại thí nghiệm nhiệt độ 20 -300C, quan sát so sánh với thí nghiệm Sự biến tính protein Sự biến tính protein thuật ngữ dùng để biến đổi cấu trúc phân tử protein (từ cấu trúc bậc trở lên) dẫn đến thay đổi số tính chất tính tan, hoạt tính sinh học,… Khi bị biến tính protein thường đông tụ thành dạng keo không hòa tan Điều thấy rõ biến tính xảy pH đẳng điện Nếu biến tính xảy pH khác pHi (trong môi trương kiềm mạnh axit mạnh), phân tử protein dạng tích điện nên không đông tụ lại mà dạng hòa tan dung dịch Tuy nhiên dùng muối trung tính để trung hòa điện, protein đông tụ thành kết tủa Các yếu tố gây biến tính protein nhiệt độ cao, axit vô đặc, số axit hữu với nồng độ cao….Một số chất khác ure, guanidin,…có tác dụng phá hủy liên kết hidro, phá hủy cấu trúc bậc 2, 3, phân tử protein a) Kết tủa protein muối kim loại nặng Những muối kim loại nặng như: Cu2+, Fe3+, Pb2+,…) tác dụng với protein tạo thành kết tủa không tan Nhưng dư thừa muối, kim loại lại tan phân tử keo hấp thụ ion kim loại nặng, trở nên tích điện Ion có hóa trị cao dễ tan trở lại - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 5%, FeCl3 5%, chì axetat (CH3COO)2Pb 5%, CuSO4 7% - Cách làm: Lô I: lấy ống nghiệm, cho vào ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5% Thêm vào ống I: giọt dung dịch FeCl3 5% Ống II: giọt chì axetat 5% Ống III: giọt CuSO4 7% Quan sát kỹ Sau cho thêm lượng muối kim loại nặng tương ứng vào ống So sánh tan kết tủa Lô II: Làm tương tự lô I không thêm vào ống lượng muối kim loại tương ứng, cho vào ống nghiệm 3-4 ml nước  lắc  quan sát xem kết tủa có tan hay không? b) Tác dụng nhiệt độ cao - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 5% (đã lọc qua giấy lọc nhiều lần), axit axetic 1% 10%, NaCl bão hòa - Cách làm: cho vào ống nghiệm, ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5% Đun ống I theo dõi kết tủa protein Thêm vào ống II: giọt axit axetic 1% đun, kết tủa protein không hình thành đun sôi Thêm vào ống IV: 0,5 ml axit axetic 10% 3-4 giọt NaCl bão hòa Đun, protein kết tủa nhanh nhiều So sánh giải thích khác biệt mức độ kết tủa ống c) Tủa protein axit vô đặc Các axit vô đặc axit nitric hay axit sunfuric, … có tác dụng lấy nước thay đổi trạng thái tích điện phân tử keo, gây kết tủa protein Nếu kéo dài thời gian tác dụng, kết tuả bị hòa tan Với axit nitric kết tủa bị hòa tan chậm - Nguyên liệu hóa chất: Dung dịch lòng trắng trứng 5%, H2SO4 đặc - Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml H2SO4 đặc, sau cầm nghiêng ống, nhỏ cẩn thận theo thành ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5% Ở mặt tiếp xúc hai chất lỏng tạo thành kết tủa protein d) Kết tủa protein axit hữu Khi cho axit tricloaxetic (TCA) hay axit sunfosalisilic vào dung dịch protein protein kết tủa Phản ứng dùng rộng rãi thực tế: người ta thường dùng axit tricloaxetic để phát để loại bỏ protein khỏi dung dịch, dùng axit sunfosalisilic để phát protein nước giải (phản ứng có độ nhạy đến 0,0015%) - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 5%, axit sunfosalisilic, axit tricloaxetic (TCA) 10% - Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch lòng trắng trứng 5%, thêm 5-10 giọt dung dịch axit sunfosalisilic hay TCA 10% Quan sát xuất kết tủa protein giải thích e) Kết tủa protein thuốc thử ankaloit Protein ankaloit có nhóm –NH2 nên phần lớn thuốc thử ankaloit có tác dụng kết tủa protein (trong môi trường axit) - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 5%, axit picric 10%, dung dịch tanin bão hòa, axit aceitc 1%, 10%; kali feroxianua [K4fFe(CN)6] 5% - Cách làm: Cho vào ống nghiệm ống 1ml dung dịch lòng trắng trứng 5% Thêm vào ống I: – giọt axit picric 10% 2- giọt axit acetic 1%: xuất tủa chuyển thành màu vàng Thêm vào ống II: 2-4 giọt dung dịch tanin bão hòa – giọt axit axetic 1%: xuất kết tủa màu xám (tanin dùng để tủa protein công nghiệp thuộc da) Thêm vào ống III: giọt axit axetic 10% 3-5 giọt kali ferixianua 5%, xuất tủa màu vàng Các phản ứng màu protein a) Phản ứng biure Đây phản ứng đặc trưng liên kết peptit Trong môi trường kiềm hợp chất chứa từ liên kết peptit trở lên phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím đỏ màu tùy thuộc vào số lượng liên kết peptit nhiều hay Hóa thức phản ứng sau: Phản ứng biure sử dụng để định lượng protein - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 1%, ure tinh thể, NaOH 10%, CuSO4 1% - Cách làm: * Phản ứng với biure: Cho vào ống nghiệm khô tinh thể ure, đun lửa yếu Lúc đầu ure nóng chảy đến bắt đầu cứng ngừng đun Quá trình tạo biure, axit xianuric amoniac (có thể ngửi mùi thử giấy quỳ tím) Để ống nguội, thêm vào 2ml NaOH 10%, lắc cho tan, thêm vài giọt CuSO4, quan sát màu (chú ý không cho nhiều CuSO4 màu xanh Cu(OH)2 tạo thành lấn án màu phản ứng) * Phản ứng với protein: Cho vào ống nghiệm 3ml dung dịch lòng trắng trứng 1%, 1ml NaOH 10%, 1-2 giọt CuSO4 1%, lắc kỹ, quan sát màu giải thích b) Phản ứng với axit nitrơ Dưới tác dụng HNO2, axit amin bị dezamin hóa tạo thành nitơ dạng khí Phản ứng dùng để định lượng α – axit amin (phương pháp Van Slyke) Phản ứng xảy sau: - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch glixin 0,5%, NaNO2 10%, axit axetic 2N - Cách làm: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch NaNo2 10%, 2ml dung dịch axit axetic 2N 0,5 ml dung dịch glixin 0,5% Quan sát xuất bọt khí giải thích c) Phản ứng Pauli để phát histidin tizozin Khi tác dụng với axit diazobenzensunfonic (thuốc thử diazo), histidin tạo thành phức chất có màu mận chín, tizozin tạo phức chất có màu da cam Hóa thức phản ứng sau: + Sự tạo thành axit diazobenzensunfonic: + Phản ứng histidin: + Phản ứng tirozin - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch histidin tizozin chuẩn (0,1%), Na2CO3 10% Chuẩn bị thuốc thử Pauli: hòa tan 1g axit sunfanilic 100ml HCl 1N, sau trộn với 10ml dung dịch nitrit natri 0,7% nước cất - Cách làm: Nhỏ dung dịch histidin tizozin giấy lọc, hơ nhẹ cho khô sau phun thuốc thử Pauli lên, làm khô giấy., Cuối phun lên giấy dung dịch Na2CO3 10% Quan sát, so sánh giải thích kết thu Xác định hàm lượng nitơ amin – amoniac (Theo tiêu chuẩn TCVN 370790) a) Nguyên tắc: Cho foocmon tác dụng với nhóm amin (của axitamin, peptit, ) với muối amon có mẫu thử Chuẩn độ nhóm COOH giải phóng phản ứng dung dịch NaOH 0,1N dung dịch đạt đến pH=9,2 Dựa vào lượng kiềm tiêu tốn chuẩn độ để tính hàm lượng nitơ amin – amoniac b) Dụng cụ hóa chất: - Dụng cụ: Bình định mức dung tích 100, 250, 1000ml; Bình nón, cốc thủy tinh dung tích 100 250ml; Pipet 1, 10, 25ml; buret 25ml; phễu thủy tinh; giấy lọc, đũa thủy tinh; cân phân tích độ xác 0,001g - Hóa chất: + dung dịch HCl 0,1N; + dung dịch NaOH 0,1N; + Bromothimol xanh, dung dịch 0,05% etanol 60%; + dung dịch phenolphtalein 0,05% etanol 60%; + dung dịch thimolphtalein 1% etanol 60%; + foocmon trung tính 30% (50 thể tích dung dịch foocmon 30% hòa tan với thể tích dung dịch thimolphtalein 1%, thêm dung dịch NaOH 0,1N dung dịch vừa có màu xanh nhạt) + Chỉ thị hỗn hợp: trộn 5V Bromothimol xanh, dung dịch 0,05% etanol 60% với 4V dung dịch phenolphtalein 0,05% etanol 60% + Nari hydrophotphat, dung dịch M/15 (A): Cân xác 2,59g Na2HPO4.12H2O (hoặc 1,1876g Na2HPO4.2H2O) hòa tan, định mức tới 100ml bình định mức + Kali dihydrophotphat, dung dịch M/15 (B): cân xác 0,707g KH2PO4, hòa tan nước cất định mức tới 100ml bình định mức + Dung dịch đệm pH=7: Pha lẫn 61,2 ml dung dịch A với 38,8 ml dung dịch B + Dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 7: cho vào bình nón dung tích 100ml: 20ml dung dịch đệm pH=7 0,1ml dung dịch thị hỗn hợp, dung dịch có màu xanh mạ; + Dung dịch đệm pH=9,2: Cân xác 1,9018 Nari tetraborat (Na2B4O7.10H2O), hòa tan nước cất định mức tới 100ml bình định mức + Dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 9,2: cho vào bình nón dung tích 100ml: 20ml dung dịch đệm pH=9,2; 1ml dung dịch thị hỗn hợp, dung dịch có màu tím d) Tiến hành thí nghiệm Cân xác 10 – 15g mẫu thử vào cốc thủy tinh dung tích 100ml Dùng nước cất hòa tan mẫu chuyển toàn (cả nước tráng cốc) vào bình định mức dung tích 250ml, thêm nước cất đến khoảng 200ml Sau lắc phút, để yên phút, lặp lại lần Thêm nước cất đến vạch định mức lọc Dùng pipet lấy xác 20ml dịch lọc vào bình nón dung tích 250ml, thêm 1ml dung dịch thị hỗn hợp, trung hòa dịch lọc dung dịch có màu giống dung dịch màu tiêu chuẩn pH = Sau dùng pipet cho thêm 20ml dung dịch foocmon trung tính 30%, đậy bình lại, để yên phút Chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N dung dịch có màu giống màu dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 9,2 Tiến hành xác định mẫu trắng với tất lượng hóa chất bước thử nghiệm trên, thay dịch mẫu thử 20ml dịch nước cất e) Tính kết Hàm lượng nitơ amin – amoniac (X10) tính % theo công thức: X 10  (V1  V2 ).0,0014.250.100 20.m Trong đó: V1: Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính ml; V2: Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính ml; m: Khối lượng mẫu thử, tính g; 0,0014: Số g nitơ tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0,1N; 250: Thể tích toàn dịch lọc tính ml; 20: Thể tích dịch lọc để xác định, tính ml; 100: hệ số tính % Chú thích: Đối với nước mắm mẫu thử pha loãng 20 lần, lấy 20ml dịch pha loãng để xác định Hàm lượng nitơ amin – amoniac (X10) tính g/ml theo công thức: X 10  (V1  V2 ).0,0014.20.1000  1,4.(V1  V2 ) 20 Trong đó: 20: Độ pha loãng nước mắm; 20: thể tích dịch pha loãng để xác định, tính ml; 1000: hệ số tính g/l Viết báo cáo - Nêu nguyên lý, cách tiến hành thí nghiệm - Mô tả giải thích tượng quan sát - Tổng hợp kết lại theo bảng sau: STT Tên nhóm chất làm kết Hóa chất tủa protein Dung môi hữu Axit vô Axit hữu Muối kim loại nặng Thuốc tử ankaloit Màu kết tủa Ghi - Tính kết phần định lượng Bài : ENZYME Enzyme có chất hóa học protein protein kết hợp với thành phần khác, có vai trò xúc tác cho phản ứng hóa sinh Hoạt độ Enzyme thuộc vào yếu tố vật lý hóa học khác như: nhiệt độ, pH môi trường số chất có chất hóa học khác Các chất đóng vai trò chất ức chế kìm hãm Enzyme Sau giới thiệu số thí nghiệm định tính số Enzyme Amylase nước bọt Amylase người thuộc loại α– Amylase, xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột tạo thành dixtrin khác Các dixtrin khác khối lượng phân tử, khả cho phản ứng màu với iod, khả khử dung dịch Fehling - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch tinh bột 1%, thuốc thử Liugon, thuốc thử Fehling - Cách làm: Chuẩn bị dung dịch nước bọt: súc miệng sạch, lấy 50ml nước cất súc miệng nhẹ vài lần khoảng – phút Lọc dịch nước bọt qua dịch lọc dùng để thí nghiệm Thí nghiệm Thủy phân tinh bột Chuẩn bị ống nghiệm, cho vào ống 5ml dung dịch tinh bột Thêm vào ống I: 5ml dung dịch nước bọt, ống II: 5ml dung dịch nước cất Lắc hai ống Ủ hai ống tủ ấm 37-400C vòng 30 phút (cứ phút dùng pipet lấy từ ống nghiệm 1ml vào ống nghệm khác), sau 30 phút lấy thêm khoảng 1-2 giọt thuốc thử Liugon vào ống nghiệm Quan sát màu dãy thí nghiệm giải thích Thí nghiệm với thuốc thử Fehling Thêm vào ống nghiệm ml thuốc thử Fehling, đun sôi, quan sát tượng Giải thích tượng quan sát Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính Amylase Hóa chất: Dung dịch nước bọt chuẩn bị trên, dung dịch tinh bột 1%, thuốc thử Liugon dung dịch iod 0,3% KI 3% Cách làm: Lấy ống nghiệm, cho vào ống 3ml dung dịch tinh bột 1% Đặt ống vào nồi cách thủy sôi, ống vào tủ ấm 370C, ống vào nước đá Giữ 15 phút để dung dịch ống đạt nhiệt độ tương ứng Cho vào ống ml dung dịch nước bọt nhiệt độ tương ứng tiếp tục ủ điều kiện nhiệt độ cũ Sau 4, 8, 10 15 phút lấy ống 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm khác (chú ý dùng pipet sạch) cho vào giọt thuốc thử Liugon quan sát So sánh giải thích Urease Urease xúc tác cho phản ứng thủy phân ure tạo thành amoniac khí CO2 - Nguyên liệu hóa chất: dung dịch ure 1%, dung dịch phenolphtalein 1% etanol dung dịch Urease chuẩn bị qua bước sau: Loại lipit khỏi nguyên liệu: cân 100g đậu tương khô, nghiền nhỏ, cho vào bình, lắc 10 – 15 phút với 200ml ete dầu hỏa để loại lipit (hoặc dùng xăng thay ete), lọc qua phễu lọc Buchner Lặp lại bước 5-6 lần, sau rải bột giấy lọc để làm bay dung môi hữu Bột khô thu dùng để tách Urease Chuẩn bị dung dịch Urease: cho 20 – 30 g bột đậu tương loại lipit vào cốc bình nón, thêm lần thể tích nước cất, lắc đều, cho vài giọt toluen, để 1520 50C Ly tâm 3000 vòng/phút 20 phút Dung dịch suốt nhận chứa Urease dùng cho thí nghiệm - Thiết bị: Tủ ấm nồi cách thủy ổn nhiệt (370C) - Cách làm: Lấy ống nghiệm, cho vào ống 2ml dung dịch Urease (đã pha loãng 10 lần Ống I đun sôi để bất hoạt enzyme, ống II để nguyên Cho vào ống 2ml dung dịch ure giọt dung dịch phenolphtalein, lắc đều, giữ 370C 30 phút Quan sát chuyển màu hỗn hợp phản ứng giải thích kết Viết báo cáo Bài báo cáo gồm có nội dung sau: - Cơ sở lý thuyết thí nghiệm - Các bước tiến hành thí nghiệm - Kết giải thích kết ... sinh viên cần đạt mục tiêu sau: - Biết cách pha hóa chất, thao tác th nghiệm th nh th o - Biết tự bố trí th nghiệm, giải th ch tượng th nghiệm - Áp dụng quy tắc th nghiệm vào trường hợp th c... bước tiến hành th nghiệm * Hóa chất: - dung dịch Glucoz 1% - Thuốc th Fehling * Cách pha hóa chất: Thuốc th Fheling gồm th nh phần: Fehling A Fehling B Cách pha sau :- Dung dịch Fehling A: Hòa... dụng với anilin tạo th nh 2-metyl-3-phenylamino-1,4naphtoquinon có màu đỏ đặc trưng Phản ứng xảy sau: - Hóa chất: Dung dịch Vitamin K 0,1% etanol tuyệt đối, thuốc th anilin - Cách làm: Cho vào