Thực hành hóa sinh học

Ọ Ọ Ậ 11 2015 i Ậ T T T ệ T ự Q Ồ T K T ệ –T ự K T V Q M K n so n Ậ ThS r n n vị r ThS u tr n m n Ị n 11 2015 ii ệ T ự H ệ viên T - ệ - ệ - L : S Q - nQ - S - K - K T T ệ –T ự S X on u n n 29 t t n 11 năm 2015 n Ậ iii T ệ N on u n n ệ 29 t n 11 năm 2015 n so n Ậ iv trang ƯƠN Á N UYÊN TẮ TRON T Í N N ệ IỆM Ĩ SIN Ọ ù ệ P 15 ƯƠN PROTEIN 22 ệ 22 2.2 C 26 ầ 2.3 C 32 2.4 C 39 ầ 2.5 X ằ 44 ƯƠN GLUCID 47 3.1 G ệ glucid 47 3.2 C 51 3.3 C 59 ƯƠN LIPID 67 4.1 G ệ 67 ệ 4.2 C 4.3 C ỉ ố 71 74 4.4 C 79 ƯƠN VITAMIN 83 5.1 G ệ 83 5.2 C vitamin 85 5.3 C 91 ƯƠN K ẢO SÁT ENZYM 98 6.1 K 98 6.2 K 6.3 K ầ 99 102 ƯƠN ACID NUCLEIC 104 7.1 G ệ 104 7.2 P 105 73 107 74 109 ƯƠN SỰ TR O ỔI ẤT 113 8.1 Sự ổ 113 8.2 Sự ổ 116 8.3 Sự ổ 118 TÀI LIỆU T M K ẢO 121 v ù Tỉ B ệ ố ố ổ 17 17 ố ẫ 39 KM O4 (1/30 N) 61 vi M ự è Hình 1.3 Cách Hình 1.4 Cách ệ M ố N 11 ố 12 S 22 23 24 Hình 2.4 T ỡ 24 K ằ K ố 31 37 K 41 ẩ 45 α β 48 48 33 amylose 48 34 49 35 50 36 50 37 50 38 K 53 39 K 56 K ệ 57 68 sáp 68 43 chollesterol 68 44 ố ệ Hình 4.5 ố S 8.1 Ố 80 ố ệ 69 84 116 vii Ừ - Ắ 2,6 diclorophenolindophenol 0,01% : A Ax: ỉ ố : : Es: ỉ ố g: gam L: lít : ố M: mol/lít mg: miligam mL: mililit N: V: Xp: ỉ ố viii Ắ Í Ệ Ĩ Ọ 1.1 NGUN TẮC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH quy p ịn t í n 1.1.1 Sự m ự ệ ầ M ễ ệ V ự ệ ự hóa sinh ệ ệ : ự ữ ệ ệ M ỉ ệ ự ệ ệ ự ự ố ữ ệ ự ố phòng thí ầ ự ỗ K ệ ố ố ù ỡ ệ T ệ ẫ ệ N óa ự ố ệ ệ ố ù ệ ù óa ũ P óa ẩ ố ố ự ố ầ ù Hóa ỗ ố ỏ ệ ổ nhãn K ự ẫ ệ é P ệ ự ệ ự K T é ự ẫ ệ ỏ ẫ Nếu vi p ạm n ữn qu địn tr n tuỳ t eo mức độ vi p ạm m sin vi n c n bị ìn t ức kỷ luật t eo mức độ vi p ạm (N ệ – ự ,N ễ (2003)) 1.1.2 Quy tắ kĩ t uật T N ễ o ểm làm thí n m ệ (2003), q : 1.1.2.1 Thí nghiệm với chất độc T ầ ệ ố ỏ % CO ( ũ mg/L amoniac, clor metylic, phenol, acid mL ; ỏ ù ỏ ỏ Uố ; ũ ữ ễ : -N ệ ỉ ằ ệ K - ẩ ũ ẩ ầ ẹ P ũ ự ỏ K ổ ỏ ố -K ỉ ù út h ù ũ ỏ K N ố ầ ỳ ằ -P ; ỏ M ự T ễ b Hoá chất - RN - % % N - HCl 0,1N - NaOH 0,1N ẩ - Ethanol 96% - Isopropanol n àn c L ố 0,1%, thêm vào T L RN ệ ỗ ố ầ L N O ố N ệ % ỗ ố N N %; L RN %; mL ầ ỗ ố L ỗ ố 96% L L N L ệ 7.3.2 p n ứn màu a nu l 7.3.2.1 Phản ứng với anh methylene a uy n tắ T màu xanh b o ất - Acid nucleic 0,1% - CH3COOH 0,1 N % c n àn ố acetic 0,1 N xanh methylen ệ L % ẫ 5-6 % 7.3.2.2 Các phản ứng màu phân biệt ADN ARN ự N  n ứn a ự ệ p nylam n ữ deoxyribose RN vớ uy n tắ 108 ầ Deoxyribose có N mơi ở 595 P N ằ - o ất N RN ệ -T ố N mM natri citrate 15 mM, pH 7) ố L mL n àn Hòa tan mg acid nucleic L ệ ỗ ố L N RN L ố ệ ự ố ệ Q  n ứn ố ố 10 phút vớ t uố t orcinol ầ S HCl RN ẽ ẽ P o ự ARN FeCl3 ất N - RN ẩ - T ố orcinol (0,1 gam FeCl3.H2O thêm 3,5 mL orcinol 6% alcohol) c ố ỗ ố uy n tắ a b ệ L n àn Cho vào ố L ố 15 phút Quan s ự ệ L ầ ỗ ố ố ố L ệ ệ N RN 7.4 Ị N ễ M 7.4.1 ịn l ợn 7.4.1.1 ịnh lượng ADN cách đo độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 260 nm a uy n tắ T ầ ự b óa N ánh sáng vùng ỉ ệ ADN ất 109 - N ẩ µg/mL - N àn c Cho 1mL dun N 260 ẩ Mẫ ẫ N Chú ý: Từ ẫ N N ù pha ADN ầ ẫ N ầ : Ach= ε xl ố ẩ ầ Ta có: Ax= ε ẫ chl : T - Ax: N ầ - Ach: N - Cch: N ẩ - Cx: N ầ 260 nm ẩ 260 nm µ L µ L - n: ệ ố pha loãng Lưu ý: P A có ẫ RN ẫ V ự N 7.4.1.2 ịnh lượng ADN theo phương pháp Dise a uy n tắ N ự K b o ất - N - N ầ - HClO4 0,5 N -T ố c n àn ẩ µ L T 5% diphenylamine â dựn đườn c uẩn ADN P ố 595 nm N µ L S ừ0-5 µ : L N ẩ 110 Ố ệ N N µ N ố ệ tích T 50 100 200 300 400 500 40 80 160 240 320 400 400 360 320 240 160 80 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 L T T µL L HClO4 (mL) ố ệ S ỗ ố T 595 Vẽ ệ ữ L ố ADN - C uẩn bị mẫu T ự ố N N ầ ố ẩ N ẩ 595 nm Từ ADN ẫ 7.4.2 ịn l ợn 7.4.2.1 ịnh lượng ARN cách đo độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 260 nm a uy n tắ ự T b óa N ất - RN - RN c ẩ µ L n àn L RN 260 ẩ Mẫ ẫ Chú ý: Từ RN ẫ xl Ach = ε ố ù RN RN ầ Ta có: Ax = ε ẫ pha ARN ầ ẩ ẫ oãng dung RN ầ : ch : T Ax: RN ầ 260 nm 111 Ach: RN Cch : RN Cx: RN ầ ẩ 260 nm ẩ µ L µ L : ệ ố pha loãng 7.4.2.2 ịnh lượng ARN theo phương pháp Meibaum uy n tắ a K RN ố 67 ự ẽ ỉ ệ RN b Hoá c ất - RN - RN ầ - 2SO4 -T ố c n àn ẩ µg/mL 10% orcinol - â dựn đườn c uẩn ARN P RN µ Ố L S ệ N RN µ RN ố T ệ tích dd H2SO4 10% (mL) ố RN ẩ 50 100 200 300 400 500 40 80 160 240 320 400 400 360 320 240 160 80 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 ệ S L ỗ ố sóng 670 L µL L µ : L T T ừ0–5 Vẽ ệ L ữ ố orcinol ARN - C uẩn bị mẫu T RN ầ Từ RN ự ố RN ố ẩ 67 nm ẩ RN ẫ 112 Ổ Mục đích thí nghiệm - Hiểu k i qu t trao đổi lucid lipid protid - T ực iện c c p ản ứn c ứn sản p ẩm trao đổi lucid lipid, protid 8.1 Ổ O2 H2O ẽ ự ữ : ự ễ ự - - Sự cacbon Sự ự S ự : ầ ẫ ù ẫ ẫ ẫ ẫ 983 8.1.1 ín m y m k í lu a Sự ẩ ễ Sự Tầ Í ự ẩ ố ù ự glucose 1- phosphate Sự Ở ứn m n a la t s n p ẩm uố ùn s p ân uy n tắ T ố ự ệ se ự ằ 2SO4 ằ ẽ 113 b óa ất PO3 5% (acid metaphotphoric) - 5% - % 5% SO4.5H2O bán bão hòa (85%) - Ca(OH)2 - H2SO4 % ệ - =8 ụn ụ -Ố ệ -T -P ễ -N n àn -L ù ố ệ ẫ ố ệ ỗ ố mL HPO3 5% L ệ L ỏ L ệ =8 ố ố ố ố ẫ ệ ệ ỗ ố % L m khí L ố ệ 5% ỗ ố ỗ L 114 ố ố ệ L ệ thí ừ9 – PO3 5% ố L ố ệ 37 o ệ ệ T CuSO4.5H2O 0,5 g Ca(OH)2 S ỗ ệ ố ệ L H2SO4 ố - T ỏ S ố ỗ ố ệ ằ -T ỗ ố ẽ ệ ố ệ 3–5 T ệ ự ầ 8.1.2 l n m n r ợu – í n m m n r ợu r ợu t yl CO2 a ố ệ ứn m n s n p ẩm uố ùn s l n uy n tắ ự ố ự se decacbonyl hóa thành alcoholdehydrogenase óa aldehyt T aceti c ất % - % N O - % -M n àn N ẹ % ỗ ố ệ ỗ ầ ệ – 30 mL dung ệ % L ầ ố ố 37 C Sau – 10 phút khí CO2 ẽ ố ệ ố 115 Hình 8.1 Ống nghiệ - T ín iệm p K ầ ổ ầ ầ t iện k í CO2 ầ ệ u ố ố ệ ầ N O ầ ệ ố ằ ẽ Thí nghiệm p - % K -3 mL, ta ầ ệ N O O2 ẽ t iện rượu et lic R L ỏ ừố ệ ẹ T T iodofooc CHI3 ố ù ệ C2H5OH + I2 + NaOH  CHI3 + NaI + HCOONa + H2O 8.2 Ổ Sự ổ ự ổ ỡ é Sự ỡ ầ é Sự ầ ầ erit T ầ Í  a ín m s t ủy p ân mỡ ằ ự se Sự ẩ ự 983 t ụn m n l pase n tụy uy n tắ N ỡ ệ ẫ Ở se T T ỡ ẽ ẽ ũ ỡ é : 116 óa ất mẫu vật N O - N - M ù L ố T ầ ỡ ỏ – L -3 ù n àn ù ố ỗ –4 ự L ’ – 4’ L 30, 60, 90 phút ẩ N O ỗ L ỗ L ầ ự L 37 0C, qua từ ệ 0, 15, ỗ N ỉ ằ N O ự vào b ỗ N ầ é ỡ se : L N O N ù T L - ù L Không phút 15 phút 30 phút 60 phút 90 phút ố ệ ự N O se N L ù trung hòa 117 8.3 Ổ ố Ở ự ở se ự ố za ẽ ự ự t trypsin, aminopeptidase, cacboxypeptidase ẽ ổ ệ na 983 thành CO2, NH3 H2O T ầ Í ù 8.3.1 ịn l ợn prot n t u óa ằn p ps n a uy n tắ S ằ ầ ằ ằ ệ óa Kjeldahl P ầ ẫ ầ ệ ầ ất - Pepsin 5% - Kjeldahl ụn ụ - T - ố L n àn L S 4 ố T khô 5% K ố ữ L L ầ 37 – 40 C 24 5% S ằ - cho NO3), S ù Kjeldahl 48 ầ ằ ầ Kjeldahl 118 S ầ ẫ ệ ằ Kjeldahl e ín k t qu Protein ti u óa = Protein to n p ần - Protein khơng hịa tan 8.3.2 p ân prot – x địn s p ân uẩn đ foo mon p n p p or ns n a prot t o p p uy n tắ T ệ ầ ầ ổ Sự enzym ệ ự N ữ n ẫ ự ự ự ự 45 enzym enzym enzym ự ẩ cat P S ằ é ằ ố ẩ N ằ ự ẩ ỉ ằ óa K - 2PO4 =9– ố ũ ù 0,1 M OO 5% -T - P ằ ất - - ỗ N O N O ự =9– , ỗ , acid ẩ ự ỡ ằ n p % : N % ỉ N O N 119 ụn ụ -T - Bình nón -P ễ - Pipet ẩ n àn ù ỗ L L làm K OO ễ mL CCl3 ù Từ cho vào ẩ 37 OO S ệ ệ ) ũ ỗ L ỗ ỗ ằ ù 2PO4 N O N L ệ ín k t qu y = (x1 – x2 ).0,28b/a V : - : % - x1: ố LN O N ầ - x2: ố LN O N ầ - ẫ 8: ố - : - : ố LN O ẫ L ệ N COOH ẩ 120 Ệ ỗQ N ễ L (2004) Giáo trình Hoá sinh NX Tầ T P N Matthew C., Ahern K., Van Holde K (1999) Biochemistry vol Benjamin Cummings ISBN 0-8053-3066-6 N ễ L Q ố N TP ễ L T í n iệm n ệ sin Chí Minh (2003) T ực n óa sin ọc (tập 1) NX ọc NX HQG Tp Minh N ễ M N ễ V i o trìn t ực tập sin Mù (2001) T ực n P T T (1997) T ực P T T Tầ T P T Á K P T ệ Vũ N Á T óa sin n o ầ T ọc NXB óa sin Q N ọc NX (2003) Hóa sin N X ọc NX Q TP M T uốc biệt dược v c c sử dụn NXB Y Rodney F Boyer (1993) Modern experimental biochemistry, second edition The Benjamin Publishing Company, Inc T ầ Í (1983) T ực n óa sin ọc NX 121 Ẫ Ú Í Ệ Ó Họ v t n sin vi n: N óm: ớp: : ụ đí y u ầu un STT ín m t n àn n t ợn / i kết c c t í n iệm địn lượn t qu t í r l i c ú: âu ỏ 122 ... HĨA SINH quy p ịn t í n 1.1.1 Sự m ự ệ ầ M ễ ệ V ự ệ ự hóa sinh ệ ệ : ự ữ ệ ệ M ỉ ệ ự ệ ệ ự ự ố ữ ệ ự ố phịng thí ầ ự ỗ K ệ ố ố ù ỡ ệ T ệ ẫ ệ N óa ự ố ệ ệ ố ù ệ ù óa ũ P óa ẩ ố ố ự ố ầ ù Hóa. .. ỉ ẫ ệ + ổ ệ Ấ ệ ố8 0,0000 ố ỉ ẵ ố g ố ệ ệ Z 11 +N ẹ ệ ên hình N ỏ ố + M ố cho hóa ệ ố ố hóa Z ỏ : ẵ ệ T +S ố ố ỏ hóa ệ ố N ữ ệ Chú ý: S ự ố Cal; Print; Unit/Menu N ệ ữE ẫ 1.2.4 ụn ụ t ủy t n... tr c t í n iệm để k ỏi xả n ữn tai nạn đ n tiếc tron qu trìn t ực iện 1.2 CÁCH SỬ D NG D NG C HÓA SINH NG DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM 1.2.1 èn ồn -K ố ệ è è ố ệ -K è ù è ẽ ố ầ è è ỗ ố ) K ỡ T sát ẹ