Khóa luận hóa sinh

Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen gus vào giống đậu tương ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè, những người mà đã luôn quan tâm, ủng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận này, cũng như trong cuộc sống.Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Phương Thuận - chủ nhiệm bộ môn Hóa sinh - trường ĐH Khoa học tự nhiên Hà Nội, đã giúp đỡ hết sức tận tình để tôi hoàn thành khóa luận này.Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối tới TS. Nguyễn Văn Đồng đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ to lớn, những ý kiến đóng góp quý báu, sự hướng dẫn tận tình của Ths. Hà Văn Chiến trong quá trình tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này.Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận.Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐH Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian học tập cũng như khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó.Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2010 Bùi Thúy HiềnBùi Thúy Hiền- i -K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010KÝ HIỆU VIẾT TẮTAS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone)BAP : 6-benzylaminopurinCaMV : Cailiflower Mosaic VirusCar : CarbenicillinDNA : Deoxirionucleic AcidFAO : Food and Agriculture OrganizationGFP : Green Fluorescent ProteinGus : β-1,4-GlucuronidaseHPT : Hygromycin PhosphotransferaseISAAA : International Services for the Acquisition of Agri-BiotechKa : KanamycinLB : Luria Bertani L-Cys : L-CysteinMS : Murashige and Skoog, 1962α-NAA : α-Napthalene acetic acidNPT II : Neomycin Phosphotransferase IIPCR : Polymerase Chain ReactionTi-plasmid : Tumor-Including PlasmidT-DNA : Transfer-DNAUSDA : United States Department of AgricultureVir : virulence Bùi Thúy Hiền- ii -K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010DANH MỤC HÌNH VẼBùi Thúy Hiền- iii -K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010DANH MỤC BẢNGBảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây9Bảng 2. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới trong những năm gần đây .9Bảng 3. Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu Châu Á (nghìn tấn) 10Bảng 4. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam những năm gần đây .10Bảng 5. Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes) .16Bảng 6. Nồng độ và thời gian khử trùng của Ethanol và NaClO 38Bảng 7. Kết quả thí nghiệm thử nồng độ và thời gian khử trùng .38Bảng 8. Kết quả biểu hiện của ĐT26 đối với các chủng vi khuẩn .40Bảng 9. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch 41Bảng 10. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp 43Bảng 11. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp 46Bảng 12. môi trường MS (PH=5,6-5,8) 59Bảng 13. Môi trường LB (PH = 7) .59Bảng 14. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu .60Bùi Thúy Hiền- iv -K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010MỤC LỤCLỜI CẢM ƠN .iKÝ HIỆU VIẾT TẮT .iiDANH MỤC HÌNH VẼ .iiiDANH MỤC BẢNG ivMỤC LỤC .vMỞ ĐẦU .1Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .41.1. Giới thiệu chung về đậu tương 41.1.1. Nguồn gốc 41.1.2. Phân loại .41.1.3. Vai trò của đậu tương .41.1.4. Sinh thái đậu tương 61.1.5.2. Tính chịu hạn .71.1.5.3. Tính chịu đựng và khả năng phục hồi .71.1.5.4. Biến động di truyền về phản ứng với yếu tố bất lợi .81.1.6. Đặc tính sinh học của giống đậu tương ĐT26 .81.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam 91.2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới 91.2.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam .101.3. Vi khuẩn A.tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật .111.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens 111.3.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid .121.3.3. Cấu trúc và chức năng của T-ADN 131.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens 131.3.5. Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid 141.3.6. Các gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc 15Bùi Thúy Hiền- v -K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/20101.3.7. Hệ thống vector pCAMBIA .171.3.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens 191.4. Cây trồng biến đổi gen và cây đậu tương biến đổi gen 211.4.1. Cây trồng biến đổi gen trên thế giới và việt nam .211.4.2. Cây đậu tương biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam .22Chương II - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .242.1. Vật liệu nghiên cứu .242.1.1. Các thiết bị thí nghiệm 242.1.2. Hóa chất và môi trường 242.1.3. Vi khuẩn .242.1.4. Đối tượng nghiên cứu 242.2. Phương pháp nghiên cứu .242.2.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng .24♦♦ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu .242.2.2. Chuyển gen gus vào đậu tương 25♦♦ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26 25♦♦ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26 .27♦♦ Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen gus vào ĐT26 29♦♦ Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26 30♦♦ Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen .32♦♦ Thí nghiệm 7: Phân tích cây chuyển gen T0 .332.3. Các chỉ tiêu đánh giá 35Chương III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 373.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng .37Bùi Thúy Hiền- vi -K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu 373.2. Chuyển gen gus vào đậu tương 393.2.1. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26 .393.2.2. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quangdung của dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26 413.2.3. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu suất chuyển gen gus vào ĐT26. 433.2.4. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26 .453.2.5. Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen 483.2.6. Thí nghiệm 7: Tách ADN và phân tích cây chuyển gen .51Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54TÀI LIỆU THAM KHẢO 55PHỤ LỤC 591. Môi trường MS (PH=5,6-5,8) 592. Môi trường LB (PH = 7) 593. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu .60Bùi Thúy Hiền- vii -K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010MỞ ĐẦUĐậu tương (Glycine max(L.) Merr) hay còn gọi là đậu nành, là cây công nghiệp ngắn ngày có hiệu quả kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao. Khó có thể tìm thấy cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu tương. Là thức ăn có giá trị dinh dưỡng cao, rất giàu protein thực vật, chứa nhiều loại vitamin và chứa một lượng lớn axit béo chưa bão hòa rất tốt cho sức khỏe. Trong công nghiệp, đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng,…nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu. Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật. Trong nông nghiệp, đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, phân bón. Ngoài ra, đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt, 1ha trồng đậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60kg N [10]. Tuy nhiên, với tình hình khí hậu trên trái đất đang biến đổi không ngừng, nhiệt độ trái đất càng ngày càng tăng cao, từ đó dẫn đến các thiên tai (lũ lụt, hạn hán, bệnh dịch,…) gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng, phát triển của các loại cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng. Vì thế để tăng năng suất và chất lượng thì ngoài việc thực hiện chăm sóc, gieo trồng tốt còn phải tập trung nghiên cứu nhằm cải thiện các loại giống để chúng có thể cho năng suất cao, chống chịu được các điều kiện ngoại cảnh bất lợi tốt nhờ những ứng dụng to lớn của công nghệ sinh học hiện đại.Trong hơn một thập niên vừa qua, công nghệ sinh học nói chung và cây trồng biến đổi gen nói riêng đã có những bước phát triển vượt bậc. Từ khoảng 1 triệu ha đầu tiên năm 1996 trồng tại Châu Mỹ, đến tháng 12 năm 2009, toàn thế giới đã có 134 triệu ha cây trồng biến đổi gen [20], tăng 80 lần so với năm 1996 và tăng 9 triệu ha so với năm 2008 (125 triệu ha). Trong đó đậu tương biến đổi gen là loại cây biến đổi gen nổi bật nhất, có tới 69,7 triệu ha chiếm 52% trong tổng diện tích cây biến đổi gen toàn thế giới và chiếm tới 75% trong tổng diện tích 90 triệu ha trồng đậu tương trên thế giới [14]. Các đánh giá mới nhất về tác động của cây chuyển gen cho thấy trong khoảng thời gian từ năm 1996 đến năm 2008, lợi ích kinh tế trị giá 51,9 tỷ USD mà cây biến đổi gen mang lại được tạo ra từ 2 nguồn: thứ nhất là giảm chi phí sản xuất (50%) và tăng năng suất thu hoạch bền vững (50%). Số sản lượng tăng thêm này nếu không sử Bùi Thúy Hiền- 1 -K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010dụng các giống cây chuyển gen thì sẽ cần thêm 62,6 triệu ha để tạo ra chúng. Vì thế công nghệ sinh học giúp tiết kiệm diện tích trồng trọt, giảm được lượng thuốc trừ sâu ở mức 365 triệu kg, ứng với 8,4% tổng lượng thuốc trừ sâu sửu dụng trong nông nghiệp. Chỉ tính riêng trong năm 2008, lượng khí CO2 được cây biến đổi gen hấp thụ là 14,4 tỷ kg, tương đương với lượng khí thải mà 7 triệu chiếc oto thải ra.Nước ta là một nước nông nghiệp với đặc điểm nổi bật là mật độ dân số cao vào loại nhất thế giới, bình quân đất nông nghiệp trên đầu người chỉ đạt khoảng 765m2/người. Diện tích đang ngày càng thu nhỏ lại, nhường chỗ cho thành thị, đường giao thông, khu dịch vụ và phát triển công nghiệp. Ước tính hàng năm chúng ta mất 50000-70000 ha đất canh tác. Trong khi đó biến đổi khí hậu toàn cầu, kéo theo sự xâm mặn nghiêm trọng, mưa gió bất thường gây ra hạn hán, lũ lụt, dịch bệnh đang đe dọa an ninh lương thực của đất nước. Liên hợp quốc đã xếp Việt Nam vào một trong 8 nước có nguy cơ về an ninh lương thực ở Châu Á. Đặc biệt, trong điều kiện mất đất canh tác, với mức tăng dân số như hiện nay, ngành nông nghiệp phải cung cấp thêm cho đất nước ít nhất 1 triệu tấn lương thực hàng năm. Đậu tương là loại cây trồng được quan tâm và chú trọng nhất hiện nay, theo thống kê đến tháng 03/2010 diện tích trồng đậu tương của nước ta ở thời điểm này là 123,9 nghìn ha [12], sản lượng bình quân là 20 tạ/ha [11]. Tuy vậy nhưng hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu một số lượng lớn đậu tương 2300 nghìn tấn (2009) [11], đứng thứ hai trên toàn Châu Á sau Indonesia. Bên cạnh đó, cây trồng biến đổi gen nói chung và đậu tương biến đổi gen nói riêng đã được chính phủ Việt Nam cho phép trồng rộng rãi bắt đầu từ năm 2011.Xuất phát từ thực tế đó trong thời gian thực tập tốt nghiệp, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen gus vào giống đậu tương ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”. ♦ Mục đích và yêu cầu của đề tài:- Mục đích: Xây dựng quy trình công nghệ chuyển gen gus có hiệu quả nhất để từ đó áp dụng chuyển các gen khác như gen kháng hạn, gen kháng sâu bệnh, gen kháng thuốc diệt cỏ,…nhằm cải tạo giống đậu tương của Việt Nam.- Yêu cầu: Trong khuôn khổ một bản đồ án tốt nghiệp, chúng tôi tập trung nghiên cứu cụ thể các nội dung sau: * Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng ban đầuBùi Thúy Hiền- 2 -K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010 * Nghiên cứu quy trình biến nạp hiệu quả nhất, trong đó có:• Xác định chủng vi khuẩn có khả năng chuyển gen hiệu quả nhất.• Xác định mật độ quang (OD) của dung dịch khuẩn thích hợp nhất• Xác định thời gian biến nạp thích hợp nhất• Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm đến hiệu quả biến nạp.• Xây dựng quy trình tái sinh cây đậu tương chuyển gen• Phân tích cây chuyển gen T0Bùi Thúy Hiền- 3 -K51A Sinh học [...]... ruộng thay thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong thân chiếm 0,05% trong lá chiếm 0,19% [2]. Bùi Thúy Hiền - 5 - K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010 Bùi Thúy Hiền - 36 - K51A Sinh học Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi đã nhân Tổng số chồi ban đầu Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây9 Bảng 2.... nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen 48 3.2.6. Thí nghiệm 7: Tách ADN và phân tích cây chuyển gen 51 Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 59 1. Môi trường MS (PH=5,6-5,8) 59 2. Môi trường LB (PH = 7) 59 3. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu 60 Bùi Thúy Hiền - vii - K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010 số đồng hóa cao, mùi vì thơm như axit linoleic... p1303, p1304, p1305.1, p1305.2,… Hình 3. Vector pCAMBIA1301 Trong khóa luận này chúng tơi sử dụng vector pCAMBIA1301 (hình 3), gen chọn lọc thực vật là hptII (gen kháng hygromycin B), gen chọn lọc vi khuẩn là gen kháng kanamycin(r), gen chỉ thị là gen gusA và gen này được chia thành 2 exon là Bùi Thúy Hiền - 18 - K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010 Hình 4. Quy trình thí nghiệm xác... Hiền - 19 - K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010 nên chọn giống có thời gian ra hoa dài và có khả năng phục hồi tốt sau khi bị hạn hoặc bị lạnh [2]. 1.1.5.4. Biến động di truyền về phản ứng với yếu tố bất lợi Ở đậu tương có những biến động di truyền cho nhiều đặc tính khác nhau, chẳng hạn như độ sâu và mật độ rễ, tập tính sinh trưởng hữu hạn và vô hạn, thời gian sinh trưởng, độ nhạy... lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26 30 ♦♦ Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen 32 ♦♦ Thí nghiệm 7: Phân tích cây chuyển gen T0 33 2.3. Các chỉ tiêu đánh giá 35 Chương III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng 37 Bùi Thúy Hiền - vi - K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010 3.2.3. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian... kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong Ti-plasmid, vị trí của T-ADN được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left Border). Ngồi T-ADN, trên Ti-plasmid cịn có các vùng ADN mã hóa cho việc tái sinh plasmid, cho khả năng lấy nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine. Ở Ti-plasmid dạng nopalin,... kích thích sản sinh ra các đoạn T-ADN, bao bọc che chở các đoạn ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn. 1.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn như: AS, hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng của các hợp chất này, Bùi Thúy Hiền - 13 - K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp.. .Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010 nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kanamycin và có hoạt tính gusA, hoặc kháng Ka và chống chịu glyphosate. Có thể biến nạp gen hiệu quả vào protoplast đậu tương bằng các phương thức thông dụng nhưng rất khó tái sinh được cây. Để biến nạp gen vào các giống đậu tương khác nhau người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản- phương thức tái sinh cây... bảng 8 và hình 9 cho thấy: Biểu hiện của ĐT26 sau khi cho lây nhiễm lần lượt với 2 chủng vi khuẩn A.tumefaciens là AGL1 và Bùi Thúy Hiền - 39 - K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010 Với những đặc tính này, ĐT26 rất phù hợp với điều kiện sinh thái của Việt Nam, nên chúng tôi đã chọn ĐT26 làm đối tượng để chuyển gen. 1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam 1.2.1. Tình... truyền. Kết quả thành công đầu tiên ở đậu tương là thu được cây chuyển gen nhờ Agrobacterium. Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking chọn lọc cho tính mẫm cảm với Agrobacterium. Các mẫu lá mầm được xâm Bùi Thúy Hiền - 22 - K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010 - Tiếp tục rửa tủa bằng ethanol 100% lạnh (làm tương tự như bước trên). - Làm khơ tủa bằng hút . gian tôi làm khóa luận này, cũng như trong cuộc sống.Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Phương Thuận - chủ nhiệm bộ môn Hóa sinh - trường. nạp.• Xây dựng quy trình tái sinh cây đậu tương chuyển gen• Phân tích cây chuyển gen T0Bùi Thúy Hiền- 3 -K51A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp