Đậu tương là một loại cây trồng lâu đời, loại cây đem lại lợi ích kinh tế to lớn trên thế giới. Hạt đậu tương có chứa tỷ lệ amino acid không thay thế nhiều hơn ở cả thịt, do vậy đậu tương là một trong những loại cây trồng lương thực quan trọng nhất trên thế giới hiện nay.
Đậu tương được biến đổi gen để mang các tính trạng như khả năng chống chịu thuốc diệt cỏ và có hàm lượng oleic acid cao. Những cố gắng đầu tiên ở cây đậu tương biến nạp gen tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyên phù phát sinh phôi. Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc này vẫn còn chậm và việc thu hồi các cây chuyển gen vẫn đang còn gặp nhiều khó khăn. Công nghệ chuyển gen ở đậu tương đã có triển vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hóa của kỹ thuật bắn gen. Thực tế cây đậu tương đã được sử dụng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều loài cây trồng khó áp dụng công nghệ di truyền. Kết quả thành công đầu tiên ở đậu tương là thu được cây chuyển gen nhờ Agrobacterium. Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống
nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kanamycin và có hoạt tính gusA, hoặc kháng Ka và chống chịu glyphosate. Có thể biến nạp gen hiệu quả vào protoplast đậu tương bằng các phương thức thông dụng nhưng rất khó tái sinh được cây. Để biến nạp gen vào các giống đậu tương khác nhau người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản- phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng của cụm chồi từ vùng chung quanh mô phân sinh của trụ phôi) với sự tăng gia tốc của vi đạn có phóng điện để phân phối ADN ngoại lai. Hàng trăm cây đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho nhiều genotype khác nhau. Nói chung các dòng đậu tương chuyển gen có nhiều bản sao của gen biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50, nhưng thường thay đổi từ 2-10). Phân tích Southern blot ở thế hệ sau của các bản sao gen thực vật cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời, như thể mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên.
- Thế giới: Lần đầu tiên diện tích trồng đậu tương biến đổi gen chiếm tới trên 75% trong tổng diện tích 90 triệu ha trồng đậu tương trên toàn thế giới [13]. Tính trạng kháng thuốc diệt cỏ cũng là tính trạng phổ biến nhất ở đậu tương, chiếm tới 62%. Cây biến đổi gen đa tính trạng cũng ngày càng được áp dụng rộng rãi, chiếm 21% tổng diện tích trồng cây biển đổi gen toàn thế giới, được trồng ở 11 nước, trong đó có 8 nước đang phát triển [20].
- Việt Nam: Cho tới nay, đã có một số các thử nghiệm để tối ưu hóa quá trình chuyển gen cũng như tái sinh sau chuyển gen của đậu tương như: nghiên cứu của Tran Thi Cuc Hoa et al. sử dụng giống đậu PC 19 là giống được trồng phổ biến ở Việt Nam làm đích chuyển gen. Việc biến nạp vào nốt lá mầm thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens mang vector nhị hợp pZY 102/pTF 102 mang gen bar, gen gusA và gen kháng glufosinat, thu được tần số chuyển gen ở thế hệ T0 là 1-3% [35]. Một nghiên chuyển gen vào đậy tương khác của Trần Thị Cúc Hòa với đích chuyển gen là nốt là mầm các giống đậu tương MTĐ 176, KL 202, Maverick, Williams 82 thông qua A.tumefaciens thu được hiệu suất chuyển gen là 1-5% [6], trong đó MTĐ 176 và KL202 là 2 giống đậu tương Việt Nam. Hy vọng rằng, trong tương lai nước ta có thể nâng cao diện tích trồng cây đậu tương biến đổi gen giúp tăng năng suất, tiết kiệm nước, đất, thuốc trừ sâu,…và có khả năng chống chịu điều kiện bất lợi
Chương II - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Các thiết bị thí nghiệm
Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm này là : Tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ lạnh, tủ ổn nhiệt, cân điện tử, máy khử trùng, bộ pipette, bình nuôi cấy, đĩa Petri, que cấy khuẩn hoặc que chang, dao và panh, đèn cồn.
2.1.2. Hóa chất và môi trường
Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm này là: Ethanol, NaClO, Ka, Hygromycin, AS, 2,4-D, BAP, IAA, Agar.
Các môi trường được sử dụng trong thí nghiệm là: LB, MS, C1, C2, C3, C4, C5, C6 (xem thành phần các loại môi trường ở phần phụ lục).
2.1.3. Vi khuẩn
Chủng vi khuẩn được sử dụng là: A.tumefaciens AGL1 và GV3101. Cả hai chủng đều mang vector pCAMBIA 1301 có gen gus làm chỉ thi sàng lọc, gen kháng kanamycin làm chỉ thị chọn lọc vi khuẩn, gen kháng hygromycin làm chỉ thị chọn lọc thực vật.
Hai chủng có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật, viện Di truyền nông nghiệp.
2.1.4. Đối tượng nghiên cứu
Thí nghiệm sử dụng dòng đậu tương ĐT26 có nguồn gốc từ Viện Di truyền Nông nghiệp.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng
♦♦ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu.
- Nguyên tắc: Sử dụng các dung dịch khử trùng có khả năng xâm nhập và len lỏi vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt hạt đậu để có thể khử sạch hạt khỏi nấm và vi
khuẩn (bởi vì hạt đậu tương được thu hoạch từ đồng ruộng nên chứa nhiều các loại vi khuẩn và nấm).
- Chỉ tiêu đánh giá: mẫu có tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, sinh trưởng và phát triển bình thường.
- Hóa chất: Ethanol, NaClO, nước cất vô trùng.
- Tiến hành: khử trùng hạt được tiến hành trong tủ cấy vô trùng và theo quy trình khử trùng hạt được cải tiến từ quy trình của Xue R.G. et al. (2006)[31].
* Ngâm hạt với nước cất vô trùng trong 30 phút (hạt được bỏ trong bình tam giác 250ml với số lượng 20-25 hạt).
* Lắc hạt với ethanol 70% trong 3 phút. * Rửa hạt bằng nước cất vô trùng 1 lần.
* Lắc hạt với NaClO với các nồng độ 10%; 12,5%; 15%; 20% trong thời gian 5; 10; 13,5 phút.
* Rửa hạt bằng nước cất vô trùng 5-6 lần (rửa đến khi hết bọt). * Dùng dao và panh tách bỏ lớp vỏ ngoài của hạt.
* Cấy hạt vào môi trường nảy mầm MS, cho hạt nảy mầm trong 2-3 ngày. - Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6- 10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26.
2.2.2. Chuyển gen gus vào đậu tương
Trong các thử nghiệm chuyển gus vào đậu tương ở khóa luận này, chúng tôi chọn vị trí làm đích chuyển gen trên hạt đậu tương là nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt dựa vào nghiên cứu của Xue R.G. et al.[31], Tran Thi Cuc Hoa et al. [35]. X- gluc được sử dụng để nhuộm gus, được chuẩn bị theo quy trình của Olhoft et al. [30].
♦♦ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26
- Nguyên tắc: vi khuẩn A.tumefaciens có khả năng tiếp cận với genome thực vật và có thể chuyển đoạn ADN ngoại lai vào trong genome thực vật. Tuy nhiên, mỗi chủng có cách tiếp cận bằng các cách khác nhau và vào các vị trí khác nhau trên cơ thể thực vật.
- Chỉ tiêu đánh giá: Xác định chủng vi khuẩn mang gen gus mà có thể chuyển gen gus sang hạt đậu đang nảy mầm thành công với tỷ lệ sống của hạt cao
- Vật liệu: Hạt đậu tương 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1, GV3101 chứa vector pCAMBIA1301, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C1 và C2, X-gluc.
- Tiến hành:
* Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen
Chủng A.tumefaciens AGL1 và GV3101được cấy trên đĩa thạch LB có chứa Ka, nuôi trong tủ 280C qua đêm. Sau đó đem bảo quản trong tủ 40C (sử dụng 2- 3 tháng kể từ ngày nuôi).
Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 và GV3101 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,6-1 thì được sử dụng cho biến nạp.
* Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen
Hạt đậu 2-3 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1.
• Tiến hành chuyển gen (được tóm tắt như hình 4):
Cho nốt lá mầm cùng với 1 lá mầm của hạt đã cắt ở trên tiếp xúc trực tiếp với dịch khuẩn AGL1 và GV3101 trong 60 phút.
Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 và đồng nuôi cấy trên môi trường C2. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h.
Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu.
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6- 10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26.
Hình 4. Quy trình thí nghiệm xác định chủng khuẩn thích hợp với giống đậu tương ĐT26
♦♦ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26.
- Nguyên tắc: Mật độ vi khuẩn ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm của
A.tumefaciens. Nếu trong dịch khuẩn mà mật độ vi khuẩn quá nhiều sẽ làm cho hiệu quả biến nạp vào mẫu thấp và gây chết mẫu. Còn nếu mật độ vi khuẩn ít thì hiệu quả biến nạp thấp.
- Chỉ tiêu đánh giá: Mẫu sống và phát triển bình thường có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường) , hiệu quả biến nạp cao.
- Vật liệu: : hạt đậu tương đã nảy mầm 1 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1 chứa vector pCAMBIA1301, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C1 và C2.
- Tiến hành:
Nuôi phục hồi A.tumefaciens AA43 từ đĩa thạch rên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD lần lượt là 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 thì được sử dụng cho biến nạp.
* Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen
Hạt đậu 1 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1.
• Tiến hành chuyển gen theo quy trình được tóm tắt như hình 5:
Ngâm nửa hạt một ngày tuổi có chứa nốt lá mầm vào dịch khuẩn A.tumefaciens có OD lần lượt là 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4.
Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 (có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C2 trong 5 ngày.
Hình 5. Quy trình thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) lên biểu hiện gus của giống đậu tương ĐT26
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h.
Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu.
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26
♦♦ Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen gus vào ĐT26.
- Nguyên tắc: Sử dụng chủng A.tumefaciens chủng AGL1, là loại vi khuẩn có khả năng xâm nhiễm và chuyển gen cho tế bào vật chủ. Dựa vào các gen chỉ thị để nhận biết sự thành công của việc chuyển gen.
- Chỉ tiêu đánh giá: mẫu sống và phát triển bình thường, có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường).
- Vật liệu: hạt đậu tương đã nảy mầm 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1 chứa vector có chứa gen gus, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C1 và C2.
- Tiến hành:
* Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen
Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,8 thì được sử dụng cho biến nạp.
* Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen
Hạt đậu 1 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1 (có bổ xung AS).
• Tiến hành chuyển gen (được tóm tắt như hình 6):
Ngâm lá mầm có chứa nốt lá mầm vào dịch khuẩn AGL1 đã được chuẩn bị ở trên với các khoảng thời gian 30, 45, 60 và 90 phút.
Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 (có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C2 trong 5 ngày.
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h.
Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu.
Hình 6. Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến biểu hiện gus trên giống đậu tương ĐT26
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26
♦♦ Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26.
- Nguyên tắc: Sử dụng A.tumefaciens AGL1 mang vector pCAMBIA1301 để chuyển gen vào đậu tương, nốt lá mầm của hạt đậu tương bị làm tổn thương bằng kim và vi khuẩn sẽ xâm nhập dễ dàng hơn ở vị trí bị tổn thương do tại đó thực vật tiết ra các chất có bản chất phenolic (AS, Hydroxyl acetosyringon) là hợp chất có tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập , lại có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genom thực vật.
- Chỉ tiêu đánh giá: mẫu sống và phát triển bình thường, có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường).
- Vật liệu: hạt đậu tương đã nảy mầm 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1, môi trường LB, AS, Ka, môi
- Tiến hành:
● Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen
Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,8 thì được sử dụng cho biến nạp.
● Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen
Chia đôi số lượng hạt 2-3 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1. Một nửa, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, phần rễ của hạt, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1(có bổ xung AS). Một nửa, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau đó, sử dụng kim đâm vào vị trí nốt lá mầm của hạt (mỗi hạt đâm khoảng 6-10 lần với độ sâu 0,2-0,5mm). Sau khi