Trong các thử nghiệm chuyển gus vào đậu tương ở khóa luận này, chúng tôi chọn vị trí làm đích chuyển gen trên hạt đậu tương là nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt dựa vào nghiên cứu của Xue R.G. et al.[31], Tran Thi Cuc Hoa et al. [35]. X- gluc được sử dụng để nhuộm gus, được chuẩn bị theo quy trình của Olhoft et al. [30].
♦♦ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26
- Nguyên tắc: vi khuẩn A.tumefaciens có khả năng tiếp cận với genome thực vật và có thể chuyển đoạn ADN ngoại lai vào trong genome thực vật. Tuy nhiên, mỗi chủng có cách tiếp cận bằng các cách khác nhau và vào các vị trí khác nhau trên cơ thể thực vật.
- Chỉ tiêu đánh giá: Xác định chủng vi khuẩn mang gen gus mà có thể chuyển gen gus sang hạt đậu đang nảy mầm thành công với tỷ lệ sống của hạt cao
- Vật liệu: Hạt đậu tương 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1, GV3101 chứa vector pCAMBIA1301, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C1 và C2, X-gluc.
- Tiến hành:
* Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen
Chủng A.tumefaciens AGL1 và GV3101được cấy trên đĩa thạch LB có chứa Ka, nuôi trong tủ 280C qua đêm. Sau đó đem bảo quản trong tủ 40C (sử dụng 2- 3 tháng kể từ ngày nuôi).
Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 và GV3101 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,6-1 thì được sử dụng cho biến nạp.
* Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen
Hạt đậu 2-3 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1.
• Tiến hành chuyển gen (được tóm tắt như hình 4):
Cho nốt lá mầm cùng với 1 lá mầm của hạt đã cắt ở trên tiếp xúc trực tiếp với dịch khuẩn AGL1 và GV3101 trong 60 phút.
Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 và đồng nuôi cấy trên môi trường C2. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h.
Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu.
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6- 10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26.
Hình 4. Quy trình thí nghiệm xác định chủng khuẩn thích hợp với giống đậu tương ĐT26
♦♦ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26.
- Nguyên tắc: Mật độ vi khuẩn ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm của
A.tumefaciens. Nếu trong dịch khuẩn mà mật độ vi khuẩn quá nhiều sẽ làm cho hiệu quả biến nạp vào mẫu thấp và gây chết mẫu. Còn nếu mật độ vi khuẩn ít thì hiệu quả biến nạp thấp.
- Chỉ tiêu đánh giá: Mẫu sống và phát triển bình thường có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường) , hiệu quả biến nạp cao.
- Vật liệu: : hạt đậu tương đã nảy mầm 1 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1 chứa vector pCAMBIA1301, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C1 và C2.
- Tiến hành:
Nuôi phục hồi A.tumefaciens AA43 từ đĩa thạch rên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD lần lượt là 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 thì được sử dụng cho biến nạp.
* Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen
Hạt đậu 1 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1.
• Tiến hành chuyển gen theo quy trình được tóm tắt như hình 5:
Ngâm nửa hạt một ngày tuổi có chứa nốt lá mầm vào dịch khuẩn A.tumefaciens có OD lần lượt là 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4.
Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 (có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C2 trong 5 ngày.
Hình 5. Quy trình thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) lên biểu hiện gus của giống đậu tương ĐT26
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h.
Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu.
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26
♦♦ Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen gus vào ĐT26.
- Nguyên tắc: Sử dụng chủng A.tumefaciens chủng AGL1, là loại vi khuẩn có khả năng xâm nhiễm và chuyển gen cho tế bào vật chủ. Dựa vào các gen chỉ thị để nhận biết sự thành công của việc chuyển gen.
- Chỉ tiêu đánh giá: mẫu sống và phát triển bình thường, có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường).
- Vật liệu: hạt đậu tương đã nảy mầm 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1 chứa vector có chứa gen gus, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C1 và C2.
- Tiến hành:
* Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen
Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,8 thì được sử dụng cho biến nạp.
* Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen
Hạt đậu 1 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1 (có bổ xung AS).
• Tiến hành chuyển gen (được tóm tắt như hình 6):
Ngâm lá mầm có chứa nốt lá mầm vào dịch khuẩn AGL1 đã được chuẩn bị ở trên với các khoảng thời gian 30, 45, 60 và 90 phút.
Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 (có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C2 trong 5 ngày.
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h.
Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu.
Hình 6. Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến biểu hiện gus trên giống đậu tương ĐT26
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26
♦♦ Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26.
- Nguyên tắc: Sử dụng A.tumefaciens AGL1 mang vector pCAMBIA1301 để chuyển gen vào đậu tương, nốt lá mầm của hạt đậu tương bị làm tổn thương bằng kim và vi khuẩn sẽ xâm nhập dễ dàng hơn ở vị trí bị tổn thương do tại đó thực vật tiết ra các chất có bản chất phenolic (AS, Hydroxyl acetosyringon) là hợp chất có tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập , lại có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genom thực vật.
- Chỉ tiêu đánh giá: mẫu sống và phát triển bình thường, có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường).
- Vật liệu: hạt đậu tương đã nảy mầm 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1, môi trường LB, AS, Ka, môi
- Tiến hành:
● Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen
Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,8 thì được sử dụng cho biến nạp.
● Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen
Chia đôi số lượng hạt 2-3 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1. Một nửa, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, phần rễ của hạt, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1(có bổ xung AS). Một nửa, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau đó, sử dụng kim đâm vào vị trí nốt lá mầm của hạt (mỗi hạt đâm khoảng 6-10 lần với độ sâu 0,2-0,5mm). Sau khi làm tổn thương nốt lá mầm thì ngâm vào dung dịch C1 (có bổ xung AS).
● Tiến hành chuyển gen (tóm tắt ở hình 7):
Hình 7. Quy trình thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến biểu hiện gus.
Ngâm lá mầm có chứa nốt lá mầm đã chuẩn bị ở trên (cả nốt lá mầm nguyên và bị tổn thương) vào dịch khuẩn AGL1 đã được chuẩn bị ở trên với thời gian là 60 phút.
Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 (có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C2 trong 5 ngày.
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h.
Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26
♦♦ Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen
- Nguyên tắc: Sau các thí nghiệm từ 1 đến 5, chúng tôi đã thử nghiệm với các yếu tố có ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen cũng như ảnh hưởng đến việc tái sinh cây chuyển gen như xác định thời gian thích hợp khi khử trùng mẫu hạt bằng dung dịch khử trùng, xác định chủng A.tumefaciens thích hợp với giống đậu tương ĐT26, xác định mật độ vi khuẩn thích hợp, xác định thời gian lây nhiễm thích hợp cũng như so sánh hiệu quả biến nạp giữa việc làm tổn thương và không làm tổn thương vị trí nốt lá mầm trên hạt. Từ đó, xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen.
- Chỉ tiêu đánh giá: Mẫu sau khi chuyển gen có khả năng tái sinh cao tức là tỷ lệ % mẫu sống cao, tỷ lệ % mẫu chết và nhiễm thấp.
- Vật liệu: bao gồm toàn bộ các vật liệu đã sử dụng ở thí nghiệm từ 1-5. - Tiến hành (quy trình được tóm tắt như hình 8):
• Khử trùng hạt đậu tương ĐT26 theo quy trình như thí nghiệm 1 với Ethanol 75% trong 3 phút và NaClO 15% trong 13,5 phút. Tách vỏ và cho hạt nảy mầm trong MS 2-3 ngày.
• Sau 2-3 ngày nảy mầm, dùng dao tách bỏ 1 lá mầm của hạt, chỉ giữ lại 1 lá mầm có cùng với nốt lá mầm. Sau đó dùng kim đâm vào vị trí nốt lá mầm của hạt (mỗi hạt đâm khoảng 6-10 lần với độ sâu 0,2-0,5mm), ngâm vào trong dung dịch C1 trong 30 phút. Sau đó, tiến hành lây nhiễm mẫu và vi khuẩn AGL1 bằng cách ngâm mẫu trong dịch khuẩn AGL1 có OD = 0,8 trong 60 phút. Và đồng nuôi cấy trong C2 trong 5 ngày.
• Sau đồng nuôi cấy, chuyển mẫu sang môi trường C3 có chứa kháng sinh để loại bỏ vi khuẩn cũng như để chọn lọc thực vật trong 8 ngày ở 260C với chu kì 18/6h sáng tối.
• Sau 8 ngày, sử dụng dao cắt bỏ lá mầm, chỉ giữ lại phần nốt lá mầm và tiếp tục chuyển mẫu sang môi trường C4 trong 21 ngày để nhân chồi.
• Sau 21 ngày thì chuyển mẫu sang môi trường C5 để kéo dài chồi đến khi chồi dài 3-5cm thì chuyển tiếp sang môi trường C6.
• Ở C6, đợi khi nào mẫu ra rễ thì chuyển cây ra đất.
Hình 8. Quy trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT26 ♦♦ Thí nghiệm 7: Phân tích cây chuyển gen T0
► Thí nghiệm 7.1: Tách chiết ADN từ lá cây đậu tương chuyển gen T0
Lá non của cây đậu tương ĐT26 đã được tái sinh thành công và cây đối chứng được thu bằng giấy bạc và làm lạnh nhanh bằng nito lỏng, và được lưu giữ ở -800C cho đến khi cần phân tích.
* Hóa chất
Đệm chiết: CTAB (2% w/V), Tris-HCL 100mM (pH=8.0), NaCl (1,4mM), EDTA 20mM, β-mercaptoethanol (1%).
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1), Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), Isopropanol, Ethanol 75% và 100%, TE (10mM Tris-HCl pH 8,0; 1mM EDTA pH 8,0).
Đá khô, Nito lỏng, 10mg/ml RNase.
* Dụng cụ thiết bị: Chày và cối sứ, máy li tâm, eppendoft, bộ pipiet.
* Quy trình tách thực hiện theo quy trình tách ADN cải tiến từ quy trình của Doyle et al. (1987)[16].
- Lấy 1g mẫu lá được nghiền nhỏ bằng cối chày sứ trong nito lỏng, chuyển vào ống Eppendoft 2ml.
- Bổ xung 1,5ml dung dịch đêm CTAB , ủ mẫu ở 650C trong 60 phút.
- Thu lấy 800µl dịch nổi phía trên cho vào ống eppendoft mới. Thêm 800µl phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) lạnh, lắc đều và ly tâm 12000v/p, 10 phút.
- Thu lấy 800 µl dịch nổi chuyển sang ống eppendoft mới và thêm 800µl chloroform:isoamylalcohol (24:1), lắc đều ở nhiệt độ phòng rồi đem ly tâm 12000 v/p, 10 phút.
- Thu lấy 800µl dịch nổi chuyển sang ống eppendoft mới và thêm 800µl đệm kết tủa CTAB, trộn đều cho đến khi thấy một màng ADN màu trắng đục nổi lên. Ly tâm 12000 v/p, 10 phút. Loại bỏ phần dịch nổi, thu cặn.
- Hòa tan tủa bằng 1ml NaCl 1M, ly tâm 12000v/p, 10 phút. Thu dịch nổi. - Thu lấy 800µl dịch nổi chuyển sang ống eppendoft mới, thêm vào dung dịch 5µl RNase 10mg/ml để phân hủy ARN và thêm vào 800µl isopropanol lạnh, lắc đều để tủa ADN. Ly tâm 12000 v/p, 15 phút và thu cặn.
- Tiếp tục rửa tủa bằng ethanol 100% lạnh (làm tương tự như bước trên).
- Làm khô tủa bằng hút chân không. Sau đó, hòa tan tủa trong đêm TE và lưu giữ ở -200C.
- Chạy điện di trên 0,8% agarose gel để kiểm tra độ tinh sạch của ADN.
► Thí nghiệm 7.2: Phân tích cây chuyển gen
* Lá của cây chuyển gen và lá của cây không chuyển gen (mẫu đối chứng),
đem khử trùng bằng ethnol 70% và NaClO 15%, rửa với nước cất khử trùng 4-5 lần. Sau đó, đem cấy mẫu trong MS có bổ sung hygromycin 50mg/l trong 5-7 ngày. Sau đó quan sát và phân biệt mẫu kháng hay không kháng hygromycin theo màu sắc (Wang & Waterhouse, 1997).
* PCR mẫu ADN đã tách từ lá của cây chuyển gen ở thí nghiệm 7.1 bằng mồi
gus hoặc hgro.