Bài Giảng KST: Đại Cương Vi Nấm

Tóm tắt các kỹ thuật ứng dụng trong thử hoạt tính kháng nấm Vi nấm học... Hình thể• Nấm sợi: nấm mốc filamentous fungi/mould  Sợi nấm hyphae hệ sợi mycelium  Sinh sản bằng bào tử BT vô

Vi nấm

Bộ môn Vi sinh - Ký sinh Môn học: Ký sinh trùng

5. Trình bày lợi ích và tác hại của vi nấm

6. Tóm tắt các kỹ thuật áp dụng trong phát hiện, định danh vi nấm

7. Tóm tắt các kỹ thuật ứng dụng trong thử hoạt tính kháng nấm

Vi nấm học

Khoảng 300 loài gây bệnh cho người

Hơn ¾ vi nấm gây bệnh gây nhiễm chủ yếu ở da và mô dưới da

VỊ TRÍ CỦA VI NẤM / HT PHÂN LOẠI

Đặc điểm của vi nấm

• Eukaryote: Vi sinh vật có nhân thật, nhân có màng nhân, Nhiễm sắc thể đơn bội hoặc lưỡng bội

• Không có diệp lục tố, dị dưỡng

• Thành tế bào chứa chitin và chitosan

• Sinh sản vô tính lẫn hữu tính

• Sterol ở màng sinh tế bào chất: Ergosterol

Hình thể

• Nấm sợi: nấm mốc (filamentous fungi/mould)

 Sợi nấm (hyphae) hệ sợi (mycelium)

 Sinh sản bằng bào tử (BT vô tính, BT hữu tính)

 Phát triển ở đầu sợi nấm

o Nấm men: yeast

 Sinh sản bằng cách nẩy chồi

 SS bằng cắt đôi

Khóm nấm mốc (mould) Khóm nấm men (yeast)

Cấu trúc tế bào nấm sợi

• Đa bào, các tế bào nối nhau dài như sợi chỉ, sợi

nấm nhỏ, mảnh, phân nhánh

• Tế bào nấm hình trụ, đường kính sợi nấm: 2 – 18

µm, có thành tế bào bao quanh;

• Giữa các tế bào Có vách ngăn (septate) hoặc

không có vách ngăn (coenocytic)

• Mỗi tế bào có từ 1 đến 2 nhân

Cấu trúc tế bào nấm sợi

Cấu trúc tế bào nấm men

• Đơn bào;

• Một số nấm men lưỡng hình, tạo thành sợi hoặc sợi giả do ảnh hưởng của môi trường (nhiệt độ)

• Mỗi tế bào có 1 nhân, nhiều cơ quan;

• Không bào lớn;

• Sinh sản bằng cách nẩy chồi ở một cực hay nhiều cực

lưới nội sinh chất (6) ,

bộ Golgi (7), không bào (8),

hạt lipid (9)

Cấu trúc tế bào nấm men

Thành tế bào vi nấm (cell wall)

Chiếm khoảng 15-30% trọng lượng khô TB nấm

Cấu tạo bởi một số chất :

+ Carbohydrat: chiếm khoảng 80%

Các polysaccharid: chitin, chitosan, cellulose,

β glucan, α glucan và mannan

+ Protein và glycoprotein: chiếm khoảng 10%

Protein giàu sulfur

Enzym: (1,3)-β-D-glucan synthase (GS)

chitin synthase…

• Chứa hệ gen của tế bào eukaryote;

• ADN nucleosome chromosome

• Màng nhân có các lỗ để chuyên chở protein và acid nucleic vào nhân;

• Protein ribosom được STH ở TB chất và được chuyên chở vào nhân kết hợp với ARN ribosome tạo thành tiểu đơn vị lớn và TĐV nhỏ

Phân biệt nấm sợi và nấm men

Thành phần thành TB Chitin, glucan Chitin, glucan

Sinh sản ở nấm men

Sinh sản vô tính ở nấm sợi

Sinh sản hữu tính ở nấm sợi

 Bệnh nhiễm nấm ngoại biên (the superficial fungal infection)

 Bệnh nhiễm nấm cố định dưới da (cutaneous mycoses):

 Bệnh nhiễm nấm nội tạng (systemic mycoses)

 Bệnh nấm cơ hội (opportunistic mycoses)

Theo cách sinh sản

 Zygomycota: sợi tơ nấm thông suốt; sinh sản bằng trứng (Mucor, Rhizopus,…)

 Nấm túi (Ascomycota): sợi nấm có vách ngăn, sinh sản bằng túi (Neurospora, Saccharomyces, )

 Nấm đảm (Basidiomycota): sợi nấm có vách ngăn

sinh sản bằng đảm

 Nấm khuyết (Deuteromycota): Không có bộ phận SS hữu tính (Alternaria, Aspergillus, Cladosporium,

Geotrichum, Penicillium, Fusarium, Trichoderma,…

Lợi ích do vi nấm mang lại cho người

o Chuyển hóa sinh học: bánh mì, rượu, bia, bán TH Steroid

o Cho các chất biến dưỡng

o Enzym vi nấm: sản xuất phô mai, kỹ nghệ enzym

o Sinh khối: probiotic từ nấm men Saccharomyces boulardii

o Đấu tranh sinh học: diệt côn trùng, diệt giun sán

o Nông nghiệp, lâm nghiệp: hệ nấm cộng sinh ở rễ cây

Sản xuất những chất biến dưỡng có lợi

• Acid hữu cơ

Acid hữu cơ từ vi nấm

Điều hòa sinh nở

Proteinase Aspergillus niger, A oryzae, A flavus, A sojae

Glucoamylase

……

A niger, A oryzae

Ứng dụng mới từ nấm

Sử dụng nấm làm vật chủ biểu hiện cho các protein trị liệu:

Ưu điểm:

• So với E coli: Có hệ lưới nội mô và bộ golgi để glycosyl hóa protein.

• So với eukaryote khác (nuôi cấy tế bào): Có thể nuôi cấy và duy trì dễ dàng trên các môi trường rẻ tiền

Nhược điểm:

• Các enzym glycozyl hóa ở nấm không có ở người , làm thay đổi thời gian bán hủy và tính sinh miễn dịch của protein

Một số protein tái tổ hợp từ nấm

Đã có hơn 120 protein tái tổ hợp của ĐVCV được biểu hiện bởi nấm men:

• Từ Saccharomyces cerevisiae: insulin, kháng thể bề mặt của virut Hepatitis B, urat oxidase, glucagon,…

• Từ Pichia pastoris (nấm men sử dụng được các hợp chất 1C như methanol, methan-methylotrophic yeast):

angiostatin, endostatin, Elastabe, yếu tố 1 giống insulin,…

Bởi nấm sợi:

• Sản xuất protein tái tổ hợp: A niger, A nidulans, Trichoderma reesi

• Sản xuất kháng thể: A niger

Sự nhiễm nấm ở các sản phẩm thuốc, mỹ phẩm,…

Thuốc & mỹ phẩm nhiễm nấm:

• Là lý do của các sản phẩm bị thu hồi;

• Làm hư hỏng sản phẩm;

• Ảnh hưởng đến sản xuất

Tác hại:

• Giảm thời gian lưu trữ thuốc

• Ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân

Nguyên nhân:

• Thiếu kiểm soát

• Các test kiểm soát không thích hợp

Sự nhiễm nấm ở các dược phẩm

• Gây hư hỏng thuốc

• Gây biến đổi hoạt tính của thuốc

+ ảnh hưởng đến hoạt chất của thuốc: sinh chất biến dưỡng lạ

+ thay đổi về cảm quan

• ảnh hưởng sức khỏe bệnh nhân: mức độ ảnh hưởng tùy bệnh nhân, tùy sản phẩm, tùy loài nấm nhiễm, tùy sức đề kháng của bệnh nhân

Nguồn nhiễm nấm cho các sản phẩm thuốc

• Vật dụng trong phòng pha chế: túi, hộp, thiết bị, bánh xe,…

• Nguyên liệu dùng trong pha chế

• Người : vẩy da, tóc,…

• Phải tuân thủ các qui định về phòng sạch trong pha chế (bụi, VSV, hóa chất, ẩm):

- Không khí: lọc HEPA, ULPA

- Bề mặt: Sử dụng các chất diệt trùng

- Hệ thống chống ẩm

Chọn chất sát trùng

Tác động của các chất sát trùng trên vi nấm:

• Thay đổi tùy loại nấm (nấm men và nấm sợi)

• Tế bào nấm và bào tử nấm đề kháng với chất sát trùng hơn vi khuẩn, ít đề kháng hơn bào tử vi khuẩn

• Vi nấm có sự đề kháng tự nhiên với chất sát trùng:

+ Có hàng rào ngăn một số chất diệt trùng thấm qua TB nấm

+ Sản xuất enzym bất hoạt chất sát trùng

Phải chọn chất sát trùng và test thử khả năng diệt nấm

Sự đề kháng với chất sát trùng nhóm phenolic của A niger

Đối với sản phẩm

Kiểm tra mức độ nhiễm:

• Sản phẩm qua tiệt trùng: phải không bị nhiễm

• Sản phẩm không qua tiệt trùng: Thử giới hạn mức độ nhiễm

Vi nấm gây bệnh cho người

• Bệnh nấm ngoại biên: bệnh nấm da, bệnh lang ben,…

• Bệnh nấm dưới da: bệnh do nấm lưỡng hình Sporothrix schenckii, bệnh bướu nấm.

• Bệnh nấm nội tạng: vi nấm gây bệnh nội tạng (Aspergillus fumigatus), vi nấm cơ hội (Candida

albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus flavus,…)

• Bệnh độc tố nấm

Thuốc dùng trong điều trị bệnh nhiễm nấm

Trước 1950 Chưa có thuốc (KI)

Một số kỹ thuật vi nấm/ngành dược

Thử giới hạn vi nấm trong thuốc

• Phương pháp pha loãng trong thạch (đếm khóm nấm phát triển trên môi trường, xác định CFU - colony

forming unit)

• Phương pháp chuẩn trong kiểm định vi sinh trong thuốc, mỹ phẩm và thực phẩm

• Phương pháp thích hợp cho vi khuẩn và nấm men

• Kết quả xác định CFU chịu ảnh hưởng bởi mức độ tạo bào tử ở vi nấm

Một số phương pháp xác định mức độ nhiễm nấm khác

• Sử dụng các môi trường nuôi cấy chọn lọc dựa vào đặc điểm sinh thái của từng nhóm nấm

• Xác định sinh khối của nấm

◦ Phương pháp huyết thanh học

◦ Định lượng chitin

◦ Định lượng ergosterol…

◦ Phát hiện chất bay hơi do Vn sản sinh

• Kỹ thuật phân tử

Kiểm soát phòng sạch và môi trường

• Mục đích: xác định mức độ nhiễm VSV ở vị trí nhất định trong suốt tiến trình pha chế và đóng gói

• Phương pháp kiểm soát bề mặt *:**

+ Đặt đĩa thạch tiếp xúc,

+ Lấy mẫu bằng que bông vô trùng,…

• Kiểm soát không khí: đặt đĩa thạch, máy

Một số kỹ thuật xác định hoạt tính của các chất kháng nấm

Sử dụng cho nấm men

NCCLS – M27 A2

- Kỹ thuật pha loãng

- Kỹ thuật vi pha loãng

Chuẩn, lập lại, tương quan tốt giữa

in vitro và in vivo

Tương quan tốt với kỹ thuật pha loãng

Sử dụng cho nấm sợi:

NCCLS M38-A

và in vivo

• Có màu, không màu.

4. Bào tử vô tính và bào tử hữu tính

5. Các tính chất sinh lý