Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)

Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dƣơng Thị Giang PHÁT HIỆN NGƢỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS BS Trần Huy Thịnh PGS.TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội - Năm 2015 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21HYDROXYLASE 1.1 Một số nét khái quát bệnh TSTTBS 1.2 Vài nét tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS 1.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS Việt Nam .7 1.3 Tần suất mắc bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh 1.4 Cơ chế bệnh sinh bệnh TSTTBS 1.5 Lâm sàng bệnh TSTTBS 10 CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS 12 2.1 Cơ sở phân tử bệnh TSTTBS .12 2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức gen CYP21 12 2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS .13 2.2 Đặc điểm di truyền bệnh TSTTBS .15 2.3 Biểu lâm sàng, cận lâm sàng ngƣời mang gen dị hợp tử .16 2.4 Phát ngƣời lành mang gen bệnh 17 CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS 18 3.1 Chẩn đoán lâm sàng cận lâm sàng 18 3.1.1 Chẩn đoán xác định 18 3.1.2 Chẩn đoán phân biệt .19 3.2 Các phƣơng pháp sinh học phân tử phát đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS 20 3.2.1 Kỹ thuật PCR .20 3.2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) .21 3.2.3 Kỹ thuật Souther blot 22 3.2.4 Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification) 22 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 26 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 26 2.2.1 Dụng cụ trang thiết bị 26 2.2.2 Hoá chất 26 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 28 2.4 Đạo đức nghiên cứu 28 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu 29 2.5.2 Tiến hành xét nghiệm .29 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 3.1 Kết tách chiết DNA 35 3.2 Kết phát đột biến gen bệnh nhân phát ngƣời lành mang gen bệnh 37 KẾT LUẬN 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh - TSTTBS (congenital adrenal hyperplasia CAH) bệnh gây giảm hoàn toàn năm enzym tham gia vào trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn trình tổng hợp hormon vỏ thƣợng thận; đó, thể thiếu 21- hydroxylase (21-OH) hay gặp chiếm tỷ lệ 90 - 95%, thể thiếu 11β-hydroxylase chiếm - 9%, lại thể bệnh gặp thiếu hụt 3-hydroxy steroid dehydrogenase (3β-HSD), 17α-hydroxylase 20, 22- desmolase [1] Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase bệnh di truyền đơn gen lặn, nhiễm sắc thể thƣờng đột biến gen CYP21A2 gây nên Đối với thể nặng, bệnh không đƣợc chẩn đoán sớm điều trị thích hợp dẫn đến suy thƣợng thận cấp bệnh nhân tử vong Các thể bệnh khác dẫn đến nam hóa trẻ gái, giả dậy sớm trẻ trai; bệnh ảnh hƣởng nặng nề đến phát triển thể chất, chức sinh sản, tâm lý ngƣời bệnh gia đình [6] Sự phát triển ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR, giải trình tự gen (Sequencing), MLPA (Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification)… phát đƣợc hầu hết đột biến gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh, đột biến điểm chiếm tỷ lệ từ 70 - 75%, dạng đột biến đoạn, thêm đoạn, lặp đoạn đảo đoạn chiếm từ 25 - 30% trƣờng hợp [25] Nhiều nghiên cứu tìm thấy mối tƣơng quan kiểu gen kiểu hình bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh cách xác định đột biến đặc trƣng thể bệnh Các đột biến gen CYP21A2 trầm trọng nhƣ: đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn gen lớn hay đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) làm hoàn toàn hoạt tính enzym 21- hydroxylase gây thể bệnh nặng hay gặp thể muối Đột biến sai nghĩa nhƣ I172N làm giảm hoạt tính enzym 21hydroxylase - 2% so với bình thƣờng gặp thể nam hoá đơn hay P30L, V281L, P453S làm giảm hoạt tính enzym 21- hydroxylase 20 - 50% so với bình thƣờng gặp thể bệnh không điển hình Xác định xác dạng đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng giúp chẩn đoán sớm có biện pháp can thiệp điều trị kịp thời nhằm giảm tác động việc thiếu hụt enzym 21 - hydroxylase bệnh nhân Bên cạnh việc xác định ngƣời lành mang gen cung cấp thông tin hữu ích cho tƣ vấn di truyền chẩn đoán trƣớc sinh giúp giảm tỷ lệ sinh đứa trẻ bị bệnh, đồng thời giúp sàng lọc sơ sinh để quản lý chăm sóc tốt trẻ có nguy cao bị bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh cộng đồng Các đột biến đoạn, lặp đoạn đảo đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 25 - 30%, dạng đột biến gây thể bệnh nặng nên cần phải có biện pháp chẩn đoán xác kịp thời Tuy nhiên, dạng đột biến khó xác định kỹ thuật PCR thông thƣờng Gần đây, kỹ thuật MLPA phƣơng pháp với thời gian tiến hành ngắn, đơn giản độ nhạy cao phát xác dạng đột biến gen CYP21A2 Việc ứng dụng kỹ thuật MLPA chƣa đƣợc khai thác nhiều Việt Nam, đặc biệt việc xác định ngƣời lành mang gen gây bệnh di truyền Chính nhằm mục đích giúp quản lý tốt ngƣời mang gen cung cấp thông tin hữu ích cho tƣ vấn di truyền chẩn đoán trƣớc sinh, tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase kỹ thuật MLPA với mục tiêu: Phát ngƣời mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 - OH CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21-HYDROXYLASE 1.1 Một số nét khái quát bệnh TSTTBS Bệnh tăng sản tuyến thƣợng thận bẩm sinh hay gọi hội chứng sinh dục- thƣợng thận, bệnh di truyền gen lặn NST thƣờng, thiếu hụt enzym tham gia vào trình tổng hợp hormon vỏ thƣợng thận Trong đó, thiếu hụt enzym 21- hydroxylase (21- OH) hay gặp nhất, chiếm tỷ lệ 90 - 95%, tiếp đến thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase (11- OH), 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD), 17α- hydroxylase (17- OH) gặp thiếu hụt 20 - 22 desmolase [35] Sự thiếu hụt enzym 21- hydroxylase dẫn đến tổng hợp cortisol phần lớn aldosterron tuyến thƣợng thận bị suy giảm, gây tăng tiết Adreno Corticotropin Hormon (ACTH) tuyến yên, tăng sản vỏ thƣợng thận sản xuất thừa androgen Tùy theo mức độ thiếu hụt enzym 21- hydroxylase mà lâm sàng biểu mức độ nặng hay nhẹ khác Thiếu hụt hoàn toàn enzym 21- hydroxylase gây bệnh cảnh lâm sàng muối với triệu chứng suy thƣợng thận cấp cƣờng androgen, thiếu enzym 21- hydroxylase mức độ vừa phải (1 - 3%) biểu triệu chứng nam hóa đơn cƣờng androgen enzym 21hydroxylase giảm nhẹ (20 - 50%) xuất thể bệnh không cổ điển [15] 1.2 Vài nét tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS 1.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS giới Theo y văn, trƣờng hợp bệnh TSTTBS giới đƣợc mô tả nhà giải phẫu học De Crecchico vào năm 1865 Đầu kỷ 19, Emil Huschke, nhà giải phẫu phôi thai học, phân biệt vỏ tủy thƣợng thận, đồng thời tìm thấy mối liên quan tuyến thƣợng thận tuyến sinh dục [8] Bệnh nhân TSTTBS thể muối đƣợc Butler (1939) Wilkins (1940) mô tả Năm 1950 - 1951, Wilkins, Bartter cộng chứng minh việc sử dụng cortisol ức chế tổng hợp thừa androgen hội chứng sinh dục - thƣợng thận TSTTBS [9] Trong giai đoạn này, nhà nghiên cứu xác định steroid vỏ thƣợng thận có tác dụng sinh học, chúng đƣợc tổng hợp từ cholesterol đƣợc chia thành nhóm: (i) Steroid chuyển hóa muối gồm DOC, corticosteron aldosteron; (ii) Steroid chuyển hóa đƣờng gồm hydrocortisone, cortisol; (iii) Steroid sinh dục nam (androgen) gồm dehydroepiandrosteron androstendion [10] Từ năm 1970, nghiên cứu định lƣợng 17- OHP, tiền chất trực tiếp tạo cortisol, đƣợc coi tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh TSTTBS Năm 1979 - 1980, Migeon Rosenwaks hoàn chỉnh tiêu chuẩn chẩn đoán hóa sinh bệnh TSTTBS: thiếu enzym 21- OH gây tích tụ tiền chất trƣớc chỗ ứ đọng chuyển hóa bao gồm 17- OHP progesteron, dẫn đến tăng tổng hợp testosteron vỏ thƣợng thận, nồng độ testostrron máu tăng sản phẩm đào thải testosteron nƣớc tiểu 17- Cetosteroid (17-CS) tăng Nồng độ 17- OHP tăng cao máu tiêu chuẩn có giá trị đặc hiệu để chẩn đoán TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH Quy luật di truyền bệnh TSTTBS đƣợc nhận biết từ năm 1930 đƣợc mô tả chi tiết Knudson năm 1951, bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm nhiễm sắc thể thƣờng Năm 1977, Dupont thông báo đồ gen liên kết gần TSTTBS phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC) Sau đó, Komainami phân lập đƣợc Cytochrome P450c21 chuỗi peptid đơn Năm 1982 - 1983, O’ Neill Fleishwicle phát liên quan gen CYP21 với MHC nhóm III gồm yếu tố B, C2, C4A, C4B [37] Năm 1984, Hite cộng xác định đƣợc gen CYP21A2 giả gen CYP21A2P có kích thƣớc 3,4 kb; nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, bên phức hợp MHC với gen C4 bổ thể [27] Năm 1986, Higashi cộng phân tích trình tự nucleotid toàn gen CYP21A2 giả gen CYP21A2P Sau đó, đột biến điển hình gen CYP21A2 đƣợc tìm thấy, chúng đƣợc coi nguyên nhân gây thiếu hụt enzym 21- OH [23] Phƣơng pháp lai Southern blot Edward Southern đề xuất năm 1975 đƣợc nhiều tác giả sử dụng để phát đột biến đoạn gen CYP21A2 thƣờng gặp [24] Đến nay, nhờ kết hợp phản ứng PCR với số kỹ thuật sinh học phân tử khác nhƣ giải trình tự gen, hầu hết đột biến gen CYP21 gây bệnh TSTTBS đƣợc phát [26] 1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS Việt Nam Ở nƣớc ta có nhiều công trình nghiên cứu bệnh TSTTBS Các công trình nghiên cứu kể đến nhƣ: Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn cộng tổng kết 36 bệnh nhân mắc hội chứng sinh dục - thƣợng thận giai đoạn 1981 - 1990, chiếm tỷ lệ 1,9% tổng số bệnh nhân nội tiết, có tỷ lệ tử vong 5,5% [9] Năm 1994, nhóm nghiên cứu Nguyễn Nguyệt Nga, Nguyễn Thu Nhạn tổng kết chẩn đoán điều trị bệnh TSTTBS Chẩn đoán dựa vào lâm sàng xét nghiệm hóa sinh progesteron, testosteron, cortisol, Follice Stimulating Hormon (FSH), Luteinizing Hormon (LH), điện giải đồ, 17 Cetosteroid (17- CS) 17 – Hydroxycetosteroid (17- OHCS); điều trị bệnh prednisolone nƣớc muối đƣờng với thể muối [8] Năm 2000, Võ Thị Kim Huệ cộng công bố nghiên cứu chẩn đoán điều trị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH 43 bệnh nhân khám điều trị Bệnh viện Nhi Trung ƣơng 1989 - 1997 Nghiên cứu đƣa dấu hiệu lâm sàng giới hạn giá trị 17- OHP, progesteron testosteron giúp chẩn đoán sử dụng Hydrocortison Florinef điều trị bệnh thay cho Prednisolon đặc biệt tác giả sử dụng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) để phát đột biến [3] Năm 2001, Thái Thiên Nam nghiên cứu phát đột biến gen cho bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH [7] Năm 2004, Triệu Quốc Khánh nghiên cứu nhận thức bố mẹ bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thấy bệnh ảnh hƣởng nặng nề đến tình trạng tâm lý gia đình bệnh nhân [2] Năm 2006, Trần Kiêm Hảo nghiên cứu xác định số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH phát ngƣời lành mang gen bệnh [4] Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang nghiên cứu phát triển thể chất số yếu tố ảnh hƣởng trẻ TSTTBS điều trị Bệnh viện Nhi Trung ƣơng nhận thấy bệnh gây ảnh hƣởng lớn đến phát triển trẻ đặc biệt chiều cao [1] Nhìn chung, Việt Nam nghiên cứu lâm sàng ảnh hƣởng tâm lý gia đình bệnh nhân phổ biến, chƣa có nhiều nghiên cứu bệnh học phân tử bệnh TSTTBS 1.3 Tần suất mắc bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh Tần suất mắc bệnh giới 1/10.000 - 1/15.000 Tỷ lệ mắc bệnh cao hai quần thể ngƣời Eskimo Yupik (Alaska) La Réunion (Pháp) với tần suất 1/282 1/2141, tỷ lệ mắc bệnh châu Âu 1/14.000 [28] Một nghiên cứu Nhật thành phố Sapporo năm 1982 - 2005 đƣa tỷ lệ mắc bệnh TSTTBS 1/19.634 tỷ lệ kiểu hình theo thứ tự thể MM : thể NHĐT : thể không điển hình 16 : : Tại Việt Nam, hàng năm có từ 50 đến 70 trẻ đƣợc chẩn đoán mới, chiếm tỷ lệ 60,7% bệnh lý tuyến thƣợng thận chiếm 2% bệnh lý di truyền vào điều trị khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi TW [17] Bảng 1.1: Tần số mắc bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH giới Tên nƣớc STT Tần suất Alaska,Yupik Eskimos 1/ 280 Pháp (đảo Reunion) 1/2100 Thụy Điển 1/9800 Mỹ ( Bang Wisconsin) 1/11.000 Pháp ( thành phố Lille) 1/13.000 Nhật 1/18.000 Ý 1/18.000 1.4 Cơ chế bệnh sinh bệnh TSTTBS Khi thiếu enzym, hay nhiều đƣờng tổng hợp hormon bị tắc nghẽn hormon dƣới chỗ tắc không đƣợc sản xuất đủ, đặc biệt cotisol Cơ chế điều hòa ngƣợc (feed back) kích thích tuyến yên sản xuất tiết ACTH, gây tăng sản tuyến thƣợng thận, kích thích tế bào chứa melanin tạo hắc tố [26] Hình 1.1 Sơ đồ tổng hợp hormon vỏ thượng thận thiếu hụt enzym [35] Thiếu hụt enzym 21-OH gây giảm tổng hợp cortisol, tăng tiền thân cortisol nhƣ 17- hydroxyprogesteron (17-OHP) progesteron, tăng hormon sinh dục vỏ thƣợng thận nhƣ dehydroepiandrosterone (DHEA), D4 Hình ảnh phân tích gen kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy ngƣời bình thƣờng xuất đủ đỉnh bệnh nhân không thấy xuất đỉnh tƣơng ứng với exon đến exon, vậy, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn từ exon đến exon Phân tích kết ngƣời bố ngƣời mẹ bệnh nhân cho thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với ngƣời bình thƣờng, chứng tỏ bố, mẹ bệnh nhân ngƣời mang gen bệnh Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS02: Hình 3.5 Phả hệ gia đình số 02 Gia đình có gái tuổi bị bệnh TSTTBS thể muối, kiểu gen đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon đến exon Bố mẹ bệnh nhân có kiểu hình bình thƣờng mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon đến exon Trong gia đình không mắc bệnh giống bệnh nhân 42 Kiểu gen gia đình số 02 Người bình thường C4B C4A Ex3 Ex4 E10P Ex8 Ex1 Ex6 E1P I2P Y Hình 3.6 Kết MLPA gia đình mã số 02 Hình ảnh phân tích gen kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy ngƣời bình thƣờng xuất đủ đỉnh bệnh nhân không thấy xuất 43 đỉnh tƣơng ứng với exon đến exon 3, vậy, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn từ exon đến exon Phân tích kết ngƣời bố ngƣời mẹ bệnh nhân cho thấy đỉnh exon 1, exon 1/2 so với ngƣời bình thƣờng, chứng tỏ bố, mẹ bệnh nhân ngƣời mang gen bệnh Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS03: Hình 3.7 Phả hệ gia đình số 03 Phả hệ hệ, hệ thứ thứ bị bệnh Ở hệ thứ có gia đình có trai tuổi bị bệnh TSTTBS (III.4 ) thể muối kiểu gen đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon đến exon Bố mẹ có kiểu hình bình thƣờng, mẹ mang gen dị hợp tử đột biến xóa đoạn exon đến exon 44 Kiểu gen gia đình số 03 Người bình thường Ex4 C4B C4A E10P Ex8 Ex1 Ex3 I2P E1P Ex6 Y SALSA MLPA KIT P050-B2 CAH, MRC-Holland Bệnh nhân Ex3 Ex4 Ex6 Ex1 Y Ex8 Bố bệnh nhân Ex8 Ex4 Ex3 Ex1 Ex6 Y Mẹ bệnh nhân Ex3 Ex8 Ex4 Ex6 Ex1 Y Hình 3.8 Kết MLPA gia đình mã số 03 Hình ảnh phân tích gen kỹ thuật MLPA (hình 3.8) gen CYP21A2 cho thấy ngƣời bình thƣờng xuất đủ đỉnh bệnh nhân đỉnh từ exon đến exon 1/2 ngƣời bình thƣờng, bệnh nhân có đột biến dị hợp xóa đoạn từ exon đến exon Phân tích kết ngƣời bố thấy tất 45 đỉnh gen CYP21A2 bình thƣờng chứng tỏ bố đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 ngƣời mẹ bệnh nhân cho thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với ngƣời bình thƣờng, chứng tỏ mẹ bệnh nhân ngƣời mang gen bệnh Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS04: Hình 3.9 Phả hệ gia đình số 04 Gia đình có gái tháng bị bệnh TSTTBS thể muối nặng với kiểu gen đột biến dị hợp xóa đoạn exon đến exon Phân tích phả hệ, gia đình bị bệnh giống bệnh nhân, bố 23 tuổi, mẹ 21 tuổi ngƣời bình thƣờng lâm sàng, mẹ mang gen dị hợp tử xóa đoạn exon đến exon 46 Kiểu gen gia đình số 04 Người bình thường Ex4 C4B C4A E10P Ex8 Ex1 Ex3 Ex6 E1P I2P Y SALSA MLPA KIT P050-B2 CAH, MRC-Holland Hình 3.10 Kết MLPA gia đình mã số 04 Hình ảnh phân tích gen kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy 47 ngƣời bình thƣờng xuất đủ đỉnh bệnh nhân đỉnh từ exon đến exon 1/2 ngƣời bình thƣờng, bệnh nhân có đột biến dị hợp xóa đoạn từ exon đến exon Phân tích kết ngƣời bố thấy tất đỉnh gen CYP21A2 bình thƣờng chứng tỏ bố đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 ngƣời mẹ bệnh nhân cho thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với ngƣời bình thƣờng, chứng tỏ mẹ bệnh nhân ngƣời mang gen bệnh Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS05: Hình 3.11 Phả hệ gia đình số 05 Gia đình có gái (III.1) tuổi bị bệnh TSTTBS thể nam hóa đơn thuần, mang đột biến dị hợp tử đoạn từ exon đến exon đột biến dị hợp tử I172N gen CYP21A2 Bố (II.2) 27 tuổi, mẹ (II.4) 25 tuổi Em trai (III.2) hoàn toàn bình thƣờng, em gái (III.3) có kiểu gen kiểu hình tƣơng tự bệnh nhân (III.1) Hai em họ (III.2, III.3) biểu bệnh 48 Kiểu gen gia đình số 05 Người bình thường C4B C4A Ex4 E10P Ex8 Ex1 Ex3 Ex6 Y SALSA MLPA KIT P050-B2 CAH, MRC-Holland Ex3 Ex4 Ex1 Y Ex3 Ex4 Ex1 Ex3 Ex4 Ex1 Y Y 49 E1P I2P Hình 3.12 Kết MLPA gia đình mã số 05 Hình ảnh (hình 3.12) phân tích gen kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy ngƣời bình thƣờng xuất đủ đỉnh bệnh nhân đỉnh từ exon đến exon 1/2 ngƣời bình thƣờng, phân tích kết ngƣời bố thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với ngƣời bình thƣờng, ngƣời mẹ có đỉnh exon 1/2 ngƣời bình thƣờng, từ kết bệnh nhân bố mẹ bệnh nhân chứng tỏ bệnh nhân mang đột biến dị hợp tử kết hợp xóa đoạn từ exon đến exon đột biến điểm I172 (probe exon thiết kế để phát đột biến I172N), ngƣời bố mang gen dị hợp tử xóa đoạn từ exon đến exon 3, ngƣời mẹ mang gen dị hợp tử I172N Phân tích thêm hình ảnh MLPA em trai em gái bệnh nhân thấy em trai bệnh nhân hoàn toàn bình thƣờng, em gái bệnh nhân mang đột biến tƣơng tự bệnh nhân 50 Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS06: Hình 3.13 Phả hệ gia đình số 06 Ở hệ thứ có gái 18 tháng, mang đột biến dị hợp xóa đoạn exon đến exon với kiểu hình muối Bố 30 tuổi mẹ 28 tuổi Anh trai tuổi biểu bệnh Trong phả hệ không bị bệnh giống bệnh nhân 51 Kiểu gen gia đình số 06 Người bình thường C4B C4A Ex3 Ex4 E10P Ex8 Ex1 Ex6 E1P I2P Y SALSA MLPA KIT P050-B2 CAH, MRC-Holland Hình 3.14 Kết MLPA gia đình mã số 06 Hình ảnh phân tích gen kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy 52 ngƣời bình thƣờng xuất đủ đỉnh bệnh nhân đỉnh từ exon đến exon 1/2 ngƣời bình thƣờng, bệnh nhân có đột biến dị hợp xóa đoạn từ exon đến exon Phân tích kết ngƣời bố thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với ngƣời bình thƣờng, chứng tỏ bố bệnh nhân ngƣời mang gen bệnh, hình ảnh MLPA ngƣời mẹ bệnh nhân cho thấy tất đỉnh gen CYP21A2 bình thƣờng, chứng tỏ mẹ đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 53 KẾT LUẬN Ở nhóm bệnh nhân có đột biến, phát 2/6 bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1- exon 1- bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn kết hợp với đột biến I172N dị hợp tử Các bệnh nhân lại mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- dị hợp tử xóa đoạn exon 1- Ở nhóm bố mẹ thành viên gia đình bệnh nhân (em trai, em gái), phát 4/6 ngƣời bố mang gen 5/6 ngƣời mẹ mang gen, em gái bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- kết hợp với đột biến dị hợp tử I172N 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thúy Giang (2008), Nghiên cứu phát triển thể chất số yếu tố ảnh hưởng trẻ TSTTBS điều trị Bệnh viện Nhi trung ương, Luận văn Thạc sĩ Y học, Trƣờng đại học Y Hà Nội Triệu Quốc Khánh (2004), Nghiên cứu nhận thức bố mẹ bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, Luận văn Thạc sĩ Y học, Trƣờng đại học Y Hà Nội Võ Thị Kim Huệ (2000), Góp phần nghiên cứu chẩn đoán điều trị bệnh TSTTBS thiếu enzyme 21- hydroxylase trẻ em, Luận án Tiến sĩ khoa học Y học, Trƣờng Đại học Y Hà Nội Trần Kiêm Hảo (2007), Xác định số đột biến CYP21 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21- hydroxylase phát người lành mang gen bệnh, Luận án Tiến sỹ y học, Trƣờng Đại học Y Hà Nội Nguyễn Thị Phƣơng Mai, Lý Thanh Hà, Nguyễn Mai Hƣơng cộng (2008), “Xét nghiệm di truyền chẩn đoán trƣớc sinh bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh”, Tạp chí nghiên cứu y học, 57(4), tr 259 - 264 Thái Thiên Nam (2001), Phát đột biến gen CYP21 tăng sản thượng thận bẩm sinh so thiếu enzym 21-hydroxylase trẻ em, Luận văn Thạc sỹ y khoa, Trƣờng Đại học Y Hà Nội Thái Thiên Nam, Nguyễn Thị Phƣợng, Võ Thƣơng Lan (2002), “Phát đột biến gen CYP21 tăng sản thƣợng thận bẩm sinh thiếu enzyme 21-hydroxylase trẻ em gia đình trẻ bị bệnh viện Nhi”, Nhi khoa; tập 10, số đặc biệt chào mừng 100 năm Trƣờng Đại học Y Hà Nội Nguyễn Thu Nhạn (1994), “Dậy sớm”, Cẩm nang điều trị Nhi khoa Nhà xuất Y học, tr 245 - 246 Nguyễn Thu Nhạn, Cao Quốc Việt, Nguyễn Nguyệt Nga, Nguyễn Thị Phƣợng, Nguyễn Thị Hoàn, Trần Thị Hòa (1991), “Bệnh rối loạn nội tiếtchuyển hóa di truyền viện bảo vệ sức khỏe trẻ em”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học 10 năm (1981 – 1990), tr 66 - 75 10 Nguyễn Thị Phƣợng (1996), “Đặc điểm di truyền hội chứng sinh dục thƣợng thận”, Di truyền học ứng dụng, tr - 11 Nguyễn Thanh Thúy (2010), “Sử dụng kỹ thuật PCR lồng phát AND thai từ huyết mẹ ứng dụng chẩn đoán trƣớc sinh”, Tạp chí thông tin Y – Dược Số đặc biệt chào mừng ngày gặp mặt liên viện hàng năm giảng dạy nghiên cứu miễn dịch học lần thứ 20, tr 41 - 45 12 Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 13 Tạ Thành Văn (2010), PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học, tr 28 - 32 Tiếng Anh 14 Aysha H Khan, Muniba Aban, Jamal Raza (2011), “Ethnic disparity in 21 – hydroxylase gene mutations identified in Pakistani congenital adrenal hyperplasia patients”, BMC Endocrine Disorders, Biomed central, pp.1 - 13 15 Angel O K Chan, But M W (2011), “Molecular analysis of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency in Hong Kong Chinese patients”, Steroids, 76, pp 1057 - 1062 11,19,21,23,27,30,33,34,39,41,43,45,47,48,50 1-10,12-18,20,22,24-26,28,29,31,32,35-38,40,42,44,46,49,51- [...]... biến gen CYP21A2 Trong đó, nồng độ 17OHP có giá trị cao trong chẩn đoán bệnh, đây là tiền chất để tổng hợp enzym 16 21- OH nên giá trị 17- OHP tăng sớm và tăng cao ở trên bệnh nhân và ngƣời mang gen, ngƣời ta còn ứng dụng giá trị này để làm sàng lọc chẩn đoán sớm bệnh ở các nƣớc phát triển [1] 2.4 Phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh Ngƣời mang gen bệnh (dị hợp tử) rất khó phát hiện không biểu hiện tính... sắc thể số 6 và vị trí gen CYP21 [19] Cấu trúc gen CYP21 Gen mã hóa cho enzym 21- OH của vỏ thƣợng thận là gen CYP21A2, có kích thƣớc 30 kb và cùng với giả gen không chức năng (nonfunctional pseudogene), CYP21A2P, nằm trên cánh ngắn, nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3), trong vùng phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (major histocompatibility complex-MAC) (cạnh gen HLA) Gen CYP21A2 và gen tƣơng đồng của nó, CYP21A2P,... quần thể cô lập làm tăng khả năng sinh con bị bệnh và tăng tần số ngƣời mang gen bệnh lặn trong quần thể [3],[19],[32] 2.3 Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của ngƣời mang gen dị hợp tử Về mặt xét nghiệm, ngƣời mang gen dị hợp tử chứa các đột biến gen CYP21A2 có tăng nhẹ nồng độ 17-OHP, cortisol sau khi kích thích thƣợng thận cao hơn những ngƣời bình thƣờng không mang gen [19], [26] Chẩn đoán bệnh dựa... (Lee HH el al 2000) Do thiếu hụt enzym 21- OH có liên quan đến typ HLA, nên có thể xác định đột biến gen CYP21A2 hoặc phát hiện ngƣời lành mang gen bằng cách phân loại typ huyết thanh HLA dựa trên các dấu ấn của bệnh nhân và tế bào ối thai nhi hoặc đối tƣợng có nguy cơ cao Nếu kết quả typ HLA giống nhau và có thể chẩn đoán thai nhi bị bệnh TSTTBS thể thiếu 21- OH hoặc ngƣời lành mang gen với độ tin cậy cao... trong các thể bệnh và người mang gen dị hợp tử [36] Phòng bệnh TSTTBS bằng sàng lọc ngƣời mang gen đƣợc tiến hành ở gia đình, dòng họ của trẻ bị bệnh hoặc trong quần thể có tỷ lệ mắc bệnh cao để quản lý ngƣời mang gen và ngƣời bệnh Qua sàng lọc này để có thể đƣa ra lời khuyên di 17 truyền phù hợp nhằm tránh khả năng kết hôn trong cùng dòng họ cũng nhƣ tránh kết hôn giữa những ngƣời mang gen bệnh (Aa... TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS 2.1 Cơ sở phân tử của bệnh TSTTBS 2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21 Vị trí gen CYP21 Gen CYP21 gồm có 2 bản sao CYP21A2 và giả gen CYP21A2P, cả hai cùng nằm bên trong phức hợp hòa hợp mô chủ yếu MHC trên cánh ngắn của NST số 6 vùng 6p21.3 Trong vùng này, gen CYP21A2 và CYP21A2P nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B mã hóa cho thành phần của C4 bổ thể [18],... tổng hợp enzym 21- OH [20] 2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS Hai gen CYP21A2 và CYP21A2P có trình tự tƣơng đồng nhau Trình tự của gen giả CYP21A2P có các loại đột biến thƣờng thấy trên bệnh nhân TSTTBS Điều này có thể giải thích là do quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt chéo không đồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể dẫn tới việc các trình tự ở vùng gen giả CYP21A2P chuyển sang CYP21A2... khỏe mạnh nhƣng khi xây dựng gia đình với ngƣời mang gen bệnh và sinh con thì truyền bệnh cho con theo tỷ lệ phân ly gen bệnh của qui luật Mendel Bệnh truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Tần xuất ngƣời mang gen bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH là 1/60 tùy thuộc vào chủng tộc Tần số đột biến tự nhiên mới phát sinh cần có cả hai đột biến về cùng một gen ở cả hai bên bố mẹ nên xác xuất xảy ra vô cùng... việc thiếu hoàn toàn enzym 21- OH gây giảm aldosteron làm mất natri qua nƣớc tiểu, giảm khối lƣợng tuần hoàn (hội chứng mất muối) [35] 1.5 Lâm sàng bệnh TSTTBS Sự thiếu hụt enzym 21- OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/hoặc thiếu hụt aldosteron cũng nhƣ thừa androgen thƣợng thận Tùy thuộc vào mức độ thiếu hụt của 21- OH mà sự biểu hiện lâm sàng của TSTTBS đƣợc chia thành 3 thể khác nhau bao gồm:  Thể. .. nhiên do gen giả CYP21A2P có tính tƣơng đồng cao với gen thật CYP21A2 nên việc khuếch đại gen CYP21A2 không dễ thực hiện do đó việc thiết kế mồi phải có trình tự đặc hiệu với gen CYP21A2 mà không đặc hiệu CYP21A2P [22] Hình 1.7 Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR 3.2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) Đoạn DNA cần giải trình tự đƣợc sử dụng nhƣ trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) ... mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase kỹ thuật MLPA với mục tiêu: Phát ngƣời mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu. .. 95%, thể thiếu 11β -hydroxylase chiếm - 9%, lại thể bệnh gặp thiếu hụt 3-hydroxy steroid dehydrogenase (3β-HSD), 17α -hydroxylase 20, 22- desmolase [1] Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh thiếu enzym. .. biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH phát ngƣời lành mang gen bệnh [4] Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang nghiên cứu phát triển thể chất số yếu tố ảnh hƣởng trẻ TSTTBS điều trị Bệnh