PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH TĂNG sản THƯỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21 HYROXYLASE BẰNG kỹ THUẬT MLPA (tóm tắt)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dương Thị Giang PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: TS BS Trần Huy Thịnh PGS.TS Nguyễn Quang Huy Phản biện 1: PGS.TS Trần Vân Khánh Phản biện 2: TS Nguyễn Đình Thắng Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp sở chấm luận văn Thạc sĩ họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, vào hồi 09 giờ, ngày 26 tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tăng sản thượng thận bẩm sinh - TSTTBS (congenital adrenal hyperplasia CAH) bệnh gây giảm hoàn tồn năm enzym tham gia vào q trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận; đó, thể thiếu 21- hydroxylase (21-OH) hay gặp chiếm tỷ lệ 90 - 95%, thể thiếu 11β-hydroxylase chiếm - 9%, lại thể bệnh gặp thiếu hụt 3β-hydroxy steroid dehydrogenase (3β-HSD), 17α-hydroxylase 20, 22- desmolase [1] Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase bệnh di truyền đơn gen lặn, nhiễm sắc thể thường đột biến gen CYP21A2 gây nên Đối với thể nặng, bệnh khơng chẩn đốn sớm điều trị thích hợp dẫn đến suy thượng thận cấp bệnh nhân tử vong Các thể bệnh khác dẫn đến nam hóa trẻ gái, giả dậy sớm trẻ trai; bệnh ảnh hưởng nặng nề đến phát triển thể chất, chức sinh sản, tâm lý người bệnh gia đình [6] Các đột biến đoạn, lặp đoạn đảo đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 25 - 30%, dạng đột biến gây thể bệnh nặng nên cần phải có biện pháp chẩn đốn xác kịp thời Tuy nhiên, dạng đột biến khó xác định kỹ thuật PCR thông thường Gần đây, kỹ thuật MLPA phương pháp với thời gian tiến hành ngắn, đơn giản độ nhạy cao phát xác dạng đột biến gen CYP21A2 Việc ứng dụng kỹ thuật MLPA chưa khai thác nhiều Việt Nam, đặc biệt việc xác định người lành mang gen gây bệnh di truyền Chính nhằm mục đích giúp quản lý tốt người mang gen cung cấp thơng tin hữu ích cho tư vấn di truyền chẩn đốn trước sinh, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase kỹ thuật MLPA với mục tiêu: Phát người mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 - OH CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21-HYDROXYLASE 1.1 Một số nét khái quát bệnh TSTTBS Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh hay gọi hội chứng sinh dục- thượng thận, bệnh di truyền gen lặn NST thường, thiếu hụt enzym tham gia vào trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận Trong đó, thiếu hụt enzym 21- hydroxylase (21- OH) hay gặp nhất, chiếm tỷ lệ 90 - 95%, tiếp đến thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase (11- OH), 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD), 17α- hydroxylase (17- OH) gặp thiếu hụt 20 - 22 desmolase [35] Tùy theo mức độ thiếu hụt enzym 21- hydroxylase mà lâm sàng biểu mức độ nặng hay nhẹ khác Thiếu hụt hoàn toàn enzym 21- hydroxylase gây bệnh cảnh lâm sàng muối với triệu chứng suy thượng thận cấp cường androgen, thiếu enzym 21- hydroxylase mức độ vừa phải (1 - 3%) biểu triệu chứng nam hóa đơn cường androgen enzym 21hydroxylase giảm nhẹ (20 - 50%) xuất thể bệnh không cổ điển [15] 1.2 Vài nét tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS 1.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS giới Đầu kỷ 19, Emil Huschke, nhà giải phẫu phôi thai học, phân biệt vỏ tủy thượng thận, đồng thời tìm thấy mối liên quan tuyến thượng thận tuyến sinh dục [8] Bệnh nhân TSTTBS thể muối Butler (1939) Wilkins (1940) mô tả Năm 1950 - 1951, Wilkins, Bartter cộng chứng minh việc sử dụng cortisol ức chế tổng hợp thừa androgen hội chứng sinh dục - thượng thận TSTTBS [9] Quy luật di truyền bệnh TSTTBS nhận biết từ năm 1930 mô tả chi tiết Knudson năm 1951, bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm nhiễm sắc thể thường Năm 1977, Dupont thông báo đồ gen liên kết gần TSTTBS phức hợp hịa hợp mơ chủ yếu (MHC) Sau đó, Komainami phân lập Cytochrome P450c21 chuỗi peptid đơn Năm 1982 1983, O’ Neill Fleishwicle phát liên quan gen CYP21 với MHC nhóm III gồm yếu tố B, C2, C4A, C4B [37] Đến nay, nhờ kết hợp phản ứng PCR với số kỹ thuật sinh học phân tử khác giải trình tự gen, hầu hết đột biến gen CYP21 gây bệnh TSTTBS phát [26] 1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS Việt Nam Ở nước ta có nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh TSTTBS Các cơng trình nghiên cứu kể đến như: Năm 2004, Triệu Quốc Khánh nghiên cứu nhận thức bố mẹ bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thấy bệnh ảnh hưởng nặng nề đến tình trạng tâm lý gia đình bệnh nhân [2] Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang nghiên cứu phát triển thể chất số yếu tố ảnh hưởng trẻ TSTTBS điều trị Bệnh viện Nhi Trung ương nhận thấy bệnh gây ảnh hưởng lớn đến phát triển trẻ đặc biệt chiều cao [1] Nhìn chung, Việt Nam nghiên cứu lâm sàng ảnh hưởng tâm lý gia đình bệnh nhân phổ biến, chưa có nhiều nghiên cứu bệnh học phân tử bệnh TSTTBS 1.3 Tần suất mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Tần suất mắc bệnh giới 1/10.000 - 1/15.000 Tỷ lệ mắc bệnh cao hai quần thể người Eskimo Yupik (Alaska) La Réunion (Pháp) với tần suất 1/282 1/2141, tỷ lệ mắc bệnh châu Âu 1/14.000 [28] Tại Việt Nam, hàng năm có từ 50 đến 70 trẻ chẩn đoán mới, chiếm tỷ lệ 60,7% bệnh lý tuyến thượng thận chiếm 2% bệnh lý di truyền vào điều trị khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi TW [17] 1.4 Cơ chế bệnh sinh bệnh TSTTBS Khi thiếu enzym, hay nhiều đường tổng hợp hormon bị tắc nghẽn hormon chỗ tắc không sản xuất đủ, đặc biệt cotisol Cơ chế điều hịa ngược (feed back) kích thích tuyến yên sản xuất tiết ACTH, gây tăng sản tuyến thượng thận, kích thích tế bào chứa melanin tạo hắc tố [26] 1.5 Lâm sàng bệnh TSTTBS Sự thiếu hụt enzym 21- OH dẫn đến thiếu hụt cortisol và/hoặc thiếu hụt aldosteron thừa androgen thượng thận Tùy thuộc vào mức độ thiếu hụt 21- OH mà biểu lâm sàng TSTTBS chia thành thể khác bao gồm: Thể muối; Thể nam hóa đơn thuần; Thể khơng cổ điển CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS 2.1 Cơ sở phân tử bệnh TSTTBS 2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức gen CYP21 Vị trí gen CYP21 Gen CYP21 gồm có CYP21A2 giả gen CYP21A2P, hai nằm bên phức hợp hịa hợp mơ chủ yếu MHC cánh ngắn NST số vùng 6p21.3 Trong vùng này, gen CYP21A2 CYP21A2P nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A C4B mã hóa cho thành phần C4 bổ thể [18], [40] Cấu trúc gen CYP21 Gen mã hóa cho enzym 21- OH vỏ thượng thận gen CYP21A2, có kích thước 30 kb với giả gen không chức (nonfunctional pseudogene), CYP21A2P, nằm cánh ngắn, nhiễm sắc thể số (6p21.3), vùng phức hợp hịa hợp mơ chủ yếu (major histocompatibility complex-MAC) (cạnh gen HLA) Gen CYP21A2 gen tương đồng nó, CYP21A2P, nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A C4B Chức gen CYP21 Gen CYP21 mã hóa cho enzym 21-OH gồm 494 acid amin, có vai trị phiên mã tổng hợp ARNm tiền thân Phân tử trải qua trình cắt intron nối xác exon với tạo phân tử ARNm hoàn chỉnh Phân tử sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21-OH [20] 2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS Hai gen CYP21A2 CYP21A2P có trình tự tương đồng Trình tự gen giả CYP21A2P có loại đột biến thường thấy bệnh nhân TSTTBS Điều giải thích q trình phân bào giảm nhiễm, bắt chéo không đồng cặp nhiễm sắc thể dẫn tới việc trình tự vùng gen giả CYP21A2P chuyển sang CYP21A2 gây nên đột biến gen CYP21A2 Theo thống kê, 95% đột biến gen CYP21A2 chuyển đoạn từ gen giả CYP21A2P, 5% lại gen CYP21A2 bị đột biến Các đột biến thường gặp gen CYP21A2 xóa đoạn chuyển đoạn lớn (Large deletion/convertion), IVS- 13A/C → G, I172N Ngồi cịn có đột biến Q138X, R365W, R473W, P30L, del- bp có tỷ lệ tương đối cao [28] 2.2 Đặc điểm di truyền bệnh TSTTBS TSTTBS thiếu enzym 21- OH bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm NST thường nên tuân theo quy luật di truyền Mendel Bệnh xảy người mang đồng hợp tử gen lặn Aa Aa AA Aa aa (25%) (50%) (25%) Hình 1.4 Quy luật di truyền gen lặn NST thường 2.3 Biểu lâm sàng, cận lâm sàng người mang gen dị hợp tử Về mặt xét nghiệm, người mang gen dị hợp tử chứa đột biến gen CYP21A2 có tăng nhẹ nồng độ 17-OHP, cortisol sau kích thích thượng thận cao người bình thường khơng mang gen [19], [26] 2.4 Phát người lành mang gen bệnh Người mang gen bệnh (dị hợp tử) khó phát khơng biểu tính trạng ngồi Người mang gen bệnh thường có dấu hiệu lâm sàng sinh học nhẹ hồn tồn khơng có dấu hiệu Tuy phát dị hợp tử phương pháp sinh hóa Định lượng 17- OHP cho người thành viên gia đình người bệnh, với 17- OHP < 300 ng/ml bình thường 17- OHP > 300 1499 ng/ml chứng minh dị hợp tử sau nghiệm pháp kích thích corticotropin (Lee HH el al 2000) CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS 3.1 Chẩn đoán lâm sàng cận lâm sàng 3.1.1 Chẩn đoán xác định - Định lượng sản phẩm cuối hormon vỏ thượng thận: Aldosteron, cortisol, testosteron; chất chuyển hóa nước tiểu 17- CS, 17- OHCS, pregnanetriol Các xét nghiệm không đặc hiệu thay đổi nồng độ chất chuyển hóa gặp u tuyến yên u vỏ thượng thận [27], [28] - Định lượng 17- OHP: 17- OHP số đặc trưng để chẩn đoán TSTTBS thiếu enzym 21- OH tăng nồng độ máu tăng nồng độ qua nghiệm pháp ACTH [28] 3.1.2 Chẩn đốn phân biệt - Dậy sớm thật đồng giới, trẻ trai có tinh hồn phát triển với dương vật, thể tích tinh hồn > ml Nồng độ FSH LH tăng cao, khơng có rối loạn hormon khác - Dậy sớm giả khác giới trẻ gái u thượng thận nam hóa (Carcinome) U thường lớn 3- cm Phát u nhờ chẩn đốn hình ảnh 17- CS nước tiểu tăng cao Dehydroepiandosterone (DHEA) huyết tương tăng 17- OHP máu không tăng Khi làm test ức chế dexamethason, nồng độ DHEA huyết tương nồng độ 17- CS niệu khơng giảm, giúp chẩn đốn phân biệt với TSTTBS [28] - U buồng trứng gây nam hóa: Ít gặp, DHEA huyết tương 17- CS niệu không tăng - Buồng trứng đa nang: Nguyên nhân thường gặp tăng tiết androgen buồng trứng, triệu chứng nam hóa gặp Hay gặp triệu chứng rậm lơng, bệnh nhân mập phì, tăng insulin máu, rối loạn dung nạp glucose FSH LH tăng, testosterol tăng ít, andostenedion huyết tương tăng cao [28] 3.2 Các phương pháp sinh học phân tử phát đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS 3.2.1 Kỹ thuật PCR Nguyên tắc PCR dựa vào đặc điểm trình chép DNA Enzym Taq polymerase (DNA ployme chịu nhiệt) dùng đoạn mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung cần phải có mồi oligonucleotid để khởi đầu q trình tổng hợp Mỗi chu kỳ phản ứng gồm giai đoạn khác biệt điều hòa nhiệt độ Giống nhiều bệnh lý di truyền, PCR sử dụng rộng rãi để khuếch đại gen CYP21A2 xác định đột biến xoá đoạn phối hợp với kỹ thuật sinh học phân tử khác để xác định đột biến đặc hiệu Tuy nhiên gen giả CYP21A2P có tính tương đồng cao với gen thật CYP21A2 nên việc khuếch đại gen CYP21A2 khơng dễ thực việc thiết kế mồi phải có trình tự đặc hiệu với gen CYP21A2 mà không đặc hiệu CYP21A2P [22] 3.2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) Đoạn DNA cần giải trình tự sử dụng trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) vị trí gắn mồi Hỗn hợp deoxynucleotid dideoxynucleotid sử dụng phản ứng với nồng độ cho dideoxynucleotid gắn vào vị trí mà deoxynucleotid thường gắn đoạn DNA tổng hợp Sự gắn dideoxynucleotid làm gián đoạn trình kéo dài DNA tổng hợp, kết tạo hỗn hợp sợi DNA có kích thước khác 3.2.3 Kỹ thuật Souther blot Souther blot phương pháp sử dụng rộng rãi để phát đột biến xóa đoạn gen lớn, đột biến lặp đoạn… Đây phương pháp nhiều thời gian công sức lại hiệu 3.2.4 Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification) Nguyên tắc MLPA sử dụng đoạn dò DNA (probe) có khả lai đặc hiệu với phân tử DNA đích Mỗi probe gồm chuỗi oligonucleotid dài ngắn [32] Nghiên cứu sử dụng kit MLPA (MRC- Holland): Kit gồm probe sử dụng chẩn đoán đột biến gen CYP21A2 gọi P050B2 Hỗn hợp probe bao gồm probe cho gen CYP21A2 (Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8) tương đương với đột biến đoạn bp, I172N, E6 cluster Q318X Hỗn hợp probe bao gồm probe đặc hiệu cho gen CYP21A1P (E1P, I2P, E10P), probe cho bổ thể (C4A, C4B) Ngồi ra, có 22 probe đặc trưng cho gen người sử dụng hỗn hợp để làm đối chứng probe cho nhiễm sắc thể X Y để xác định giới tính CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 10 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase chẩn đoán điều trị Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương; thành viên gia đình bệnh nhân bao gồm bố, mẹ, anh, chị, em ruột bệnh nhân 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 2.2.1 Dụng cụ trang thiết bị - Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA) - Máy điện di: Mupid (Nhật Bản) - Máy soi gel chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA) - Máy giải trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ) 2.2.2 Hố chất Hóa chất dùng nghiên cứu sinh học phân tử để tách chiết DNA, điện di DNA cung cấp từ hãng invitrogen) Hóa chất để thực phản ứng MLPA: - SALSA MLPA Kit P050- B2- CAH - Hãng MRC - Holland, Amsterdam, HàLan - Nghiên cứu sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland): Kit gồm Probe sử dụng chẩn đoán đột biến gene CYP21 gọi P050- B2 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu - Đề tài tiến hành Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền Bệnh viện Nhi Trung ương - Các xét nghiệm sinh học phân tử thực Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội - Thời gian nghiên cứu năm: từ tháng năm 2014 đến năm 2015 2.4 Đạo đức nghiên cứu Trước tiến hành thu thập thông tin, mẫu bệnh phẩm phải có đồng ý đối tượng nghiên cứu: Tham gia tự nguyện vào nghiên cứu Các thông tin bệnh nhân gia đình đảm bảo bí mật Nghiên cứu đảm bảo tuân thủ quy định đạo đức nghiên cứu Y- sinh học 2.5 Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu mô tả, cắt ngang 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu 10 bệnh nhân 22 thành viên gia đình bệnh nhân TSTTBS Xây dựng phả hệ Thu thập mẫu máu ngoại vi Tách chiết DNA Kỹ thuật MLPA xác định đột biến xác định người lành mang gen bệnh Phân tích kết Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.5.2 Tiến hành xét nghiệm 2.5.2.1 Quy trình thu thập mẫu nghiên cứu tách chiết DNA Bệnh nhân thành viên gia đình bệnh nhân lấy - ml máu ngoại vi Tách chiết DNA Phenol Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/Chloroform: Bước 1: Phá vỡ hồng cầu 10 Bước 2: Rửa bạch cầu Bước 3: Phá vỡ bạch cầu Bước 4: Loại bỏ protein Bước 5: Tủa DNA thu DNA 2.5.2.5 Kỹ thuật MLPA xác định đột biến xóa đoạn - Tiến hành phản ứng MLPA + Bước 1: Biến tính DNA + Bước 2: Gắn (lai) probe vào gen đích + Bước 3: Nối đầu probe + Bước 4: Khuếch đại sản phẩm lai (probe) Sản phẩm khuếch đại probe điện di mao quản huỳnh quang máy giải trình tự gen để phân tích kết 11 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết tách chiết DNA DNA mẫu máu 10 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh 22 thành viên gia đình sau tách chiết theo quy trình Phenol/ Chloroform/ Isoamyl Alcohol đo nồng độ độ tinh đồng thời điện di đánh giá chất lượng DNA Kết đo mật độ quang Các mẫu DNA kiểm tra nồng độ, độ tinh phương pháp đo mật độ quang học máy Nano-drop Kết đo nồng độ mẫu DNA giao động khoảng 100 - 200 ng/µl độ tinh giao động khoảng 1,8- 2,0 Kết kiểm tra DNA tổng số Song song với việc đo OD để đánh giá chất lượng sản phẩm tách chiết DNA tổng số cịn điện di gel agarose 0,8% P1 P2 P3 P4 P5 T1 T2 T3 T4 T5 Hình 3.1 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số P1-P5: Mẫu bệnh nhân; T1-T5: Mẫu thành viên gia đình bệnh nhân Kết hình 3.2 cho thấy mẫu DNA cho băng sáng rõ nét, không băng phụ, không bị đứt gãy 3.2 Kết phát đột biến gen bệnh nhân phát người lành mang gen bệnh Phân tích phả hệ 10 bệnh nhân bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH, có 22 thành viên 12 gia đình phân tích gen Trong thành viên gia đình, có 10 người mẹ 10 người bố tỷ lệ: 91% Em ruột bệnh nhân có người (tỷ lệ 9%) phân tích gen, đó: em trai: 4,5%, em gái: 4,5% Tiến hành xác định đột biến gen nhóm bệnh nhân kỹ thuật MLPA, kết cho thấy: Đã phát 6/10 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn exon Tiến hành xác định người lành mang gen bệnh nhóm bố, mẹ số thành viên gia đình phát tình trạng mang gen trạng thái dị hợp tử Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS01: Hình 3.3 Phả hệ gia đình số 01 Phả hệ gia đình số hệ, hệ thứ thứ khơng có người bị bệnh Ở hệ thứ 3, trai (III.5), tuổi bị bệnh TSTTBS thể muối Có mang gen đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon đến exon gen CYP21A2 Các anh, chị họ (III.1, III.2, III.3, III.4) bệnh nhân khơng có biểu bệnh Bố (II.6) 27 tuổi mẹ (II.5) 26 tuổi người lành mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon đến exon 13 Người bình thường Ex4 C4B C4A E10P Ex8 Ex1 Ex3 I2P E1P Ex6 Y Bệnh nhân Ex3 Ex4 Y Ex1 Ex6 Ex8 Bố bệnh nhân Ex3 Ex4 Ex1 Y Ex6 Ex8 Mẹ bệnh nhân Ex3 Ex4 Ex1 Ex6 Ex8 Y Hình 3.4 Kết MLPA gia đình mã số 01 Hình ảnh phân tích gen kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy người bình thường xuất đủ đỉnh bệnh nhân không thấy xuất đỉnh tương ứng với exon đến exon, vậy, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn từ exon đến exon 14 Phân tích kết người bố người mẹ bệnh nhân cho thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với người bình thường, chứng tỏ bố, mẹ bệnh nhân người mang gen bệnh Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS02: Hình 3.5 Phả hệ gia đình số 02 Gia đình có gái tuổi bị bệnh TSTTBS thể muối, kiểu gen đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon đến exon Bố mẹ bệnh nhân có kiểu hình bình thường mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon đến exon Trong gia đình khơng mắc bệnh giống bệnh nhân 15 Kiểu gen gia đình số 02 Người bình thường C4B C4A Ex3 Ex4 E10P Ex8 Ex1 Ex6 E1P I2P Y Hình 3.6 Kết MLPA gia đình mã số 02 Hình ảnh phân tích gen kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy người bình thường xuất đủ đỉnh bệnh nhân không thấy xuất đỉnh tương ứng với exon đến exon 3, vậy, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn từ exon đến exon Phân tích kết người bố người mẹ bệnh nhân cho thấy đỉnh exon 1, exon 1/2 so với người bình thường, chứng tỏ bố, mẹ bệnh nhân người mang gen bệnh 16 Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS03: Hình 3.7 Phả hệ gia đình số 03 Phả hệ hệ, hệ thứ thứ khơng có bị bệnh Ở hệ thứ có gia đình có trai tuổi bị bệnh TSTTBS (III.4 ) thể muối kiểu gen đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon đến exon Bố mẹ có kiểu hình bình thường, mẹ mang gen dị hợp tử đột biến xóa đoạn exon đến exon Kiểu gen gia đình số 03 Người bình thường C4B C4A Ex3 Ex4 E10P Ex8 Ex1 Ex6 Y 17 E1P I2P Bệnh nhân Ex3 Ex4 Ex6 Ex1 Y Ex8 Bố bệnh nhân Ex8 Ex4 Ex3 Ex1 Ex6 Y Mẹ bệnh nhân Ex3 Ex8 Ex4 Ex6 Ex1 Y Hình 3.8 Kết MLPA gia đình mã số 03 Hình ảnh phân tích gen kỹ thuật MLPA (hình 3.8) gen CYP21A2 cho thấy người bình thường xuất đủ đỉnh bệnh nhân đỉnh từ exon đến exon 1/2 người bình thường, bệnh nhân có đột biến dị hợp xóa đoạn từ exon đến exon Phân tích kết người bố thấy tất đỉnh gen CYP21A2 bình thường chứng tỏ bố khơng có đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 cịn người mẹ bệnh nhân cho thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với người bình thường, chứng tỏ mẹ bệnh nhân người mang gen bệnh Gia đình có gái tháng bị bệnh TSTTBS thể muối nặng với kiểu gen đột biến dị hợp xóa đoạn exon đến exon Phân tích phả hệ, gia đình khơng có bị bệnh giống bệnh nhân, bố 23 tuổi, mẹ 21 tuổi người bình thường lâm sàng, mẹ mang gen dị hợp tử xóa đoạn exon đến exon 18 Kiểu gen gia đình số 04 Người bình thường C4B C4A Ex3 Ex4 E10P Ex8 Ex1 Ex6 E1P I2P Y Hình 3.10 Kết MLPA gia đình mã số 04 Hình ảnh phân tích gen kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy người bình thường xuất đủ đỉnh bệnh nhân đỉnh từ exon đến exon 1/2 người bình thường, bệnh nhân có đột biến dị hợp xóa đoạn từ exon đến exon 19 Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS05: Hình 3.11 Phả hệ gia đình số 05 Gia đình có gái (III.1) tuổi bị bệnh TSTTBS thể nam hóa đơn thuần, mang đột biến dị hợp tử đoạn từ exon đến exon đột biến dị hợp tử I172N gen CYP21A2 Bố (II.2) 27 tuổi, mẹ (II.4) 25 tuổi Em trai (III.2) hồn tồn bình thường, em gái (III.3) có kiểu gen kiểu hình tương tự bệnh nhân (III.1) Hai em họ (III.2, III.3) biểu bệnh Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS06: Ở hệ thứ có gái 18 tháng, mang đột biến dị hợp xóa đoạn exon đến exon với kiểu hình muối Bố 30 tuổi mẹ 28 tuổi Anh trai tuổi khơng có biểu bệnh Trong phả hệ khơng bị bệnh giống bệnh nhân Hình ảnh phân tích gen kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy người bình thường xuất đủ đỉnh bệnh nhân đỉnh từ exon đến exon 1/2 người bình thường, bệnh nhân có đột biến dị hợp xóa đoạn từ exon đến exon Phân tích kết người bố thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với người bình thường, chứng tỏ bố bệnh nhân người mang gen bệnh, cịn hình ảnh MLPA người mẹ bệnh nhân cho thấy tất đỉnh gen CYP21A2 bình thường, chứng tỏ mẹ khơng có đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 20 KẾT LUẬN Ở nhóm bệnh nhân có đột biến, phát 2/6 bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1- exon 1- bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn kết hợp với đột biến I172N dị hợp tử Các bệnh nhân lại mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 13 dị hợp tử xóa đoạn exon 1- Ở nhóm bố mẹ thành viên gia đình bệnh nhân (em trai, em gái), phát 4/6 người bố mang gen 5/6 người mẹ mang gen, em gái bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- kết hợp với đột biến dị hợp tử I172N 21