DƯỢC LIỆU CHỨA TANNIN

Trình bày • Định nghĩa & Phân loại tannin • Cấu trúc loại tannin • Các tính chất lý hóa tannin • Các phương pháp chiết xuất tannin • Các phương pháp định tính, định lượng tannin • Tác dụng Công dụng tannin • Ba* dược liệu tiêu biểu có tannin (Ngũ bội tử, Măng cụt, Ổi) Định tính Tannin Khái niệm & Định nghĩa tannin Phân loại tannin 6.1 Định tính vật lý 2.1 Theo tính thuộc da (tannin thực & pseudo) 6.2 Định tính hóa học 2.2 Theo cấu trúc hóa học 6.3 Định tính sắc ký 2.3 Theo khả thủy phân* Định lượng Tannin Cấu trúc hóa học 3.1 Tannin pyrogallic 7.1 Phương pháp dùng bột da (TG) 7.2 Phương pháp oxy-hóa (Lowenthal) 3.2 Tannin pyrocatechic (TC) 7.3 Phương pháp dùng Đồng acetat 3.3 Tannin phức hợp 7.4 Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin Tính chất Tannin 7.5 Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu 4.1 Lý tính 7.6 Phương pháp dùng HPLC 4.2 Hóa tính Chiết xuất Tannin Tác dụng & Công dụng Tannin Đến 12/2014: 160 K hợp chất tự nhiên Phenol đơn giản Phenylpropanoid 30 K Flavonoid 18% Alkaloids Lignanoid 45% 42 K 27% Phenolics Tanninoid 72 K Stilbenoid Steroids & Terpenoids Xanthonoid 10% Khác 16 K Quinonoid A Theo E.C Bate-Smith (1962): Tannin • Về nguồn gốc, tannin hợp chất biến dưỡng thứ cấp - hợp chất phenol, MW # 500 − 3.000 đvC thực vật bậc cao, có chất polyphenol - cho phản ứng thông thường phenolic - tạo tủa với alkaloid, gelatin protein khác • Về cấu tạo, tannin B Theo Edwin Haslam (1989): Tannin - ester galloyl (và dẫn chất) với nhiều loại polyol khác - hợp chất polyphenol, MW # 500 – 20.000 đvC (glucose, acid quinic, catechin, ) - cho phản ứng thông thường phenolic - oligomer polymer PAC* (và dẫn chất từ PAC), - tạo tủa với alk., gelatin, protein khác số polysaccharid với liên kết flavanyl (C − C) C Theo Peter Horvath (1981): Tannin - hợp chất polyphenol, MW lớn • Về từ nguyên, tanna = gỗ Sồi (Oak, Fir) tiếng Đức cổ - chứa n × φOH & nhóm thích hợp khác (carboxyl) Tiếng Anh: to tan, tanning (Pháp: tanner) = (sự) thuộc da - tạo phức với protein & nhiều đại phân tử khác đk đặc biệt (Goldbeater's skin test) Có nhiều cách phân loại tannin: 2.1 Theo khả kết hợp với protein (≈ tính thuộc da) → Tannin thực (true) tannin giả (pseudo-tannin; ψT) 2.2 Theo cấu trúc hóa học (≈ cách tổ hợp phân tử) → Tannin pyrogallic (TG) tannin pyrocatechic (TC) 2.3 Theo tính thủy phân (trong tannase acid loãng) → Tannin thủy phân tannin ko thủy phân = Tannin ngưng tụ = condensed tannin 10 Có thể chia “tannin thực” thành nhóm A1 Tannin gallic (= gallo-tannin)* Thường polyester vài mono-, di-, tri-galloyl (hay ∆’ chúng) với 01 phân tử polyol (glucose*, acid quinic ) TG TC A2 Tannin ellagic (= ellagi-tannin)* Thường polyester acid ellagic, luteolic, HHDP (hay ∆’ chúng) với 01 phân tử polyol (glucose*, acid quinic ) B Tannin [pyro]catechic (= tannin ngưng tụ, condensed tannin) = PAC, oligomer, polymer Flavan-3-ol (nối C → C) thường gặp kiểu liên kết (C4 → C8) hay (C4 → C6) C Tannin phức hợp (complex tannin) Là glycosid phức hợp từ nhóm 11 12 Dựa vào tính thủy phân, tannin có loại chính: 3.1 Cấu tạo pseudo-tannin: thuộc da (−) • Tannin thủy phân (gồm gallo-tannin & ellagi-tannin) • Tannin ko thủy phân (= tannin ng tụ, pyrocatechic) 3.2 Cấu ́ tạo tannin thực: thủy phân (tanin pyrogallic) gallo-tannin ( acid gallic)n ellagi-tannin ellagic, luteolic thuộc da (+) 3.2.1 Tannin pyrogallic (TG) = Tannin thủy phân a Gallo-tannin (polyol + ∆’ acid n-gallic) b Ellagi-tannin (polyol + ∆’ acid ellagic) ko thủy phân (tanin pyrocatechic) c hỗn hợp n x catechin (flavan 3-ol; 3,4-diol)n (polyol + acid n-gallic + acid ellagic) 3.2.2 Tannin pyrocatechic (TC): Không thủy phân 3.2.3 Tannin phức hợp: (catechin − polyol − gallic/ellagic) Điều kiện thủy phân: enzym tannase hay acid loãng 13 Tiếng Hy lạp: phloios (φλoιὀς) = vỏ (bark) acid gallic acid m-digallic galloyl digalloyl baphe (βαφή) = chất nhuộm màu (dye) HO HO Hai định nghĩa thông dụng phlobaphen: depsid G1 • Trong hóa thực vật học: HO HO Phlobaphen hợp chất phenol có màu đỏ chiết từ thực vật G2 COOH HO HO + OH/glc O CO HO + OH/glc COOH HO Các hợp chất tan cồn không tan / nước HO HO • Trong công nghệ thuộc da: G3 Phlobaphen sản phẩm có màu đỏ (= đỏ tannin) tạo thành xử lý dịch chiết có tannin với acid vô depsid HO CO HO O HO HO CO COOH O depsid Các hợp chất không tan đươ•c nước + OH/glc HO acid m-trigallic 15 trigalloyl 16 Là polyphenol đơn giản, phân tử (và MW) nhỏ Tính chất: phloroglucinol pyrocatechin • cho ph.ứng chung polyphenol (ph.ứng vòng thơm, HO diazo-hóa, phản ứng -OH tạo phức với Pb2+, Fe3+ ) HO HO HO • không cho phản ứng thuộc da; Chỉ nồng độ cao, pyrogallol OH HO HO chúng tạo tủa với dung dịch protein (khác tannin) HO HO • khả tạo phức với đại phân tử (khác tannin) HO HO HO • Về cấu trúc hóa học, thường gặp chúng dạng: CO HO COOH HO O HO - dẫn chất acid phenol đơn giản HO COOH HO HO acid pyrocatechic - tổ hợp (n-caffeoyl−acid quinic); flavo-lignan - mono dimer, trimer acid gallic acid gallic acid m-digallic HO COOH COOH - mono dimer catechin ∆’-catechin HO 17 acid cinnamic acid hydroxycinnamic acid caffeic HO caf (OH) HO COOH HO OH O HO acid chlorogenic (3-caffeoyl quinic) COOH HO OH COOH HO OH HO OH caf cynarin (1,3-dicaffeoyl quinic) acid quinic O O O caf O OH O CH2OH OMe O OH OR OH (OR) ∆’ flavan-3-ol OH O flavo-lignan (silybin) (OH) H caf O HO OH CO HO HO O HO COOH OH 18 HO COOH HO (≥ trimer xếp vào nhóm PAC/ tannin ngưng tụ) HO COOH HO H HO HO O OH COOH OH (OH) OH OH OH HO acid iso-chlorogenic = (5-caffeoyl quinic) O OH HO O OH OH O OC OH O OH OH OH 19 OH OH dimer-(epi)catechin OH epi-gallocatechin-3-O-gallat G G G a Các gallo-tannin O Vị trí trung tâm glycon ( ) có cấu trúc polyol G O O O O O O G O G G G O G O O G penta-galloyl glucose (PGG*) Mỗi -OH/polyol nối ester với nhóm -COOH G phần acid n-gallic (thường n = → 3) HO O Ngũ bội tử (Galla chinensis), Sồi (Quercus spp.) G O G G O O OH H OH OH hamameli-tannin (∆’-hamamelose) aceri-tannin (2,6-digalloyl-1,5-anhydro-D-glucitol) 21 G O O H G O M = 180 + 10(152) = 1700 O HO Điển hình polygalloyl glucose acid tannic có O O penta-digalloyl glucose (PDGG*) M = 180 + 5(152) = 940 - ∆’ glucitol, hamamelose G Polyol - thường gặp βD-glucopyranose (βD-Glc) - ∆’ acid quinic, acid caffeic, shikimic O G G O 22 b Các ellagi-tannin Là tannin pyrogallic có phần aglycon acid ellagic OH HO OH HO OH OH HO HO COO COO COO HO COO OH G O G O O OC OH O G G OH OOC G OH OH OH acid meta-trigallic HO HO HO 4) O OH G O OH OH 1C G G HO O O O 4 OH 4C G CH2O OH HO CO OH OH O HO HO OH 1C G (G = galloyl) OH HO Vị trí trung tâm thường βD-Glc (4C1 & O O βD-glc HO O OOC hay acid luteolic, hexahydroxy diphenic acid (HHDP) O O G O O O O O G G G G HO Khi aglycon HHDP, ưu tiên nối với glucose dạng 1C4 Nhóm -COOH / acid meta n-gallic nối ester với nhóm -OH / glc Các ellagi tannin thường có M = 2000 → 5000 Các đơn vị acid gallic nối meta với đường nối depsid Ellagitannin có Chiêu liêu (Terminalia chebula), 23 vỏ Lựu, vỏ Sồi (Quercus spp.), Trà 24 • Khi không mở vòng: nhóm -OH (♥) acid ellagic nối với -OH polyol (như glucose…) tạo O-glycosid O O OH (♥) ↑ HO (♥) HO O HO OH OH HO OH O acid ellagic OH HO OH HO OH ( ) G OH COO HO HO ( ) ( ) O O O G COO OH O G O (G = galloyl) HO OH HO HHDP acid luteolic G O COO HO COOH COOH COOH COO OH ↑ OH ↑ HO HO O O OH HO OH OH • Khi mở vòng (→ acid luteolic): tạo nhóm COOH ( ) • Trong phân tử acid ellagic : nối ester kiểu depsid (kém bền nhất) • Khi mở vòng lacton (→ HHDP): tạo nhóm COOH ( ) • Giữa acid ellagic glucose : nối acetal (tạo O-glycosid; bền) Các nhóm -COOH ( ) nối ester với nhóm -OH • Giữa acid monogallic glc : nối ester (tạo ψ-glycosid; bền) polyol (như glucose…), tạo pseudo-glycosid (# ellagi-tannin) • Giữa vòng thơm : nối C − C ( , bền!) 25 (Tham khảo) (Tham khảo) Mỗi ph tử HHDP có nhóm -COOH Chúng có khuynh hướng tạo diester với nhóm -OH/glc gần không gian, ví dụ: G - dạng 4C1-glc → diester (2 + 3), (4 + 6), hay (3 + 4) G - dạng 1C4-glc → diester ơ› (6 + 1), (6 + 3), hay ơ› (2 + 4) HO HO HO (kém bền) O HO OH 4C 1C OH OH OH O G O OH OH O G O G G HO O O O O O G OH O G CH2O O O O O O G G G G Khi thủy phân ellagi-tannin (nước nóng, acid yếu ) thì: • Các liên kết ester HHDP với glucose (kém bền) dễ bị cắt đứt OH • Liên kết C − C ( ) vòng thơm (rất bền) không bị cắt Sản phẩm thủy phân ngừng acid ellagic (ko tới acid gallic!) hai dạng ghế D-glucopyranose Enzym tannase (ví dụ từ môi trường nuối cấy Aspergillus niger) không cắt (thủy phân) nối ester HHDP & glucose 27 • Phần HHDP sau thủy phân nhanh chóng xếp lại cấu trúc (xoay đóng vòng) để tạo acid ellagic (ko tới acid gallic!) 28 Phần aglycon vừa có acid gallic, vừa có acid ellagic / luteolic / HHDP Còn gọi tannin catechic (TC), tannin ngưng tụ (condensed tannin), hay proanthocyanidin (PAC), phlobatanin (ít dùng) OH HO OH OH OH HHDP HO HO HO CO O CO O glucose G OH HO O O O O CO CO OC OH COOH G OH HHDP HO COOH HO HO acid gallic OH G COOH Là tổ hợp nhiều đơn vị [flavan-3(4)-ol] nhờ liên kết (C−C) bền ( ) G COOH PAC thẳng ( OH OH nối 4/6) HHDP (OH) G OH G HO OH HO nối 4/8) tạo nhánh ( O extension OH (OH) OH OH OH OH HO n • Gallic mono, di, tri-galloyl OH OH (OH) OH OH • Ellagic ellagyl, luteolyl, HHDP-yl • Có thể có liên kết đơn vị gallic & ellagic gần O HO O 29 terminal OH OH 30 OH Lưu ý: Tuy monomer, epigallocatechin-gallat (EGCG), epicatechin-gallat (ECG) gọi “tannin catechic” / Trà xanh R HO O OH Do mật độ [-OH] cao, chúng có khả tạo tủa với protein R hợp chất đại phân tử khác (polysaccharid ) OH OH OH HO O gallocatechin OH n OH OH R HO HO OH R epi O O HO O gallat gallat OH OH OH OH R OH epi OH catechin OH OH (EGCG) R (ECG) OH OH Với d.dịch FeCl3 loãng, E(G)CG → xanh đen (# tannin gallic!) 31 32 Tham khảo Tham khảo Acid tannic hỗn hợp chủ yếu gồm ester βD-glucose* Tannic acid is a tannin derived from plants and in general prepared from Chinese với acid n-gallic (n = 1, 2, 3) Acid di- hay trigallic tạo nối depsid gall or nut gall Although tannic acid has long been used, its structure has not yet βD-glucose đóng vai trò trung tâm, xung quanh acid n-gallic G6 G4 O G3 O G6 O O O O O O O G2 G4 formula of the principal component of tannic acid is as follows: O G1 Shoji Tomoda (1982), Plant Pharm Chem., p 93, discloses that the structural G1 O G3 been well-defined and hence it varies depending on articles O G2 CH 2O galloyl Acid tannic = poly-galloyl-βD-glucose = C6H12O6 (C7H4O4)5→10 O O MW = 180 + (760→1520) = (940→1700) galloyl Σ.G = → units galloyl O O O galloyl Do khai thác từ nguồn khác nhau, công thức acid tannic có nhiều công bố khác biệt (về giá trị n phần acid n-gallic) Cũng có tài liệu nói đến có mặt acid quinic (thay cho số vị trí glucose) galloyl MW = (1244 → 1548) Da Mm = *1396* Da (galloyl) 3, 4, Tannic acid (theo S Tomoda, 1982) 34 Tham khảo Tác giả mô tả Gn (nối với OH glucosyl) Σ galloyl MW Acid tannic có tổ chức sùi (galls) & cành non 1700 - số loài Sồi, Sến (Quercus infectoria, Q lusitanica ) nhiều (2010s) × digalloyl = (PDGG) = 10 S Tomoda (1982) → galloyl =8±1 Brewster (1948) × digalloyl = (PDGG) = 10 1700 Britton (1966) × galloyl + trigalloyl / G2 =7 1244 E Fisher (1912) × galloyl =5 940 Hagerman (2002) = (PGG) = (22/3) - số loài Muối tạo Ngũ bội tử (Rhus chinensis = R semialata ) *1396* Sản phẩm có thành phần chủ yếu digalloyl βD-glucose Acid tannic có hạt Caesalpinia spinosa Fabaceae Sản phẩm có thành phần chủ yếu digalloyl acid quinic *1294* HO 6 O HO HO OH OH βD-glucose Dung dịch acid tannic 10% / nước có pH = (2,3 ± 0,1) 35 HOOC OH COOH OH OH OH OH acid quinic OH OH OH acid quinic 36 Cấu trúc phức tạp Có thể có polyol (glucose ) 4.1 Lý tính Phần aglycon đa dạng (các ∆’ catechin, ∆’ acid gallic, ellagic ) 4.1.1 Chung TG TC Vd: Các guavin / Ổi, camellia-tannin / Trà, stenophyllanin A / Sồi OH HO 4' G G OH O O O HHDP O G 4.1.3 Riêng TC OH OH O O ∆’ acid caffeic 3' galloyl G catechin O Hax 4.1.2 Riêng TG OH O O OH 4.2 Hóa tính OH 4.2.1 Chung TG TC OH 4.2.2 Riêng TG OH OH 4.2.3 Riêng TC Stenophyllanin A (trong Quercus stenophylla) Cinchonain (trong Cinchona spp.) 37 38 • Độ tan tannin 4.1.1 Lý tính chung loại tannin TG & TC - (epi)-catechin monomer dimer: dễ tan / EtOAc - thường bột vô định hình, màu vàng ngà đến nâu sáng - PAC oligomer: tan / EtOAc - không mùi mùi nhẹ; có vị chát - PAC polymer có MW lớn: khó tan / EtOAc - gây săn se niêm mạc, kích ứng niêm mạc dày • Với dung dịch nước protein (albumin, gelatin ): - MW # 500 → 5.000+ (TG); 900 → 20.000+ (TC) - tạo phức tủa bền → có tính thuộc da - tính chất thay đổi tùy xuất xứ, tùy cách chiết làm da bền, thấm nước, không bị thối rữa - dễ tan / kiềm loãng, cồn-nước, aceton-nước (khả tạo tủa tối ưu pHi protein) - tan được* / EtOAc, glycerin, propylen glycon - không tan / d.môi ph.cực (hexan, EP, Bz, Cf, Et2O) 39 Khi thử nghiệm tính tạo tủa tannin với protein: cần điều chỉnh pH môi trường! 40 6.1.3 Phản ứng với dung dịch gelatin-muối 6.1 Định tính chung 6.1.1 Phản ứng với muối kim loại (không chuyên biệt) - với d.dịch FeCl3 loãng → xanh rêu / / xanh đen - với d.dịch chì acetat → tủa trắng ngà / vàng dd chì acetat tr.tính → (+) với ortho-diphenol, dd chì acetat kiềm → (+) với -OH phenol (chì acetat kiềm mạnh chì acetat trung tính) - loại tannin + d.dịch gelatin-muối → cho tủa (dùng để loại bỏ loại tannin TC + TG khỏi dịch chiết) 6.1.4 Phản ứng thuộc da (Goldbeater’s skin test) - ngâm da sống vào HCl 2%, rửa = H2O - nhúng da vào dung dịch tannin phút, rửa = H2O - + d.dịch FeSO4 loãng → màu nâu, đen (có TG hay TC) 6.1.2 Phản ứng với d.dịch muối alkaloid (quinin ) - dịch tannin + d.dịch muối alkaloid → tủa trắng 6.1.5 Phản ứng với dung dịch Phenazon (ít thông dụng) - d.dịch tannin + Na2HPO4 + Phenazon 2% → tủa màu Nhận diện pseudo-tannin 6.2 Định tính phân biệt (tannin gallic vs tannin catechic) Tính chất TG TC thủy phân không độ tan/nước dễ tan tan kiềm chảy → pyrogallol pyrocatechin + FeCl3 xanh đen xanh * + Stiasny không ↓ vón nặng + nước Brom không ↓ 94 Nhận diện tannin gallic & acid (di)gallic tự Nhận diện catechin tự do, tannin catechic Thường dùng phản ứng gỗ que diêm (có lignin): • Nhúng que diêm gỗ (có lignin) vào d.dịch tannin catechic (TC) • Nhúng tiếp vào d.dịch HCl, hơ nóng kế lửa → màu hồng pink Cơ chế: TC, catechin bị phá vỡ cấu trúc HCl nóng → phloroglucinol phloroglucinol + Lignin (của gỗ que diêm) → màu hồng OH HO HO HO O Gn HO COOH HO CO O HO HO (G2) (G1) OH O OH O O COOH O OH A + lignin màu đỏ hồng OH Gn Gn HO HO + HCl ∆ OH O Gn Gn HO O A 97 98 6.3 Sắc ký tannin (SKLM) Tannin phân cực → khó sắc ký / silica gel NP • Chuẩn bị mẫu: chiết mẫu aceton-H2O, (ROH-H2O), cô Loại chlorophyll & chất béo (thêm nước, lắc với EP, CF, DCM) chebulinic acid chebulagic acid Chiết lấy phần tan EtOAc (mono & oligomer TC ) Có thể hòa AcCN (acid ellagic không tan) • Dung môi khai triển - với PG: Bz – aceton (6:1) - với (PG + PC): Bz – HCOOEt – formic (2:7:1) CF – HCOOEt – formic (1:7:1) Toluen – CF – aceton (1:1:1) • Hiện màu: với PG + PC → phun FeCl3 1% (xanh, xanh đen) với PC → dùng thuốc thử AS (→ đỏ gạch) 100 6.3 Sắc ký tannin (sắc ký phân bố) SKG / SKLM cellulose hay polyamid: thường sắc ký chiều • Dung môi khai triển chiều - hệ 1: s-BuOH-AcOH-H2O (14:1:5) TG t-BuOH-AcOH-H2O (3:1:1) TC - hệ 2: AcOH 6% Nước • Dung môi khai triển chiều - SKG : hệ n-BuOH-AcOH-H2O (4:1:5; ↑) - SKLM cellulose : hệ CHCl3-AcOH-H2O (10:9:1) 101 6.3 Sắc ký tannin (SKLM) 6.5 RP-HPLC tannin Nghiên cứu HPLC tannin PC khó >> tannin PG >> flavonoid Hiện màu mỏng: Phun nhúng thuốc thử hay catechin monomer - FeCl3 loãng, (FeCl3 + Kali Ferricyanid) Đã có nhiều ng.cứu HPLC tannin TG, TC polymer có MW lớn; - (Vanillin + HCl); VS / AS (Vanillin / Anisaldehyd Sulfuric) đến (2016) có công bố cho kết thật tốt - dung dịch bão hòa KIO3 - dung dịch NaNO3 + AcOH (pha 10% / nước đá) Pha tĩnh : Silica gel RP-18, Dung môi: (H2O – MeOH), (H2O − AcCN), (MeOH – AcCN) 6.4 Sắc ký rây phân tử tannin (Sephadex LH-20) Pha tĩnh : Sephadex LH-20, Dung môi: (Me2CO – H2O), (H2O – MeOH), (Me2CO – MeOH) 103 104 acid chebulinic acid chebulagic HPLC tannin pyrogallic Chiêu liêu (Terminalia chebula) 105 106 1: gallic acid Các catechin chuẩn EGCG 2: gallocatechin 3: epigallocatechin 4: catechin epicatechin 5: epicatechin acid gallic gallocatechin 6: EGCG ECG catechin 7: GCG 8: ECG acid ellagic Dịch MeOH (0.5 mg/ml) C2: acid ellagic C1-4: chất 1-4 C.S Buelga, p 107 107 110 • Các tannin polymer có MW lớn, độ trùng hợp cao khó nghiên cứu phổ NMR (kể tannin pyrogallic TG lẫn tannin pyrocatechic TC) • Các oligomer (vài monomer) đỡ phức tạp • Các monomer thường công bố liệu phổ NMR hơn, ví dụ: OH 4’-OH 4’3’-OH 4’3’5’-OH 3β-OH afzelechin catechin gallocatechin 3α-OH epiafzelechin epicatechin epi-gallocatechin OH HO Có thể phân biệt catechin & epicatechin phổ 111 O OH OH OH 13C 1H-NMR nhờ so sánh tín hiệu nhóm oxy-methin (>CHO−) C-2: Tham khảo: Sự khác biệt C-2 catechin & epicatechin (δc2 > 80 ppm: catechin 2R 3S) (δc2 < 80 ppm: epicatechin 2R 3R) OH OH HO O HO OH 82.3 O O OH O OH O OH HO OH O OH 79.3 OH OH OH OH 1H-NMR, H-6 H ax OH HO (2R, 3S) catechin (H-2ax, H-3ax) δC-2 > 80 ppm δH ~ 4.5 d (7-9 Hz) δC-2 < 80 ppm MeOD, 400 MHz catechin 4,52 d (9 Hz) H-8 H-6 H-2 H-2 H-8 H-6 4,74 s MeOH H-6 H2O H-2 4,80 s OH H eq OH (2R, 3R) epicatechin (H-2ax, H-3eq) MeOH H-2 H-8 OH Tham khảo: Tóm tắt khác biệt H-2 C-2 catechin & epicatechin 1H-NMR, 4,55 d (9 Hz) O MeOD, 400 MHz H2O H-8 OH OH OH OH 82.0 O 76.9 OH OH HO HO H ax HO OH HO OH OH 4.8 s OH 83.5 epicatechin 4.5 d HO OH OH catechin H ax OH 79.4 OH HO Tham khảo: Sự khác biệt H-2 catechin & epicatechin epicatechin δH-2 ~ 4.8 s OH H8 HO Có thể dùng phổ 1H-NMR để sơ đánh giá mức độ trùng hợp (mDP) PAC (tannin pyrocatechic, tannin ngưng tụ) O OH OH H6 OH OH HO Nguyên tắc: n • Cường độ tín hiệu proton tỉ lệ với số lượng proton tương ứng O H6 OH OH OH OH HO • H-6 H-8 proton thơm, xuất vùng δ 5,8 – 6,5 ppm • H-4 (là CH2 phần terminal) xuất vùng δ 2,4 – 3,0 ppm O OH H6 OH OH H4 H • Tỉ lệ cường độ tín hiệu [các H-6+8] / [H-4 terminal] (2 + n) + cho ta khái niệm mức độ trùng hợp (độ lớn) PAC • mDP lớn n (và MW) lớn = [H6 + H8] [H4] (n + 2) = × [H6 + H8] [H4] −1 (n + 2) gọi mức độ trùng hợp PAC 117 118 Tham khảo chơi, gặp lại chương trình Sau đại học Thực theo Gelotte (1960) MeOH - Hòa # mg mẫu thử vào ml nước Nạp lên cột Sephadex G-25 - Rửa giải cột nước, tốc độ: 20 phút / phân đoạn ml - Theo dõi cột phương pháp đo Abs UV 280 nm - Ghi nhận thể tích dung môi rửa giải Vi (ml) mẫu thử, - Ước lượng MW mẫu thử dựa vào đồ thị chuẩn log MW = k.Vi terminal chuẩn gồm catechin, rutin, acid tannic (M = 290, 610, 1700) tiến hành điều kiện Phổ 1H-NMR (MeOD, 300 MHz) PAC / rễ Selliguea feei (Trích Ph.D Thesis Fu Cali, 2010, p 65) Ref: M Mallika, S.C Dhar (1980), Studies on the oxidation 119 of tannins by Aspergillus flavus, J Biosci., 2(1), pp 43-48 120 Các nhóm phương pháp chính: A Phương pháp cân C Phương pháp đo màu Kết tủa với bột da * Với thuốc thử Folin Kết tủa với Đồng acetat Với th’.thử Folin-Ciocalteu * B Phương pháp thể tích Phương pháp Löwenthal * Phương pháp Sisley mg mẫu / ml H2O, cột Sephadex G-25, 20 phút / ph.đoạn ml Tannin X (VX = 60 ml; MX ~4600); tannin Y (VY = 85 ml; MY ~1280) D Phương pháp sắc ký Phương pháp dùng HPLC * E Các phương pháp khác 121 7.1 Phương pháp kết tủa với bột da (bột dược liệu qua rây 355) • Nguyên tắc: - chiết kiệt tannin nước sôi - so sánh lượng chất chiết * dịch chiết chưa loại tannin * dịch chiết hết tannin (tủa = bột da) - ∆P lượng tannin cần tìm • Thực hiện: Xem DĐVN IV, PHỤ LỤC 12, trang PL 233 • Sơ đồ → xem slide kế 123 hàm lượng tanninoid = (T1 − T2 + T0) × 10 × (100/a) % 124 • Áp dụng: định lượng (tannin catechic + catechin) Kết hợp phản ứng với bột da, casein (để loại ∑ tannin) phản ứng với TT Stiasny (để tạo tủa) - dịch chiết tannin + TT Stiasny → tủa (P1) (X) - dịch chiết hết tannin + TT Stiasny → tủa (P2) (tannin PC + catechin) → ∆P = (P1 – P2) (X) lượng tannin từ a (g) mẫu, với độ pha loãng = (250/25) = 10 Lượng tannin từ 100 (g) mẫu, không pha loãng → T = X 10 (100/a)% 125 7.2 Phương pháp tủa với đồng acetat (tiếp, tham khảo) 7.2 Phương pháp tủa với đồng acetat (tham khảo) Có thể kết hợp với ph pháp chuẩn độ Iod Na2S2O3 Nguyên tắc : - chiết tannin = nước, loại pectin (nếu có) = cồn - Chiết tannin cồn 60% - tannin + dd Đồng acetat thừa → [Đồng tannat] ↓ - kết tủa tannin lượng thừa đồng acetat - lọc lấy tủa Đồng tannat, sấy cân 126 - lọc bỏ tủa [Đồng tannat] → (P1) - [Đồng acetat thừa / dịch lọc] + [d dịch KI] → Iod - nung tủa Đồng tannat thu CuO → (P2) - chuẩn độ Iod sinh dung dịch Na2S2O3 - lượng tannin mẫu thử = (P1 – P2) 127 128 7.3 Phương pháp Löwenthal (1877) * Thực tập Dược liệu * • Nguyên tắc chung: - Mẫu xay cỡ bột qui định (rây 0,5 mm) - Chiết kiệt tannin / mẫu nước sôi + đun cách thủy - Oxy-hóa tannin / dịch chiết dd KMnO4 0,1 N / H+ - Chỉ thị màu: sulfo-indigo từ blue → green → màu vàng - Làm song song với mẫu trắng (không có mẫu) • Thực hiện: (Tham khảo giáo trình thực tập) • Tính kết quả: ml KMnO4 0,1N # 4,157 mg acid tannic *** Tham khảo [1] Maynard Joslyn (1950), Methods in Food Analysis: Applied to Plant Products, Academic Press Inc., New York, 1950 Ch XIX: Tannins (pp 471-482), [2] D.N Barua, E.A Houghton Robert (1940) X Slide kế [3] AOAC (1980) 129 130 Chỉ thị màu Indigo O SO3H N (dạng oxy-hóa, xanh lá) N HO3S dehydro-indigo carmine O O SO3H NH ( màu đỏ ) NH HO3S indigo carmine O HO SO3H NH NH HO3S leuco-indigo carmine (dạng khử, vàng) OH 131 132 7.5 Ph pháp so màu, dùng th thử Folin-Denis (1915) 7.4a Phương pháp thể tích SISLEY (tham khảo) Thuốc thử Folin (= acid Phospho-Wolframic) - tủa tannin Kẽm acetat Nguyên tắc : Tannin + th.thử Folin → phức xanh - lọc thu tủa kẽm-tannat, hòa tủa / H2SO4 loãng Đo Abs, so với mẫu chuẩn → hàm lượng tannin - chuẩn độ KMnO4 0,1N Chỉ thị Carmin Indigo (tính quy tannin chuẩn, thường acid gallic/tannic) Phương pháp không đặc hiệu (polyphenol toàn phần) Có thể so với mẫu loại bỏ tannin gelatin: 7.4b Phương pháp thể tích JEAN cải tiến (tham khảo) - mẫu tannin + lượng xác Iod • dịch thử + th.thử → phức màu (đo A) → P1 - chuẩn độ lượng Iod thừa dung dịch Na2S2O3 • dịch loại tanin + th.thử → phức màu (đo A) → P2 Lượng tannin P = (P1 – P2) - Làm song song với mẫu trắng g Iod # 1,37 g acid tannic 133 134 7.6 Phương pháp so màu, dùng th thử Folin-Ciocalteu (FCR) Chuẩn bị (1) Thuốc thử Folin-Ciocalteu N (FCR): • Nguyên tắc: tạo màu với th’.thử phospho-molybdo-tungstic Pha loãng gấp đôi (từ lọ FCR N, Merck) với nước cất - Polyphenol + FCR → màu xanh (λmax 760* nm) Bảo quản chai nâu °C - Lập đường cong chuẩn dãy d dịch acid gallic + FCR Thuốc thử màu vàng: OK, có ánh màu xanh: hư - Dựa vào đường cong chuẩn, xác định hàm lượng phenol (2) Dung dịch Na2CO3 (20% nước cất) * d dịch mẫu chưa loại tannin = (P1) (3) Insoluble polyvinyl polypyrrolidone (PVPP, Sigma) * d dịch mẫu loại tannin casein = (P2) (4) D.dịch chuẩn acid tannic (0.1 mg/ml H2O): Dùng loại pha - Hàm lượng taninoid toàn phần = (P1 − P2) Thiết lập đường cong chuẩn (Với dãy dd acid tannic TA, xem bảng & đồ thị slides sau) • Thực : DĐVN IV, PHỤ LỤC 12, trang PL 234 135 136 Thiết lập đường chuẩn (theo acid tannic, TA) Bảng số liệu đường chuẩn (FCR method) (Để định lượng polyphenol nói chung) Ống TA (0,1 mg/ml) (ml) H2O (ml) FCR (ml) Na2CO3 20% (ml) Abs (ở 725 nm) TA (µg) chứng 0,00 0,50 0,25 1,25 0,000 0,02 0,48 0,25 1,25 0,112 2 0,04 0,46 0,25 1,25 0,218 0,06 0,44 0,25 1,25 0,327 0,08 0,42 0,25 1,25 0,432 0,10 0,40 0,25 1,25 0,538 10 0,538 0,432 0,348 0,218 0,327 0,112 6,4 mg acid tannic 137 Xác định x% phenol toàn phần (nội suy) 138 Polyphenols react with Folin-Ciocalteu reagent (FCR) to form a blue complex that can be quantified by visible-light spectrophotometry Pha mẫu đo: Nên 0,02 − 0,05 − 0,10 ml dịch chiết The reaction forms a blue chromophore constituted by a phosphotungstic and phosphomolybdic complex, where the max absorption of the chromophores depends on the alkaline solution and the concentration of phenolic compounds Sau tuần tự: • (+ nước vđ 0,5 ml) (+ 0,25 ml FCR) (+ 1,25 ml Na2CO3) • Lắc đều, để yên 30 phút đo Abs 725 nm • Nội suy lượng phenol toàn phần từ đường chuẩn (theo acid tannic) • Kết ghi theo x% dược liệu trừ độ ẩm This reagent rapidly decomposes in alkaline solutions, which makes it necessary to use an enormous excess of the reagent to obtain a complete reaction This excess can result in precipitates and high turbidity, making the analysis impossible To solve this problem, FCR included Lithium salts, which prevented the turbidity The reaction generally provides accurate and specific data for several groups of phenolic compounds, because many compounds change color differently due to differences in unit mass and reaction kinetics Ví dụ: Dùng 0,05 ml dịch thử # 1,00 mg dược liệu Đo Abs = 0,348 Many studies have discussed the use of the FCR to determine polyphenols, and the general or specific value of the method, because some specific details may be modified Nội suy từ đường chuẩn: Abs 0,348 tương ứng # 6,4 µg acid tannic Vậy ml dịch thử # 100 mg dược liệu # 0,64 mg TA → x0 = 0,64% It is named after Otto Folin, Vintilă Ciocâlteu, and Willey Glover Denis Nếu dược liệu có độ ẩm 10% kết x = 0,64 / 0,90 = 0,71% 139 140 Total phenolic content (TPC / FCR) FCR = (Phosphotungstic + Phosphomolybdic + Li+ salt) Phenolics + FCR / basic → Blue complex (λmax ~780* nm) 0.50 mL extract + 3.0 mL H2O + 0.25 mL FCR Immediately, add 0.75 mL of satd Na2CO3 + 0.95 mL H2O Incubate 37 ºC x 30 min., read Abs at 765 nm Compared to a standard curve (gallic acid solution) The TPC was expressed as mg of gallic acid equivalents per gram of fresh weight (mg GAE / g FW) 141 142 Tannin phổ biến / thực vật bậc cao (cả Ngành Hạt kín & Hạt trần) Trong cây, thường gặp chủ yếu loại tannin (catechic >> gallic) Trong Ngành Hạt kín, tannin có Lớp (Lớp Hai & Lớp Một mầm) Một số lại chứa loại tannin (lá Bàng, Ổi, Đại hoàng ) A Lớp Hai mầm (đã gặp # 180 họ có chứa tannin), đáng ý: Có thể gặp tannin nhiều phận Aceraceae, Actinidiaceae, Anacardiaceae, Bixaceae, • rễ, rễ củ (Đại hoàng, Hà thủ ô đỏ ) Burseraceae, Combretaceae, Ericaceae, Fabaceae, • thân (Keo Wattle = Acacia spp., Dẻ Chestnut = Castanea spp ) Fagaceae, Dipterocarpaceae, Myricaceae, Myrtaceae • vỏ thân (Chiêu liêu, Quebracho, Hemlock Tsuga spp., Sồi, Đước ) Khoảng 5% thuộc họ Solanaceae, Asteraceae có chứa tannin Hàm lượng tannin thường • (Chè xanh, Bàng, Bạch đàn, Ổi, Sim, Mua ) • (Chiêu liêu, Cau, Dẻ, Lựu, Măng cụt, Ổi ) - không cao họ Boraginaceae, Cucurbitaceae, Papaveraceae • hạt (Ca cao, Cau, Keo Wattle Acacia spp., Nho ) - cao hạch (Sồi), hạch cành (Ngũ bội tử ) • hạch nutgalls (Sồi Quercus spp ), B Lớp Một mầm (đã gặp # 44 họ có chứa tannin) đáng ý: • hạch cành galls (Muối, Ngũ bội tử Rhus semialata ) Họ Najadaceae & Họ Typhaceae 143 144 Tannin khai thác từ nguồn thực vật tự nhiên Các lĩnh vực tiêu thụ nhiều tannin: Sản lượng toàn cầu hàng năm: # 200.000 tannin (A Pizzi, 2003) - Thuộc da: # 60% (tannin chiếm #30% P da thuộc) Trong số này, 90% tannin catechic - Làm keo dán gỗ (ván ép), dán plastic; làm mực, Đáng ý từ nguồn: - Khoan mỏ, đánh bóng & chống ăn mòn kim loại A Gỗ Mẻ rìu Quebracho (Schinopsis balansae, S lorentzii) - Làm rượu bia & nước ép trái cây, chủ yếu sản xuất từ Argentina, Brazil - Gây đông kết cao su B Vỏ Keo Wattle (Acacia mearnsii): chủ yếu từ Nam Phi, Brazil C Gỗ Dẻ Chestnut (Castanea spp.): từ Trung quốc, Châu Âu D Quả Chiêu liêu (Terminalia chebula): từ Ấn Độ, Châu Âu Tannin dễ phân hủy thành phenol đơn giản bền, E Vỏ Thông (Pinus maritima, Pháp; P radiata, Úc & New Zealand), gây ô nhiễm môi trường: - acid hóa & gây hại với vi sinh vật / đất, làm đất bạc màu, vỏ số loài Hemlock (Tsuga spp.) 145 - làm sậm màu nguồn nước (và da sinh vật chỗ) - tạo màng / niêm mạc → bôi làm thuốc săn da (dạng tannoform = tannin + formol) - trị phỏng, vết rắn***, côn trùng cắn - kháng khuẩn → trị loét (miệng, da; + acid picric loãng) - cầm máu (đắp lên vết thương, xịt vào búi trĩ hậu môn) - trị ngộ độc alkaloid, kim loại nặng (+ KMnO4 làm ddịch súc ruột) - trị viêm ruột, trị tiêu chảy (tannat albumin, tannat gelatin) Học kỹ : Ngũ bội tử - antioxidant (EGCG / Chè xanh), ngừa bệnh mạch vành (rượu Nho) Đọc thêm : Ổi, Măng cụt - trị sỏi thận (Quercus stenophylla → Urocalun®, Nhật, từ 1969) However, to-date, neither the FDA nor the EFSA (European Food Safety Authority) have approved any health claim for bioflavonoids or approved them as pharmaceutical drugs (FDA, Nov 2013) 147 146 149 150 Nutgalls / Sồi (Quercus infectoria, Fagaceae) 151 152 [...]... 4 Kết tủa tannin bằng (NH4)2SO4 82 Không có 1 quy trình chung để chiết xuất các tannin từ mọi dược liệu Tuy nhiên, có thể dựa vào sơ đồ chung như sau: 5 Các phương pháp loại bỏ tannin khác Có thể kết tủa tannin bằng dung dịch PVPP ở pH ~ 3 - Chiết tannin = nước nóng, MeOH/EtOH-nước, aceton-nước - Cô thu hồi bớt dung môi - Kết tủa tannin với d dịch ammoni sulfat bão hòa, lọc lấy tủa - Chiết tannin từ... với bột da (bột dược liệu qua rây 355) • Nguyên tắc: - chiết kiệt tannin bằng nước sôi - so sánh lượng chất chiết được của * dịch chiết chưa loại tannin * dịch chiết đã hết tannin (tủa = bột da) - ∆P chính là lượng tannin cần tìm • Thực hiện: Xem DĐVN IV, PHỤ LỤC 12, trang PL 233 • Sơ đồ → xem slide kế 123 hàm lượng tanninoid = (T1 − T2 + T0) × 10 × (100/a) % 124 • Áp dụng: định lượng (tannin catechic... weight (mg GAE / g FW) 141 142 Tannin khá phổ biến / thực vật bậc cao (cả Ngành Hạt kín & Hạt trần) Trong cây, thường gặp chủ yếu là 1 loại tannin (catechic >> gallic) Trong Ngành Hạt kín, tannin có ở cả 2 Lớp (Lớp Hai & Lớp Một lá mầm) Một số cây lại chứa cả 2 loại tannin này (lá Bàng, lá Ổi, Đại hoàng ) A Lớp Hai lá mầm (đã gặp # 180 họ có chứa tannin) , đáng chú ý: Có thể gặp tannin trong nhiều bộ phận... dụng) - d.dịch tannin + Na2HPO4 + Phenazon 2% → tủa màu Nhận diện các pseudo -tannin 6.2 Định tính phân biệt (tannin gallic vs tannin catechic) Tính chất TG TC thủy phân được không độ tan/nước dễ tan kém tan kiềm chảy → pyrogallol pyrocatechin + FeCl3 xanh đen xanh lá * + Stiasny không ↓ vón nặng + nước Brom không ↓ 94 Nhận diện tannin gallic & acid (di)gallic tự do Nhận diện catechin tự do, tannin catechic... Riêng của tannin catechic (TC) Gn O O Gn O 4.2.b Ph.ứng v O Gn C Riêng của tannin gallic (TG) 4.2.a Ph.ứng v O O Gn 4.2.c Ph.ứng v 4.2.d Ph.ứng v 49 4.2.1 Phản ứng của polyphenol /tannin với protein protein protein NH polyphenol OH O C NH R OH O C R OH O tannin R C NH protein 51 52 4.2.2 Phản ứng kiềm phân • Phức tủa [protein − tannin] sẽ dễ hình thành khi môi trường Với kiềm đặc và nóng, tannin →... (tannin catechic + catechin) Kết hợp phản ứng với bột da, casein (để loại ∑ tannin) và phản ứng với TT Stiasny (để tạo tủa) - dịch chiết còn tannin + TT Stiasny → tủa (P1) (X) - dịch chiết hết tannin + TT Stiasny → tủa (P2) (tannin PC + catechin) → ∆P = (P1 – P2) (X) là lượng tannin từ a (g) mẫu, với độ pha loãng = (250/25) = 10 Lượng tannin từ 100 (g) mẫu, không pha loãng → T = X 10 (100/a)% 125 7.2 Phương... lọc lấy dịch aceton, cô thu hồi aceton → cắn tannin thô - rửa cắn tannin thô với Et2O → tannin tinh khiết hơn 83 84 Trên thực tế, hay sử dụng ammonium sulfat dưới dạng phân hóa học SA (phân muối diêm), dạng rắn, để kết tủa tannin HPLC 85 86 1 (PAC) 87 88 2 3 89 90 91 92 Trên thực tế, rất ít khi phân lập 1 tannin tinh khiết (acid tannic) Rất khó phân lập tannin thành từng cấu tử tinh khiết riêng biệt,... theo 1 số cách sau Trong nghiên cứu, việc chiết xuất / phân lập tannin nhằm mục đích: A Loại bỏ tannin như 1 tạp phân cực 1 Kết tủa tannin bằng dung dịch protein (gelatin, BSA ) Phương pháp: Kết tủa tannin với protein, muối kim loại, NH4SO4 Cho dd protein vào dịch chiết giàu nước, khuấy đều, đun nóng, B Thu được dịch chiết / phân đoạn giàu tannin (hỗn hợp) và dễ dàng được tách khỏi dịch chiết Phương... chiết tannin = nước, loại pectin (nếu có) = cồn - Chiết tannin bằng cồn 60% - tannin + dd Đồng acetat thừa → [Đồng tannat] ↓ - kết tủa tannin bằng một lượng thừa đồng acetat - lọc lấy tủa Đồng tannat, sấy và cân 126 - lọc bỏ tủa [Đồng tannat] → (P1) - [Đồng acetat thừa / dịch lọc] + [d dịch KI] → Iod - nung tủa Đồng tannat sẽ thu được CuO → (P2) - chuẩn độ Iod mới sinh bằng dung dịch Na2S2O3 - lượng tannin. .. Phospho-Wolframic) - tủa tannin bằng Kẽm acetat Nguyên tắc : Tannin + th.thử Folin → phức xanh - lọc thu tủa kẽm-tannat, hòa tủa / H2SO4 loãng Đo Abs, so với mẫu chuẩn → hàm lượng tannin - chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N Chỉ thị Carmin Indigo (tính quy về một tannin chuẩn, thường là acid gallic/tannic) Phương pháp không đặc hiệu (polyphenol toàn phần) Có thể so với 1 mẫu đã loại bỏ tannin bằng gelatin: 7.4b ... phân, tannin có loại chính: 3.1 Cấu tạo pseudo -tannin: thuộc da (−) • Tannin thủy phân (gồm gallo -tannin & ellagi -tannin) • Tannin ko thủy phân (= tannin ng tụ, pyrocatechic) 3.2 Cấu ́ tạo tannin. .. (trong tannase acid loãng) → Tannin thủy phân tannin ko thủy phân = Tannin ngưng tụ = condensed tannin 10 Có thể chia tannin thực” thành nhóm A1 Tannin gallic (= gallo -tannin) * Thường polyester... loại tannin: 2.1 Theo khả kết hợp với protein (≈ tính thuộc da) → Tannin thực (true) tannin giả (pseudo -tannin; ψT) 2.2 Theo cấu trúc hóa học (≈ cách tổ hợp phân tử) → Tannin pyrogallic (TG) tannin