Dược liệu đại cương phần 1

• Định nghĩa, phân loại saponin • Các tính chất (lý, hóa) saponin • Các phương pháp chiết xuất, phân lập saponin • Các phương pháp định tính, định lượng saponin • Tác dụng & Công dụng saponin • Các dược liệu* chứa saponin đáng ý Khái niệm - Định nghĩa Chiết xuất Cấu trúc - Phân loại Phân lập - Tinh chế Lý tính Định tính Hóa tính Định lượng Phân bố / tự nhiên Tác dụng - Công dụng • Từ xưa, người biết sử dụng số thực vật để tắm gội, • Khi dùng nói để tắm giặt, người ta nhận thấy chúng giặt giũ… chúng có tính tạo bọt, tẩy rửa làm chết cá, ốc, đỉa… số động vật thân mềm khác (nên chúng dùng để thuốc cá *; khác Derris elliptica!) • Nhiều loài sử dụng mục đích giặt tẩy: - soapbark: Quillaja saponaria họ Quillajaceae • Hiện nay, nhiều tài liệu công nhận Gmelin (1819) người - soapwort: Saponaria officinalis họ Caryophyllaceae khai sinh thuật ngữ “saponin” sử dụng - soapberry: Sapindus saponaria họ Sapindaceae - soapnut: Sapindus mukurossi họ Sapindaceae • Vài tài liệu khác lại cho thuật ngữ “saponin” sử dụng bởi: P.A Bucholz, từ 1811 (theo Bernard, 1949) - soaproot: Chlorogalum pomeridianum Asparagaceae Grothus, từ 1815 (theo Kichter, 1939) Saponin xuất phát từ “sapo” = soap, savon vừa nói lên tính chất, vừa nói lên xuất xứ thực vật nhóm hợp chất tự nhiên (ban đầu, chiết từ chi Saponaria hay từ loài Q saponaria) Tham khảo Ludwig Kofler (1927), Die Saponine, p (slide sau) • Ludwig Kofler (1927): Xuất “Die Saponine” tổng quan • Ph.ứng màu: (Salkowski, 1872; Liebermann, 1885; Burchard, 1889) hệ thống lịch sử nghiên cứu, tính chất lý hóa, sinh học… • Phản ứng tạo phức Digitonin + Cholesterol: (Windaus, 1909) phân bố, xuất xứ nhiều saponin thực vật • Phân loại saponin theo tính acid-kiềm: (Robert, 1917) • Chiết saponin với n-BuOH bão hòa nước: (M.E Wall, 1952) • Rosenthaler (1939): Saponin chất có tính tạo bọt bền dung dịch nước, có cấu tạo glucosid (hay ∆’ glucuronid) polyterpen hay cholan (tức sterol) Từ 1975 – nay: Rất nhiều tiến sản xuất dược liệu, chiết xuất, phân lập, • Bernard (1949): Saponin heterosid, có chất keo kiểm nghiệm, nghiên cứu cấu trúc, tác dụng sinh học… (colloidal), tan có tính tạo bọt nước saponin từ thực vật hải sinh vật Chúng có mùi hăng nồng, vị đắng, gây hắt hơi, gây phá huyết Đối tượng nghiên cứu đặc biệt: Panax spp Araliaceae 10 Tuy nhiên, nhiều saponin kinh điển (/ Đậu nành, Cam thảo, Nhân sâm, Tam thất…) lại ko thể đầy đủ tính chất này; 1.1 Quan niệm truyền thống: Saponin glycosid tự nhiên (gặp chủ yếu thực vật, số từ động vật) có tính: tính phá huyết & tính tạo phức với cholesterol… • Làm giảm sức căng bề mặt dung dịch • Tạo bọt nhiều, bền lắc với nước 1.2 Quan niệm nay: Saponin glycosid có MW lớn • Làm vỡ hồng cầu (phá huyết) nồng độ thấp triterpenoid hay steroid (Kurt Hostettmann, 1995) • Độc cá & loài thân mềm (giun, sán, ốc…) • Kích ứng niêm mạc (gây hắt hơi, đỏ mắt…) Lưu ý: • Tạo phức với cholesterol & ∆’ 3β-OH-steroid • Như vậy, glycosid trợ tim thuộc nhóm saponin • Các sapogenin, không glycosid, xếp vào “nhóm saponin” 11 Robert, 1917: Phân loại saponin → saponin acid, trung tính, kiềm - Đại đa số: Hiện nay: phân loại theo khung aglycon = sapogenin = genin O-glycosid (thường gặp 3β-OH → ose) Ít gặp hơn: ψ-glycosid (thường gặp 28β-COOH → ose) - Sap steroid: thường mono-desmosid (1 mạch đường) Saponin triterpenoid: có 1, mạch đường - Mạch đường (desmos) thẳng phân nhánh Mỗi mạch đường 1-5; đôi khi: hàng chục đường đơn - Các hexose, pentose hay gặp cấu tạo saponosid: * hexose: * pentose: βD-Glc (và ∆’ GlcA) βD-Fuc (6-desoxy) βD-Gal (và ∆’ GalA) αL-Rha (6-desoxy) βD-Xyl (f, p) αL-Ara (fura/pyranose) 13 βD-glucose βD-galactose glucuronic acid O O OH HO OH CH2OH COOH HO HO OH Me HO • Fucose (Fuc) Rhamnose (Rha) 6-deoxy ose O HO • Khi CH2OH → COOH: ose → acid glycuronic (GlcA…) OH OH Me OH HO OH • βD-Gal: Chỉ nhóm 4-OH định hướng axial (ax) O OH HO OH βD-fucose αL-rhamnose O HO • Xylose (Xyl) Arabinose (Ara) pentose OH OH OH HO HO • βD-Glc: Mọi nhóm định hướng equatorial (eq) 6 CH2OH * • βD-Fuc OH βD-xylose OH O O OH 14 HO OH • αL-Ara(p) # βD-Gal (nhưng nhóm CH2OH cuối mạch) OH αL-arabinose (f) O * HO OH # βD-Gal (nhưng Oxy C-6: CH2OH → CH3) OH • βD-Xyl(p) # βD-Glc (nhưng nhóm CH2OH cuối mạch) OH αL-arabinose (p) 15 16 Tần suất gặp Ose / Sap Oleanan 25 thực vật gặp (theo Vincken 2007, Phytochemistry 68) 2.1.1 Saponin triterpenoid vòng (only C/D: cis) a Phân nhóm Oleanan ** d Phân nhóm Hopan b Phân nhóm Ursan * e Ph nhóm taraxasteran c Phân nhóm Lupan f Phân nhóm khác 2.1.2 Saponin triterpenoid vòng (all: trans) a Phân nhóm Dammaran * (Me: 10β + 8β) b Phân nhóm Lanostan (Me: 10β + 13β) c Phân nhóm Cucurbitan (Me: 9β + 13β) d Phân nhóm Tirucallan (Me: 10β + 13α) 17 18 2.1.1 Saponin triterpenoid vòng Gồm (6) đơn vị isopren; nối chủ yếu theo kiểu “đầu → đuôi” 29 30 20 19 12 11 25 28 16 15 27 23 đuôi E 22 14 10 đầu 21 29 17 26 α 30 E 18 13 29 β 30 24 đuôi đuôi Khung Oleanan Khung Ursan Khung Taraxasteran Khung Lupan Khung Hopan All = nhóm methyl 29 đầu 30 20 19 12 11 25 vòng: all trans 23 19 19 12 22 25 16 26 24 23 30 21 17 22 29 15 27 20 16 10 E 28 15 18 13 11 28 14 10 21 E 17 26 vòng: only C/D: cis 18 13 27 24 20 30 29 19 19 21 20 20 21 29 12 12 25 28 13 18 12 22 17 26 25 COOH 13 27 17 COOH 28 11 25 Oleanan → β-amyrin Ursan → α-amyrin 23 → acid oleanolic hederagenin → acid ursolic acid quinovic 29 28 23 E Lupeol → R = CH2OH: Betulin → R = H: 16 15 20 C 27 30 ← Khung Lupan 22 17 14 10 21 18 26 CH2OH 24 20 13 23 19 12 16 HO 24 30 27 29 22 15 16 HO 18 26 28 15 HO 30 29 24 D R 28 A B HO R = COOH: acid Betulinic → All = nhóm methyl 29 29 30 30 12 12 25 25 COOH HO 13 19 19 12 22 17 15 16 21 20 18 26 28 27 3 12 22 17 15 21 20 18 26 28 HO 13 30 19 23 24 Diplopten → 22 29 15 27 23 23 16 10 27 17 ←Khung Hopan 30 21 28 COOH 26 HO 24 25 COOH 28 16 20 18 13 11 24 21 22 • Trong vòng A, B, C, D, E: vòng E cạnh hay cạnh • vòng A-D: có nhóm Me (lưu ý: gem-dimethyl vòng A) • E cạnh: thêm nhóm Me (geminal: Oleanan, vicinal: Ursan) • E cạnh: thêm nhóm Me / isopropyl (↑: Lupan; ↓: Hopan) • Tổng cộng: 30 C (trong có nhóm Me; ≠ sap steroid) 30 29 29 30 20 30 29 20 20 E E 19 21 E 19 20 E 22 21 29 22 30 Oleanan ( singlet x 3H) 23 Ursan (2 doublet x 3H) Lupan (1 doublet 6H) Hopan (1 doublet 6H) 24 2.1.2a Khung dammaran 2.1.2 Saponin triterpenoid vòng OH 21 22 21 24 20 26 23 22 21 8C 25 24 20 26 23 OH 20 13 14 14 10 10 30 29 dammaran (10β + 8β) HO 29 28 29 14 (17 + 5) C 30 28 17 18 19 27 16 11 27 15 29 panaxadiol (artefact) tirucallan (10β + 13α) 26 24 20 O Oses 14 10 28 panaxatriol (artefact) All = nhóm methyl 2.1.2b Khung Lanostan (10-Me) 25 30 O 28 29 29 R Các mạch đường nối O-glycosid vớ1 nhóm OH C-3, 6, 20 22 20 24 18 12 23 13 19 O 25 O • Khung có sẵn nhóm Me; có gem-dimethyl / vòng A (→ 22 C) O HO 27 16 • Vòng D thêm nhánh C; có nhóm Me (→ 30 C) R 15 • Tổng cộng: 30 C (trong có nhóm Me; khác hẳn sap steroid) 10 30 28 (Σ → 17 C) 26 17 11 26 Holothurin (R = H hay OH) • Trong vòng A, B, C, D: vòng D cạnh 21 OH Rg1, Rg2, Re, Rf… 30 ginsenosid 14 10 30 22 Rb1, Rb2, Rc, Rd… 13 13 23 20 ginsenosid 25 27 27 15 21 12 26 23 28 16 24 25 OH 22 21 26 24 22 protopanaxatriol (genuin) 27 lanostan (10β + 13β) HO 28 14 30 17 18 19 protopanaxadiol (genuin) cucurbitan (9β + 13β) 20 12 11 27 13 OH 12 25 OH 21 26 24 22 Oses • Từ Lanostan → phân nhóm khác vị trí gắn nhóm Me: O 29 All = nhóm methyl O 22 21 18 20 24 25 oses 23 11 O 26 H 19 29 2.1.2c Khung Cucurbitan (9-Me) 22 20 24 25 23 OH OAc 27 26 16 19 30 OH 11 H HO 28 18 16 21 27 30 O 28 29 Cucurbitacin B (in Cucurbitaceae) 27 28 2.2.1 Phân nhóm spirostan 2.2.1 Phân nhóm Spirostan (chủ yếu, phổ biến) O 21 2.2.2 Phân nhóm Furostan (dễ biến thành Spirostan) 18 25 26 22 27 23 20 8C O 24 20 18 22 O 17 19 12 19 25 26 O 21 17 23 27 24 O (17 + 2) C Nhận xét khung saponin steroid: HO • Vòng (A): gem-dimethyl C-4 (≠ sap triterpenoid) HO Diosgenin (All = nhóm Me) Hecogenin - khung sap steroid có # nhóm methyl - khung sap triterpenoid có tới # nhóm methyl Rất dễ phân biệt phổ 13C-NMR Là nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp thuốc steroid (CPD, DEPT) Hai genin đáng ý: diosgenin / Dioscorea & hecogenin / Agave • Saponin steroid đa số có mạch đường (monodesmosid); Khi chiết xuất, nhóm Me-27α dễ chuyển thành Me-27β sap triterpenoid đến mạch đường (tridesmosid) (và hecogenin, tigogenin, gitogenin → neohecogenin ) (phổ IR khác) 29 30 2.2.2 Phân nhóm Furostan Ít gặp Spirostan Furostan dễ đóng vòng thành Spirostan All = nhóm methyl δc ~110 ppm 2.3.1 Phân nhóm Spirosolan: Tương tự Spirostan, vòng (F): O → NH 27 27 HO OH 21 26 23 O 21 H 22 20 25 25 26 H 22 23 20 24 O 2.3.2 Phân nhóm Solanidan 24 O 2.3.3 Phân nhóm amino-furostan: δc ~100 ppm Tương tư“ Furostan, 3-OH → 3-NH2 HO HO 2.3.4 Phân nhóm Polypodo-saponin Khung Furostan Khung Spirostan 2.3.5 Phân nhóm Osladin 2.3.6 Phân nhóm α-Spinasteroid Tín hiệu phổ 13C-CPD C-22 / đặc biệt: Furostan: δC ~ 110 ppm; Spirostan: δC ~ 100 ppm 31 32 2.3.1 Phân nhóm Spirosolan (MW lẻ!) 21 20 22 NH 21 26 18 22 23 NH 24 25 O 27 24 19 19 26 14 20 18 25 O 2.3.3 Phân nhóm Amino-Furostan 23 27 14 HO HO H H Solasonin Tomatin All = nhóm methyl 2.3.4 Các phân nhóm Alkaloid-Steroid khác 2.3.2 Phân nhóm Solanidan (MW lẻ!) 21 20 22 23 18 N 19 13 17 24 25 26 27 10 Oses O Solanin 33 Thường từ tên khoa học (tên Chi, tên loài) mẫu Aglycon thường có vĩ ngữ “genin”: diosgenin (= EU, USA) Glycosid thường có vĩ ngữ “osid”: ginsenosid (EU, USA: oside) Tên thông thường: Theo EU, USA Theo DĐVN IV • saponin: e cuối • saponin: e cuối • alkaloid: có e cuối* • alkaloid: e cuối Genin: Smilagenin, Diosgenin, Hederagenin, Gypsogenin… 34 Ginsenosid protopanaxadiol (Σ đường đơn) Ra1, Ra2, Ra3 Rb1, Rb2, Rb3, Rc Rs1, Rs2 Rd Rg3 Rh2 Re Rf, Rg1, Rg2 Rh1 Ro Glycosid: Panaxosid, Ginsenosid, Asiaticosid, Polysciacosid Senegin, Mollugocin, Glycyrrhizin, Cucurbitacin… protopanaxatriol (Σ đường đơn) Khung Oleanan với ose mạch Ginsenosid Rễ củ (Radix) Lá (Folium) = R F 35 36 3.1 Cảm quan • Nói chung, saponosid thường trạng thái bột vô định hình, Nhóm I (rất phân cực) Nhóm II (kém phân cực) Nhóm III (phân cực tr bình) Nhóm IV (rất phân cực) không màu, mùi hăng, đ số: vị đắng nhẫn đến đắng (*) n-heptan, n-hexan CHCl3, CH2Cl2 EtOAc n-BuOH Petrol Ether (PE) Et2O i-ProOH CCl4 Aceton EtOH, MeOH Benzen, Toluen AcCN H2O • Các sapogenin dạng tinh thể (thường hình kim) Một số “glycosid trợ tim” (cũng saponin!) dễ dạng tinh thể 3.2 Độ phân cực tính tan • Saponosid phân cực sapogenin tương ứng acid Độ phân cực tăng theo độ dài & số lượng mạch đường • Càng phân cực (như sapogenin): dễ tan / dung môi • PE hỗn hợp gồm a% n-pentan (C5H12, đs 36oC) phân cực → phân cực trung bình (CHCl3, DCM, EtOAc…) b% n-hexan (C6H14, đs 69oC) • Các saponosid: thường tan / d môi (rất) phân cực • Có loại chính: PE nhẹ (đs 35oC – 45oC) chứa > 70% pentan (Et2O, petrol ether PE, n-hexan, CHCl3, DCM, aceton…) PE nặng (đs 45oC – 60oC) chứa 30-70% pentan • Ở 20oC, PE lẫn ~ 0,01% nước (10–4) Cháy! Nổ! 37 38 Ghi chú: Có nhiều ghi nhận tính phá huyết (TPH) saponin 3.3 Tính tạo bọt (bền môi trường nước) Do có tính lưỡng cực, làm giảm sức căng bề mặt dung dịch, • Tốc độ TPH sap steroid > sap triterpenoid saponin có tính tạo bọt nhiều bền lắc mạnh • TPH monodesmosid > bidesmosid hay tridesmosid Mạch ose nhiều & dài, tính tạo bọt rõ rệt • Trong monodesmosid thì: Tính chất ứng dụng tẩy rửa, làm thuốc long đàm - TPH giảm aglycon có nhiều nhóm phân cực 3.4 Tính phá huyết (ngay nồng độ thấp) - TPH tăng mạch ose dài đến 4-6 đường đơn Nhiều saponin có tính phá huyết mạnh (làm vỡ hồng cầu → - TPH 3-O-Glc > 3-O-GlcA (glycyrrhin có TPH kém) không đưa saponin vào mạch máu, nguy gây tan máu) • Chưa thấy liên hệ TPH // tính tạo phức với cholesterol Tuy nhiên, số saponin lại thể tính chất không rõ • Riêng tỉ lệ khối lượng [aglycon / ose]: 3.5 Tính kích ứng niêm mạc nhiều báo cáo lại có ghi nhận ngược tăng / giảm TPH Nhiều saponin có tính kích ứng niêm mạc (làm đỏ mắt, chảy nước mắt; gây hắt mạnh; vd bột Bồ kết…) 39 (Ref: SM Hassan, 2008, Ph.D Thesis, pp 30-32) 40 O 25(S) H O Benzen – EtOAc (1 : 1) neo-tigogenin HO O 21 O 25S H 22 20 O 12 neo-hecogenin HO O 25(S) H O Σ nT nH nG Σ HO neogitogenin HO 105 7b2 Dùng Chì acetat (Lấy tủa phức chì - saponin) 7b1 Dùng Chì acetat (loại bỏ tủa phức chì - polyphenol) ( + H2S → PbS↓ ) 109 7b3 Dùng bột Cholesterol (theo Walter, 1954) 110 7b4 Dùng bột hấp phụ Khi saponin bị lẫn nhiều tạp phân cực (nhất tannin) tinh chế saponin theo cách sau • Hòa tan mẫu [sap + tannin] vào lượng tối thiểu* nước nóng • Tẩm dịch nước đậm đặc vào lượng vừa đủ* bột hấp phụ (bột Kieselguhr = Celite; bột polyamid hay bột Mg oxyt) • Chiết saponin khỏi matrix EtOH 70-80% nóng Lọc dịch chiết cô thu hồi cồn thu cắn saponin (sạch hơn) • Do phân cực saponin nên tannin không bị giải hấp khỏi matrix 111 112 7b6 Tinh chế kỹ thuật sắc ký 7b5 Phương pháp thẩm tích (qua màng bán thấm, MBT) A Dùng cột hấp phụ (ví dụ VLC qua Si-gel NP) Dòng nước chảy liên tục Thường dùng cột VLC* (d lớn, h < 20 cm) Pha tĩnh: Si-gel NP (cỡ hạt vừa = 40-63 thô = 63-200 µm) Mẫu thử: Dạng bột khô / Si-gel, P mẫu # 1/10 P Si-gel MBT Hệ dung môi sử dụng: có độ phân cực tăng dần *** Thể tích phân đoạn: nhiều [V (ml) # P Si-gel (gam)] Saponin lẫn tạp có phân tử nhỏ Các phân đoạn đầu chứa tạp phân cực (bỏ) Các phân đoạn chứa sapogenin saponosid (thu) Các phân đoạn cuối (hoặc phần bị giữ lại cột) chứa tạp có phân tử nhỏ bị rửa trôi tạp phân cực (tannin, polysaccharid, muối, đường tự do…) Kiểm tra vết: SKLM / UV 254 th’ thử AS, VS hay H2SO4 10% 113 114 7b6 Tinh chế kỹ thuật sắc ký 7b6 Tinh chế kỹ thuật sắc ký B Dùng cột rây phân tử (Sephadex LH-20* G-25) C Dùng cột phân bố đảo (Diaion HP-20*) Dùng để loại bỏ tạp chất có MW khác xa* MW sap Mục đích: Chọn phân đoạn (hỗn hợp) có độ ph cực thích hợp Thường dùng cột có d hẹp (< cm); h dài (~ 100 cm) Thường dùng cột có d lớn (~ cm), h tr bình (50-60 cm) Pha tĩnh: Sephadex LH-20* (dạng hỗn dịch / MeOH) Pha tĩnh: Diaion HP-20* (Mitsubishi), hỗn dịch / nước or MeOH Mẫu thử hòa MeOH (V mẫu # 1/20 V Sephadex) Mẫu thử: hòa tan (hay hỗn dịch) / nước MeOH-nước Khai triển với MeOH* (thông dụng nhất) hay (H2O + MeOH) Khai triển [H2O – MeOH] (với MeOH% tăng dần) Các hợp chất có MW lớn trước, MW nhỏ sau • Các hợp chất phân cực (ose, muối, PS, tannin) trước Kiểm tra vết SKLM / UV 254 th’ thử VS, AS, H2SO4 10% • Các glycosid phân cực → glycosid ph cực → genin sau • Các hợp chất phân cực sau (hoặc bị giữ lại cột) Sephadex LH-20 đắt tiền (> 30 triệu VNĐ / 100 gam) 115 Kiểm tra vết: SKLM / UV 254 hay thuốc thử AS, VS, H2SO4 10% 116 7b6 Tinh chế kỹ thuật sắc ký D Dùng SKLM chế hóa (SK lớp dày / Silica gel NP) 8.1 Định tính tạo bọt (trong ống nghiệm) Xác định số bọt (CSB) Lớp Si-gel có diện tích lớn; bề dày – vài mm; 8.2 Định tính phá huyết (lam, thạch máu, ống nghiệm) Mẫu (chỉ vài chục mg) hòa / MeOH, chấm thành băng liên tục Xác định số phá huyết Khai triển với hệ dung môi thích hợp* 8.3 Định tính tạo phức với cholesterol Phát vết: UV 254*, thuốc thử (chú ý kỹ thuật) 8.4 Định tính phản ứng màu Cạo vết si-gel, chiết lại MeOH (hay MeOH-Cf) ống nghiệm (Salkowski, Liebermann-Burchard) Lọc loại bỏ phần Si-gel (không tan), thu dịch lọc hòa tan vết mỏng (thuốc thử AS, VS, VP hay H2SO4 ) Bay dung môi, thu cắn/tủa… 8.5 Định tính SKLM 117 118 119 120 A Nguyên tắc chung • Vì protein, polysaccharid tạo bọt saponin → chiết cồn 70% (ko chiết = nước, tránh dương tính giả) • Vì cồn phá bọt → cần loại bỏ cồn dịch thử nghiệm (tránh âm tính giả) B Thực (thống theo quy định chung, xem thực tập) • 0,5 g mẫu + 10 ml cồn 70%, đun cách thủy phút • Lọc nóng qua bông, cô đến hết cồn (thu dịch nước) • Cho 0,5 ml dịch cô vào tube (size 16) có sẵn 10 ml nước • Nút tube, lắc mạnh dọc tube (đúng 30 lần / 60 giây) • Đánh giá: bọt bền 15’ (+); bền 30’ (++); bền 60’ (+++) Chỉ số bọt (CSB) số ml nước để hòa tan saponin có gam nguyên liệu (= độ pha loãng*), cho cột bọt cao cm sau lắc * n ml dịch A + nước vừa đủ 10 ml (độ pha loãng = 1/C = 1000/n) Tiến hành thực nghiệm điều kiện quy định • cỡ bột nguyên liệu: 0,5 mm • 10 tube (1.6 x 16) cm • + 100 ml nước sôi * • chứa → 10 ml dịch A • đun sôi nhẹ lần = 30 phút • thêm nước vừa đủ 10 ml • Lọc nóng (giấy, bông), để nguội • Lắc dọc 15 sec = 30 lần * • + nước vừa đủ 100 ml (dịch A) • Đo h (cm) cột bọt sau 15’ 1‰ 2‰ 3‰ 4‰ 5‰ 6‰ 7‰ 8‰ 9‰ 10‰ 1000 500 333 250 200 167 143 125 111 100 121 A Nguyên tắc chung cột bọt ống số = 0,8 cm cột bọt ống số = 1,3 cm • Khi mẫu thử tính phá huyết hoàn toàn d dịch cột bọt ống số 4,4 = 1,0 cm đẳng trương, (một số) hồng cầu nguyên trạng, lắng xuống (cặn màu đỏ) sau thời gian định Trên lý thuyết: Thực lại 10 ống từ 4.1 đến 5.0 Thực tế: Nội suy • Khi mẫu thử có tính phá huyết hoàn toàn, tất hồng cầu bị phá hủy màng, hemoglobin thoát nhuộm hồng dung dịch 123 đẳng trương (không có hồng cầu lắng xuống đáy tube) 124 A Nguyên tắc chung (tt) B Các kỹ thuật chung • Để tránh nhầm lẫn nhận định kết (do fibrin lắng Có thể thử nghiệm tính phá huyết cách quan sát xuống đáy tube), máu thử nghiệm cần phải loại bỏ hết fibrin - Quá trình phá huyết lame (qua kính hiển vi) Môi trường thử nghiệm phải môi trường đẳng trương - Sự khuếch tán hemoglobin + hồng cầu lắng đọng (tube) (thường dùng dung dịch muối sinh lý suốt thử nghiệm) - Vòng phá huyết dĩa thạch máu (pétri) • Máu thử nghiệm quy định tùy tài liệu, nên chọn Căn vào đường kính vòng phá huyết (dĩa thạch máu); máu động vật mà màng hồng cầu dễ bị phá hủy (nhạy) nồng độ tối thiểu dịch thử gây nên phá huyết hoàn toàn* Thường chọn máu cừu, thỏ, bò & động vật có sừng (/ tube) → khái niệm định lượng tính phá huyết (saponin • Sau loại fibrin, pha máu thành dịch treo 2%, bảo quản mát trong) dịch thử nghiệm (có thể thêm chất chống đông…) 125 * ống phá huyết “đầu tiên hoàn toàn” 126 C Tiến hành (xem phần thực hành, lưu ý khác biệt) • Chỉ số bọt (CSB) Là độ pha loãng cần thiết gam dược liệu để tạo lớp bọt cao cm sau ngưng lắc 15 phút, tiến hành điều kiện quy định • Chỉ số phá huyết (CSPH) Là số mililit dung dịch đệm cần thiết để hòa tan saponin có gam dược liệu gây phá huyết hoàn toàn loại máu chọn, tiến hành điều kiện quy định CSB: dịch thử + dung môi CSPH: dịch thử + dung môi + dịch máu 127 không phá huyết hoàn toàn phá huyết hoàn toàn khác “phá huyết không hoàn toàn” dung dịch veo! 128 (thực dãy ống nghiệm nhỏ) • Phản ứng Salkowski (1872) • Phản ứng Liebermann-Burchard (1889) *** • Phản ứng Carr-Price (1926); Rosenthaler (1905) • Với thuốc thử (trên SKLM) * [C] thấp / ống phá huyết 129 Mẫu/CHCl3 + vài giọt H2SO4 đđ 130 Ban đầu, dùng để định tính cholesterol (Є steroid) nâu đỏ, tím, tím sậm • Phản ứng Liebermann (1885, chưa dùng CHCl3): (Steroid / Ac2O) + H2SO4 đđ → màu xanh / đỏ Ban đầu, phản ứng dùng để định tính cholesterol Với saponin nói chung, màu sản phẩm phản ứng không • Phản ứng L-B (1889; dùng CHCl3 + Ac2O): thực rõ ràng (ngay thực với kỹ thuật dùng nhiều (Steroid / CHCl3.Ac2O) + H2SO4 đđ → dd màu xanh acid, nhỏ dọc thành tube… thực mẫu cholesterol tinh khiết) Ac2O dùng để làm khan môi trường để pha loãng H2SO4 Hiện nay, phản ứng Liebermann-Burchard (L-B) thông dụng Có thể thay Ac2O AcOH glacial, EtOAc, hay BuOH (khan) hữu hiệu (xem phần sau) Cơ chế phản ứng: có nhiều đề nghị, chưa rõ ràng (2007) 131 Kỹ thuật thực hiện: dùng ít/nhiều H2SO4; xem slides phía sau 132 Một nhận định tham khảo Các phản ứng Salkowski L-B nghiên cứu nhiều Theo Schoenheimer & Sperry (1934); Brieskorn & Capuano (1953): Cơ chế phản ứng Màu sản phẩm thay đổi theo tỉ lệ k = [H2SO4 / Ac2O] • Khi k lớn (ít Ac2O) → a red-purple color (ph ứng Salkowski) • Khi k bé (nhiều Ac2O) → a green color (phản ứng L-B) Ac2O có vai trò làm khan môi trường, pha loãng H2SO4 thay dung môi khan khác AcOH, EtOAc, n-BuOH • Hệ thống phải thật khô Khi thực hiện: cấm cầm tay • Cho dư Ac2O + Lắc kỹ Nhỏ acid trôi xuôi theo thành tube • Rất ý rửa ống nghiệm (Coi chừng mắt)! 133 134 8.3c Phản ứng Carr – Price • Khi ph pháp phổ (NMR…) sơ khai, ph ứng màu saponin (và HCTN) có nhiều ứng dụng định tính, định danh tính chuyên biệt không thực thuyết phục 8.3d Phản ứng Rosenthaler • Hiện nay, phản ứng màu saponin (& HCTN) có vai trò khiêm tốn việc nhận định & phân biệt sơ mà • Để định tính, định danh mẫu; nay, ph pháp phân tích dụng cụ (HPLC-RI, LC-ELSD, LC-MS…) ph pháp phổ học (MS, NMR) ứng dụng nhiều với xác cao 135 136 8.4a SKLM (TLC) SKLM hiệu cao (HP-TLC) 8.4b HPLC, UPLC (ghép với detector khác nhau; **LC-det.) Rất thường sử dụng nhằm nhiều mục đích Là công cụ hữu hiệu, đa năng, đáng tin cậy phổ biến • So sánh mẫu đa thành phần (dược liệu thử // dl chuẩn…) Khi ghép nối với detector khác nhau, tính chúng • So sánh hợp chất tinh khiết riêng biệt (đồng Y/N) thêm phong phú Các ứng dụng chủ yếu: • Xác định có mặt Y/N chất hỗn hợp Kiểm nghiệm (định tính, định lượng, định danh…) mẫu • Theo dõi trình phản ứng (tổng hợp, thủy phân,…) Các chi tiết tham khảo học phần riêng biệt • Theo dõi trình khai triển SKC Riêng với saponin, cần ý detector ghép với hệ thống • Sơ kiểm tinh khiết Có thể bán định lượng (**LC-det.) phải phù hợp với cấu trúc chromophore • Định danh nhóm vết (nhở th’ thử chuyên biệt…) • Thử nghiệm sinh học (sàng lọc vết sắc ký đồ) Thường dùng detector RI, ELSD, PDA (vùng cận 205 nm), MS 137 Trong số này, MS detector hữu hiệu (LC-MS)… 138 9.1 Phương pháp cân 9.2 Phương pháp acid – base 9.3 Phương pháp so màu 9.4 Phương pháp phổ UV-Vis 9.5 Phương pháp SKLM (TLC & HP-TLC) 9.6 Phương pháp HPLC-detector (LC-RI, LC-UV, LC-PDA, LC-ELSD, LC-MS…) 139 140 Phương pháp cân thực hòa tan (chiết được) kết tủa, kết tinh hoàn toàn & riêng biệt đối tượng thử Rất khó thực yêu cầu Sai số thường lớn đến lớn Ví dụ: • Không thể kết tủa hoàn toàn glycyrrhizin (từ Cam thảo) / mt acid (mọi pH); lại kết tủa số chất glycyrrhizin • Không thể chiết hoàn toàn ginsenosid (từ dịch nước Nhân sâm) “n-BuOH bhòa nước” lại chiết số chất khác, ginsenosid (sai số dư ? thiếu ?) 141 Định lượng pp cân nên áp dụng số trường hợp * Ví dụ: Định lượng [tri, di, mono ammonium] glycyrrhizat: Chỉ áp dụng với mẫu có tính acid (hoặc base) rõ rệt Chuyển ammonium glycyrrhizat → acid glycyrrhizic HCHO Tính acid / base mạnh thuận lợi Chuẩn độ acid glycyrrhizic tạo thành d dịch NaOH 0,1 N Nếu tính base yếu (pKa nhỏ, ví dụ < 2): môi trường khan! Sai số cao có nhiều tạp chất acid (hoặc base) khác Dung dịch định lượng thường có màu sậm, khó quan sát điểm tương đương nhờ thị màu (CH2)6N4 acid glycyrrhizic (C42H62O16 = 822) ml NaOH 0,1 N # 27,4 mg acid glycyrrhizic (= glycyrrhizin) Kết định lượng quy # glycyrrhizin 143 144 Một ví dụ: Định lượng genin triterpenoid vòng ph pháp Áp dụng định luật Lambert-Beer, so sánh độ hấp thu dd thử quang phổ UV (đo 310 nm) sản phẩm chúng với H2SO4 đđ với dd đối chiếu biết nồng độ (trong vùng tuyến tính) Căn vào độ hấp thu (Abs), so sánh với dd chuẩn thích hợp, suy hàm lượng sapogenin mẫu thử 145 146 Nhắc lại Sự tắt quang (quenching) vết mỏng F254 So sánh vết định lượng với 1/các vết chuẩn (đã biết lượng chấm) (Khi quan sát đèn UV 254 nm) • diện tích vết / UV (không có có thuốc thử) • cường độ màu (sau + thuốc thử màu) vết che khuất sáng (tạo nên tắt quang) Có thể sử dụng mỏng thường hay hiệu cao (HP-TLC) Thường kết hợp HP-TLC với máy & phần mềm chuyên dụng (ví dụ máy Camag TLC Scanner 3; S/w winCATS tương tự) silica gel + chất phát huỳnh quang F Kết thực tế sai số lớn (chỉ chấp nhận (sáng rực UV 254 nm) giải pháp bán định lượng, định lượng sơ mà thôi) 147 148 SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO (HP-TLC) Xử lý thuốc thử, soi Vis SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO (HP-TLC) Không xử lý thuốc thử, soi UV 365 nm 149 150 QuantiScan 151 152 JustTLC Analysis winCATS / TLC Scanner (CAMAG) 153 154 155 156 HPLC-ELSD (7 ref ginsenosides vs a Panax Product) hỗn hợp chất chuẩn hỗn hợp chất chuẩn / Panax mẫu thử nghiệm (có đủ chuẩn) mẫu dược liệu thử nghiệm 157 158 UPLC-ELSD (11 Std ginsenosides vs Panax notoginseng) Rb1 Rg1 noto-R1 159 Rd Re Rg2 160 10.5 Tác dụng lên mô sẹo Saponin & dược liệu chứa saponin có nhiều công dụng Asiaticosid / Rau má 10.1 Tác dụng long đờm, trị ho 10.6 Tác dụng diệt loài nhuyễn thể Thiên môn, Mạch môn, Cam thảo, Viễn chí, Cát cánh Dùng để diệt nhiều loài ốc (ký chủ trung gian Sán máng) 10.2 Tác dụng bổ dưỡng, tăng lực 10.7 Tác dụng bảo vệ thành mạch (# vit P, Flavonoid) Điển hình ginsenosid & dược liệu họ Araliaceae Ruscogenin / Ruscus aculeatus (Proctolog®) 10.8 Tác dụng kiểu hormon sinh dục, Σ steroid 10.3 Tác dụng làm tăng tính thấm Diosgenin, Dioscin, Hecogenin & saponin / Bạch tật lê, Mía dò… Digitonin / Digitalis Nhiều saponin dùng làm tá dược kỹ thuật điều chế vaccin 10.9 Tác dụng bảo vệ gan 10.4 Tác dụng kháng viêm Acid oleanolic, acid ursolic… Glycyrrhizin / Cam thảo; acid oleanolic / Ngưu tất Tham khảo BGDL I, (2011), pp 213-214 161 162 Lịch sử nghiên cứu saponin Tạo phức với cholesterol 81 Khái niệm saponin … 11 Thủy phân saponosid 85 Cấu trúc & Phân loại … 13 Sự phân bố saponin … 89 Saponin triterpenoid 18 Chiết xuất saponin … 93 Saponin steroid 27 Phân lập saponin … 101 Danh pháp saponin 36 7b Tinh chế saponin … 110 Lý tính saponin … 37 Định tính saponin … 119 Phổ UV, IR, MS, NMR 41 CSB, CSPH 120 SKLM 58 Các phản ứng màu 131 HPLC 65 Các pp sắc ký 138 Hóa tính saponin … 163 73 Định lượng saponin … 140 Tác dụng với chì acetat 71 10 Tác dụng & Công dụng … 161 Các phản ứng màu 77 Trang mục lục Phần I 164 164 [...]... Bạch sâm 1, Rg1; 2, Re; 3, Rf; 4, Rh1; 5, Rg2; 6, Rb1; 7, Rc; 8, Rb2; 9, Rb3; 10 , Rd; 11 , Rg3; 12 , Rk1; 13 , Rg5; 14 , Rh2; IS, internal standard (digoxin) S.N Kim et al (2007), J Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, 16 4 17 0 69 S.N Kim et al (2007), J Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, 16 4 17 0 70 Ref: Wagner et als (2 011 ), p.888 S.N Kim et als (2007) Panax ginseng PPD Rb1 PPT Rg1 Re Hồng... 11 , Rh4; 12 , 20(S)-Rg3; 13 , 20(R)-Rg3; Khối phổ (LC-MS), LC-PDA/UV ở < 210 nm 14 , 20(S)-Rs3; 15 , 20(R)-Rs3; 16 , Rk1; 17 , Rg5; 18 , Rs5; 19 , Rs4 Tham khảo trên internet với keywords HPLC, saponin… 65 66 Rb1 Các ginsenosid chuẩn Rc (g1 – e – d – b1 – c – b2) Red Ginseng (g1 – e – d – b1 – c – b2) Rg1 Rb2 Re Rd Black Ginseng Dịch chiết từ Bạch sâm 67 68 S.N Kim et als (2007) S.N Kim et als (2007) 14 ginsenosid... -O-C: ~11 00 và O=C 860 860-866 18 894-905 [2] 25S: [2] < [3] 3* 915 -923 [3] 25R: [2] > [3] 4* 980-987 [4] 27 23 20 24 O 17 19 2* 25 26 22 HO 5 6 • 25S khi 1* < 860 và [2] < [3] • 25R khi 1* > 860... bọt sau 15 ’ 1 2‰ 3‰ 4‰ 5‰ 6‰ 7‰ 8‰ 9‰ 10 ‰ 10 00 500 333 250 200 16 7 14 3 12 5 11 1 10 0 12 1 A Nguyên tắc chung cột bọt ở ống số 4 = 0,8 cm cột bọt ở ống số 5 = 1, 3 cm • Khi mẫu thử không có tính phá huyết hoàn toàn thì trong d dịch cột bọt ở ống số 4,4 = 1, 0 cm đẳng trương, vẫn còn (một số) hồng cầu ở nguyên trạng, và sẽ lắng xuống (cặn màu đỏ) sau 1 thời gian nhất định Trên lý thuyết: Thực hiện lại 10 ống... loãng*), cho cột bọt cao 1 cm sau khi lắc * n ml dịch A + nước vừa đủ 10 ml (độ pha loãng = 1/ C = 10 00/n) Tiến hành thực nghiệm trong các điều kiện quy định • cỡ bột nguyên liệu: 0,5 mm • 10 tube (1. 6 x 16 ) cm • + 10 0 ml nước sôi * • chứa 1 → 10 ml dịch A • đun sôi nhẹ 1 lần = 30 phút • thêm nước vừa đủ 10 ml • Lọc nóng (giấy, bông), để nguội • Lắc dọc 15 sec = 30 lần * • + nước vừa đủ 10 0 ml (dịch A) • Đo... nhúng các thuốc thử sau: AS, VS, VP, H2SO4 10 % hay (NH4HSO4 / H2SO4 15 %) Mẫu thử: Cao EtOAc (đã loại bớt tạp) của hạt Móc mèo Bản Si gel F 254 (Merck) Hiện màu vết = thuốc thử VS 61 TLC các ginsenosid / Panax spp (xem hình sắc ký đồ ở slide sau) 62 HP-TLC các ginsenosid / Panax spp CHCl3–EtOAc–MeOH–H2O (15 :40:22 :10 ; lớp dưới) Rg1 F 11 Rf Rg1 Rg1 Re Re Rb1 Rb1 Re Rb1 Sâm Korea Sâm USA Standards Tam thất... khiết: SKLM, HPLC, so sánh dữ liệu phổ UV, IR… 10 3 10 4 2 O 25(S) H O Benzen – EtOAc (1 : 1) neo-tigogenin HO O 21 O 25S H 22 20 O 12 2 neo-hecogenin HO 3 O 25(S) H O Σ nT nH nG Σ HO neogitogenin HO 10 5 3 4 7b2 Dùng Chì acetat (Lấy tủa phức chì - saponin) 7b1 Dùng Chì acetat (loại bỏ tủa phức chì - polyphenol) ( + H2S → PbS↓ ) 10 9 7b3 Dùng bột Cholesterol (theo Walter, 19 54) 11 0 7b4 Dùng bột hấp phụ Khi... (25S, thực đo, 2005) Hecogenin 19 12 25 26 O 21 O 20 18 23 22 27 24 O 17 HO 45 46 Tham khảo (Học phần Dược liệu 3, năm V) Phổ IR của neohecogenin (thực đo) A Phân tích bộ 5 tín hiệu của C-23 → C-27 (thuộc vòng F) trên phổ 13 C-NMR, có thể phân biệt được 2 đồng phân hecogenin (25 R) & neohecogenin (25 S) band ν (cm 1) [cường độ] [1] 850 42% [2] 895 35% [3] 922 70% [4] 982 63% [1] < 860 [2] < [3] C-23 C-24... băng 1 cm • Bản mỏng Silica gel F254 (Art No 1. 05554, Merck) • Mẫu thử: Ginsenosid Σ của các loài Panax (đã loại tạp), chấm vạch dài 8 -10 mm, dày 1 mm, cách nhau 6-8 mm • Khai triển 1 lần với các hệ dung môi (tham khảo n nguồn): (65:35 :10 ±; lớp dưới) - S1 = CHCl3 - MeOH - H2O - S2 = CHCl3 - MeOH - H2O (CMW) (70:30:4±) (4 :1: 1±) - S3 = n-BuOH - EtOAc - H2O - S4 = CHCl3 - EtOAc - MeOH - H2O (15 :40:22 :10 ;... RP -18 hay RP-8 (cỡ hạt 5 µm, dài 15 - 25 cm) • Pha động: [MeOH – H2O] hay [MeOH – AcCN] (x : y) hay [A: 10 ml 0 .1% H3PO4 / 1 L H2O] + [B: AcCN] • Tốc độ dòng & chương trình dung môi: rất thay đổi • Detector: (A) Mixed standards (C) Red ginseng (B) White ginseng (D) Black ginseng 1, Rg1; 2, Re; 3, Rf; 4, Rb1; 5, Rc; 6, Rb2; 7, Rd; 8, Rg6; Khúc xạ (LC-RI), tán xạ bay hơi (LC-ELSD), 9, F4; 10 , Rk3; 11 , ... 19 12 11 25 vòng: all trans 23 19 19 12 22 25 16 26 24 23 30 21 17 22 29 15 27 20 16 10 E 28 15 18 13 11 28 14 10 21 E 17 26 vòng: only C/D: cis 18 13 27 24 20 30 29 19 19 21 20 20 21 29 12 12 ... 29 29 30 30 12 12 25 25 COOH HO 13 19 19 12 22 17 15 16 21 20 18 26 28 27 3 12 22 17 15 21 20 18 26 28 HO 13 30 19 23 24 Diplopten → 22 29 15 27 23 23 16 10 27 17 ←Khung Hopan 30 21 28 COOH 26... 21 8C 25 24 20 26 23 OH 20 13 14 14 10 10 30 29 dammaran (10 β + 8β) HO 29 28 29 14 (17 + 5) C 30 28 17 18 19 27 16 11 27 15 29 panaxadiol (artefact) tirucallan (10 β + 13 α) 26 24 20 O Oses 14 10