Hệ Thống Quản Lý Chất Lượng Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm Theo GMP Và HACCP

1 Hệ thống quản lý dựa tiêu chuẩn (ISO9000, ISO14000, HACCP phối hợp liên ngành công tác kiểm tra, tra chất lượng, vệ sinh an toàn thực phẩm, HACCP giới thiệu tiêu chuẩn CODEX mang số hiệu CAC/RCP 1-1969, Rev.4-2003, tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam tương đương TCVN 5603:2008 HỆ THỐNG QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM THEO GMP VÀ HACCP I Sự đời ý nghĩa GMP HACCP GMP (Good Manufacturing Practice) đưa nội dung điều kiện thực hành sản suất tốt, nhằm kiểm soát tất yếu tố ảnh hưởng tới an toàn vệ sinh thực phẩm trình chế biến thực phẩm từ thiết kế, xây lắp nhà xưởng, thiết bị, dụng cụ chế biến, điều kiện phục vụ cho công việc chuẩn bị chế biến đến trình chế biến, bao gói, bảo quản người thực thao tác chế biến thực phẩm Những qui định tạo điều kiện cho sở sản xuất thực phẩm xây dựng qui phạm cụ thể phù hợp với điều kiện, qui mô, trình độ công nghệ Các qui định đưa nguyên tắc thực hành vệ sinh chung áp dụng chế biến thực phẩm (bao gồm nuôi trồng thu hái, xử lý, chế biến, đóng gói, lưu giữ, vận chuyển, phân phối bán) cho người để đảm bảo thực phẩm sản xuất an toàn, lành mạnh bổ dưỡng Ngoài nhằm mục đích, dựa sở để xây dựng qui phạm thực hành vệ sinh thực phẩm cho hàng hoá hay nhóm hàng đặc biệt đòi hỏi phải đáp ứng yêu cầu đặc biệt vệ sinh thực phẩm HACCP hình thành vào năm 1960 công ty Pillsbury quân đội Mỹ quan nghiên cứu hàng không Mỹ (NASA) phối hợp tìm cách sản xuất thực phẩm an toàn cho chương trình không gian NASA muốn có chương trình “ hoàn toàn không khuyết tật“ để đảm bảo an toàn cho thực phẩm mà nhà du hành dùng vũ trụ Công ty Pillsbury đề xuất cải biên HACCP thành hệ thống tạo mức an toàn cao song giảm nhẹ hoạt động lấy mẫu thử nghiệm khâu thành phẩm HACCP trọng vào việc kiểm soát công đoạn dùng kỹ thuật giám sát thường xuyên đIểm kiểm soát trọng yếu từ bước trình chế biến Những khái niệm HACCP Pillsbury trình bày công khai hội nghị bảo vệ thực phẩm năm 1971 Năm 1974 nguyên tắc HACCP quan Thực phẩm dược phẩm Mỹ (FDA) thực đầy đủ loại thực phẩm đóng hộp Vào năm 80 phương thức nhiều công ty thực phẩm có tiếng khác triển khai áp dụng Năm 1985, Viện hàn lâm Khoa học Quốc gia Mỹ khuyến cáo để đảm bảo an toàn cho thực phẩm, trình chế biến chúng phải tuân theo yêu cầu hệ thống HACCP Gần nhiều tổ chức Quốc tế Uỷ ban quốc tế thực phẩm( ICMSF), Hiệp hội quốc tế sữa, thực phẩm vệ sinh môi trường (IAMFES) có nhiều khuyến cáo áp dụng HACCP Phương pháp HACCP mang tính hệ thống khoa học, xác định mối nguy hại đặc biệt giải pháp để kiểm soát nhằm đảm bảo tính an toàn cho thực phẩm Nó công cụ để đánh giá mối nguy hại xác lập hệ thống kiểm soát trọng vào việc ngăn ngừa việc thử nghiệm khâu thành phẩm Trong trường hợp, hệ thống HACCP tạo điều kiện cho phát triển công nghệ quy trình chế biến tiến II Nội dung GMP HACCP Các yêu cầu GMP: - Yêu cầu nhà, xưởng phương tiện chế biến: Yêu cầu đỏi hỏi xây dựng sở chế biến thực phẩm cần phải xem xét đến vị trí cho phù hợp với sở chế biến thực phẩm phải thoáng mát, không gây ô nhiễm môi trường, không đặt nơi có môi trường không lành mạnh v.v - Qui định yêu cầu kiểm soát vệ sinh nhà xưởng như: Xử lý nước thải, sản phẩm phụ, bảo quản hoá chất gây hiểm, kiểm soát sinh vật gây hại đồ dùng nhân - Kiểm soát trình chế biến : Kiểm tra tất hoạt động phải thực theo nguyên tắc vệ sinh GMP, phải có biện pháp kiểm soát chất lượng cho điểm kiểm soát quan trọng kiểm soát suốt trình chế biến Thực biện pháp đề phòng sản phẩm bị nhiễm bẩn, thử tiêu vi sinh hoá học, tạp chất khâu cần thiết để xác định nguy gây nhiễm Các sản phẩm bị nhiễm bẩn hay biến chất phải bị loại bỏ xử lý để giảm bớt độc chất - Yêu cầu người: Đối với sở chế biến thực phẩm yêu cầu người tuyển vào làm việc quan trọng Nhất thiết phải kiểm tra sức khỏe ( thể lực, trí lực bệnh tất) tất người , đặc biệt với công nhân tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm để tránh lây bệnh truyền nhiễm Phải đưa qui định việc khám sức khoẻ cho cán công nhân viện khám định kỳ để đảm bảo có người có đủ tiêu chuẩn sức khoẻ tiếp tục làm việc sở sản xuất thực phẩm Phải thường xuyên giáo dục cho cán công nhân viên sở biết giữ gìn sức khoẻ vệ sinh nhân để đảm bảo yêu cầu đề - Kiểm soát khâu bảo quản phân phối: Đưa yêu cầu việc vận chuyến bảo quản cho thành phẩm phải đảm bảo để tránh nhiễm bẩn thực phẩm tác nhân vật lý, hoá học, vi sinh không làm phân huỷ thực phẩm Qua yêu cầu nêu cho thấy, GMP coi hệ thống tiền đề, đề cập đến tất yếu tố tối thiểu có liên quan tới chất lượng vệ sinh chế biến thực phẩm Từ vị trí sở đến cấu trúc phận, từ dây chuyền công nghệ tới môi trường, từ thiết bị, dụng cụ tới người, từ chất phế thải tới sản phẩm trung gian, phụ gia, nguyên vật liệu thành phẩm Xây dựng thành công GMP đảm bảo cho doanh nghiệp chắn có sản phẩm đạt chất lượng cao vệ sinh an toàn thực phẩm III Các yêu cầu hệ thống HACCP: Hệ thống HACCP bao gồm nguyên tắc sau: Nguyên tắc Phải phân tích mối nguy hại: Xác định nguy hạI tiềm nguy hạI có liên qua tạI tất giai đoạn sản xuất thực phẩm; từ khâu sản suất nguyên liệu xử lý, chế biến, phân phối khâu tiêu thụ cuối Đánh giá khả dễ sảy mối nguy hạI xác định giảI pháp để kiểm soát chúng Nguyên tắc 2.Xác định đIểm kiểm soát tới hạn( CCPs ): xác định điểm/ thủ tục / bước thao tác cần kiểm soát để loại bỏ mối nguy hại hạn chế cách khả xảy chúng Thuật ngữ ” Điểm” công đoạn giai đoạn trình chế biến thực phẩm, kể từ khâu chuẩn bị nguyên liệu thô, tiếp nhận hay thu hoạch, vận chuyển, thu gom, bảo quản v.v Nguyên tắc 3: Xác lập ngưỡng tới hạn: Xác lập ngưỡng tới hạn để đảm bảo điểm kiểm soát tới hạn (CCP) tình trạng kiểm soát Nguyên tắc Thiết lập hệ thống giám sát tình trạng kiểm soát ngưỡng tới hạn: Xác lập hệ thống thử nghiệm quan trắc định kỳ để giám sát tình trạng kiểm soát điểm kiểm soát tới hạn (CCP) Nguyên tắc 5: Nêu hoạt động khắc phục cần phải tiến hành việc giám sát cho thấy điểm CCP cụ thể không tình trạng kiểm soát Nguyên tắc 6: Nêu thủ tục để thẩm tra khẳng định hệ thống HACCP tiến triển tốt Nguyên tắc 7: Thiết lập tài liệu liên quan đến thủ tục, báo cáo cho phù hợp với nguyên tắc phù hợp cho việc áp dụng chúng IV Áp dụng GMP HACCP Để áp dụng HACCP thành công cần phải có cam kết tham gia lãnh đạo toàn thể người Nó đòi hỏi tham gia nhiều ngành khoa học ngành Vệ sinh an toàn nông nghiệp, Vệ sinh trồng, hoá học, kỹ thuật xây dựng dân dụng.v.v Việc áp dụng HACCP hoàn toàn tương hợp với việc áp dụng hệ thống quản lý chất lượng khác ISO 9000 ISO 14000 - thân giảI pháp lựa chọn mang tính ưu tiên quản lý an toàn thực phẩm Các chuyên gia chất lượng cho sở chế biến thực phẩm nên áp dụng GMP, HACCP ISO 9000 có thể, ba hệ thống tạo ngôI nhà chất lượng bền vững cho sở Có thể ví GMP tảng, ISO 9000 trụ cột HACCP mài nhà Một cở chế biến thực phẩm có điều kiện áp dụng ba hệ thống chắn sản phẩm họ thắng cạnh tranh thương trường Việc áp dụng HACCP tiến hành theo bước sau đây: Thiết lập nhóm hoạt động HACCP Mô tả sản phẩm Nêu rõ mục đích sử dụng Xây dựng lược đồ tiến trình Thẩm định lược đồ tiến trình tạI trường thực tế trình sản suất Liệt kê tất mối nguy hạI có liên quan tạI bước , tiến hành phân tích chúng cân nhắc biện pháp để kiểm soát mối nguy hại Xác định điểm kiểm soát tới hạn Thiết lập ngưỡng tới hạn cho điểm kiểm soát CCP Thiết lập hệ thống theo dõi giám sát cho điểm kiểm soát Thiết lập hành động khắc phục Thiết lập thủ tục thẩm tra Thiết lập phương thức tài liệu hoá lưu giữ chúng Tất doanh nghiệp ngành muốn áp dụng thành công HACCP phải tuân thủ nguyên tắc vệ sinh thực phẩm GMP Nếu điều kiện sở hạ tầng yêu cầu cấp thiết khâu vệ sinh chưa đảm bảo việc phải giải khâu trước Chính điều mà người ta gọi GMP hệ thống tiền đề, HACCP hệ thống bổ trợ cho sở áp dụng GMP muốn làm tốt Muốn áp dụng HACCP sở bắt buộc phải áp dụng GMP trước Không có GMP có HACCP Khi đánh giá ghi nhận mức độ an toàn thực phẩm cải thiện nhờ áp dụng Hệ thống HACCP ghi nhận vai trò chủ đạo ngành công nghiệp thực phẩm, người ta nhận thấy việc áp dụng HACCP luôn đòi hỏi phong trào cộng đồng đòi hỏi Chính phủ cần có vai trò đạo trình thực HACCP Theo đạo luật gần hội nghị bàn tròn Uruguay thương mại thuế quan (GATT), Hiệp định áp dụng biện pháp vệ sinh an toàn cho trồng động vật (SPS) Hiệp định hàng rào kỹ thuật thương mại, xu áp dụng qui định của Uỷ ban Codex quan tâm Chính tàI liệu Uỷ ban Codex kể " dẫn áp dụng hệ thống HACCP" trở thành nguồn tài liệu tham khảo cho yêu cầu quốc tế an toàn thực phẩm Việc áp dụng HACCP xem phần thiếu tài liệu dẫn Codex Áp dụng phương thức quản lý quốc tế lĩnh vực quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm đạt yêu cầu GMP HACCP giúp doanh nghiệp Việt nam đủ điều kiện để thâm nhập vào thị trường thương mại giới, tham gia Hiệp định Thương mại AFTA Tổ chức Thương mại Thế giới WTO Trong năm gần đây, tình trạng ngộ độc thực phẩm bùng phát mối nguy từ thực phẩm khác “dịch bệnh bò điên”, “bệnh heo tai xanh”, “lở mồm long móng”, dịch H5N1, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật vượt ngưỡng cho phép, sữa, gia vị có chất độc hại… minh chứng cho cần thiết phải có tiêu chuẩn liên quan đến thực phẩm nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng giảm thiểu tác động tiêu cực mặt kinh tế xã hội ISO 22000 gì? ISO 22000 tiêu chuẩn hệ thống quản lý an toàn thực phẩm quốc tế, chấp nhận có giá trị phạm vi toàn cầu Một doanh nghiệp chuỗi cung cấp thực phẩm áp dụng đạt chứng ISO 22000 nhìn nhận đơn vị có hệ thống quản lý tốt an toàn vệ sinh thực phẩm đảm bảo cung cấp sản phẩm thực phẩm an toàn, chất lượng cho người tiêu dùng Tiêu chuẩn ISO 22000 xây dựng đóng góp 187 quốc gia thành viên giới Tiêu chuẩn ISO 22000 ban hành vào ngày 01/09/2005 năm 2007 Việt Nam, thức thừa nhận tiêu chuẩn quốc gia (TCVN ISO 22000:2007) Tiêu chuẩn ISO 22000 tự nguyện áp dụng Tuy nhiên cho dù quy định bắt buộc áp dụng, xu hướng lựa chọn ISO 22000 doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh thực phẩm trở thành phổ biến Mục tiêu giúp doanh nghiệp chế biến, sản xuất thực phẩm kiểm soát mối nguy vật lý (mảnh kim loại, mảnh thủy tinh, gỗ, sạn, cát, tóc…), hóa học (độc tố, kim loại nặng, thuốc bảo vệ thực vật, hóa chất…), sinh học (vi khuẩn, nấm mốc, virus, ký sinh trùng…) từ khâu nuôi trồng, đánh bắt thực phẩm sử dụng người tiêu dùng, nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm Nội dung tiêu chuẩn ISO 22000 Tiêu chuẩn nhằm cung cấp hệ thống quản lý an toàn thực phẩm toàn diện bao gồm yêu cầu: Quản lý tài liệu hồ sơ, cam kết lãnh đạo, quản lý nguồn lực, hoạch định tạo sản phẩm an toàn, kiểm tra xác nhận, xác định nguồn gốc, trao đổi thông tin, cải tiến hệ thống Doanh nghiệp sử dụng nguồn lực bên (nhân viên tổ chức) nguồn lực bên (tư vấn) để đáp ứng yêu cầu Lợi ích áp dụng tiêu chuẩn ISO 22000 Một doanh nghiệp áp dụng tiêu chuẩn quản lý an toàn thực phẩm ISO 22000 nhìn nhận có hệ thống quản lý an toàn thực phẩm đạt tiêu chuẩn quốc tế, tạo lợi cạnh tranh cao, đặc biệt tạo điều kiện dễ dàng cho việc xuất sang thị tường khó tính giới Bên cạnh đó, việc áp dụng ISO 22000 mang lại nhiều lợi ích khác như: - Giảm giá thành sản phẩm giảm chi phí xử lý sản phẩm sai hỏng, chi phí thời gian đánh giá thử nghiệm - Có thể xem xét miễn, giảm kiểm tra có giấy chứng nhận phù hợp tiêu chuẩn ISO 22000 - Đáp ứng quy định pháp luật hành - Có niềm tin khách hàng, người tiêu dùng cộng đồng - Thoả mãn nhu cầu ngày cao người tiêu dùng chất lượng an toàn sản phẩm Doanh nghiệp nên áp dụng ISO 22000? Tiêu chuẩn ISO 22000 áp dụng cho tất loại hình doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh chuỗi cung cấp thực phẩm không phân biệt quy mô, bao gồm: - Sản xuất chế biến thức ăn gia súc - Thực phẩm chức năng: cho người già, trẻ em, người bị bệnh - Doanh nghiệp chế biến rau, củ, quả, thịt trứng sữa, thủy hải sản - Doanh nghiệp sản xuất, chế biến đồ uống: nước ngọt, nước tinh khiết, rượu, bia, cà phê, chè, - Doanh nghiệp sản xuất, chế biến gia vị - Các hãng vận chuyển thực phẩm - Doanh nghiệp sản xuất, chế biến đồ ăn sẵn, nhà hàng - Hệ thống siêu thị, bán buôn, bán lẻ - Doanh nghiệp sản xuất vật liệu bao gói thực phẩm - Trang trại trồng trọt chăn nuôi Các bước triển khai hệ thống quản lý an toàn thực phẩm theo ISO 22000: Bước 1: Tìm hiểu tiêu chuẩn xác định phạm vi áp dụng: Lãnh đạo cần thấu hiểu ý nghĩa ISO 22000 phát triển tổ chức, định hướng hoạt động, xác định mục tiêu điều kiện áp dụng cụ thể Bước 2: Lập nhóm quản lý an toàn thực phẩm Nhóm bao gồm Trưởng nhóm đại diện phận phạm vi áp dụng ISO 22000 Trưởng nhóm an toàn thực phẩm thay mặt lãnh đạo sở sản xuất đạo áp dụng hệ thống theo ISO 22000 chịu trách nhiệm lĩnh vực Bước 3: Ðánh giá thực trạng sở sản xuất thực phẩm so với yêu cầu tiêu chuẩn: Cần rà soát hoạt động, xem xét yêu cầu mức độ đáp ứng sở sản xuất thực phẩm Đánh giá làm tảng để hoạch định nguồn lực cần thay đổi hay bổ sung Bước 4: Huấn luyện, đào tạo cho cấp quản trị nhân viên với chương trình hình thức thích hợp Bước 5: Thiết lập hệ thống tài liệu theo ISO 22000, hệ thống tài liệu xây dựng hoàn chỉnh để đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn yêu cầu điều hành sở sản xuất thực phẩm bao gồm: Chính sách an toàn thực phẩm, mục tiêu an toàn thực phẩm, qui trình - thủ tục theo yêu cầu tiêu chuẩn, hồ sơ theo yêu cầu tiêu chuẩn, tài liệu cần thiết để tổ chức thiết lập, triển khai cập nhật có hiệu lực hệ thống quản lý an toàn thực phẩm Bước 6: Triển khai hệ thống quản lý an toàn thực phẩm: phổ biến để nhân viên nhận thức hệ thống tài liệu theo ISO 22000 Xác định rõ trách nhiệm, quyền hạn liên quan đến qui trình cụ thể hướng dẫn nhân viên thực theo tài liệu phê duyệt Bước 7: Kiểm tra xác nhận hệ thống quản lý an toàn thực phẩm chuẩn bị cho đánh giá chứng nhận bao gồm: sở sản xuất thực phẩm tiến hành đánh giá nội bộ, thẩm định kết kiểm tra xác nhận riêng lẻ, phân tích kết hoạt động kiểm tra xác nhận để xác định phù hợp hệ thống quản lý an toàn thực phẩm tiến hành hoạt động khắc phục, phòng ngừa cần thiết - Lựa chọn tổ chức chứng nhận: Cơ sở sản xuất thực phẩm có quyền lựa chọn tổ chức chứng nhận để đánh giá cấp chứng - Đánh giá trước chứng nhận nhằm xác định mức độ hoàn thiện sẵn sàng hệ thống quản lý an toàn thực phẩm đồng thời chuẩn bị cho đánh giá thức Bước 8: Đánh giá chứng nhận tổ chức độc lập, khách quan tiến hành nhằm khẳng định tính phù hợp hệ thống quản lý an toàn thực phẩm doanh nghiệp với yêu cầu tiêu chuẩn ISO 22000 cấp giấy chứng nhận Bước 9: Duy trì hệ thống quản lý an toàn thực phẩm sau chứng nhận nhằm đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn không ngừng cải tiến hướng đến thỏa mãn yêu cầu khách hàng bên quan tâm Quy trình kiem tra phat hien Enterobacter http://www.hpastandardmethods.org.uk/documents/bsopid/pdf/bsopid16.pdf Bên cạnh pp phân lập cổ điển ngày với sư phát triển nhanh khoa học kĩ thuật, người ta ứng dụng kĩ thuật mới, công nghệ sinh học phân tử vào việc phát lọai VSV có enterobacter Phân loại vi sinh Sinh Học Phân Tử Vietsciences- Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng 27/02/2007 Những tác giả Khái quát phương pháp phân loại vi sinh vật truyền thống: Trước công tác phân loại vi sinh vật dựa đặc tính hình thái, sinh lý hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả sinh acid môi trường sắc tố tạo thành v.v Các đặc trưng bộc lộ hạn chế đặc tính dùng cho nhóm vi sinh vật (Enterobacteriaceae) lại ý nghĩa nhóm khác (vi khuẩn gram âm - gram negative bacteria) Hạn chế phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại số vi sinh vật Từ trước đến nay, đơn vị định tên vi sinh vật loài, bao gồm nhóm thể có mức độ tương đồng cao đặc điểm hình thái Các phương pháp dựa phản ứng sinh hóa: Từ hạn chế việc xác định đặc tính hình thái dẫn đến nhiều nghiên cứu tập trung vào phản ứng sinh hóa đặc trưng cho vi sinh vật riêng biệt Sự khác biệt phản ứng có ý nghĩa cho phân loại vi sinh vật - API20E KIT, nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác Nói chung có nhiều nơi dùng kỹ thuật nhìn chung kết nhiều sai số nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trường hợp gene định phản ứng sinh hóa nằm plasmid lại bị nhiều nguyên nhân khác tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trình nuôi cấy dẫn đến sai khác làm sai kết - Phân biệt thực khuẩn thể: Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào để sau thực khuẩn thể nhân lên thành hạt tế bào chủ, với số vi khuẩn thực khuẩn thể xâm nhiễm lại không làm tan tế bào vi khuẩn chúng tồn với tế bào vật chủ Dựa vào khác biệt mà người ta dùng thực khuẩn thể khác để phân biệt đối tượng vi khuẩn nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp bộc lộ số nhược điểm khó giải đặc tính mẫn cảm vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi điều kiện ngoại cảnh vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác thực khuẩn thể khác Mặt khác nữa, thực khuẩn thể dễ thay đổi đặc tính làm thay đổi chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ - Phân biệt theo Typ huyết thanh: Đây phương pháp dùng lâu hiệu sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt) Nguyên tắc dựa vào nhóm định kháng nguyên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao protein vỏ) Ưu phương pháp kháng huyết dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, nhiều trường hợp đặc trưng cho loài Nói chung phương pháp ổn định hạn chế chủ yếu phương pháp chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết không đồng phòng thí nghiệm tính ổn định lần lặp lại - Phân biệt loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin) : Bacteriocin chất peptid kháng khuẩn sinh vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo loại bacteriocin có khả kháng lại bacteriocin 1, Thêm ethanol đầy vào cột, ly tâm 2, Bỏ ethanol ly tâm lại lần 3, Lặp lại bước với nước cât 4, Giữ cột trạng thái khô lần sử dụng sau (Cột dùng cho nhiều lần nhiên muốn tinh ADN dùng cho tách dòng nên dùng cột mới) Các loại dịch đệm dùng cho cột Qiagene: Đệm P1 Đệm P2 50 mM Tris -HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, Rnase A pha trước dùng đệm P1 nồng độ 100 μg/ml 200 mM NaOH,1%SDS Đệm P3 2,55M KAc, pH 4,8 Đệm QBT 750mM NaCl,50mM MOPS,15% ethanol, pH 7,0, 0,15% Triton X-100 Đệm QC 1M NaCl, 50mM MOPS, 15% ethanol, pH 7,0 Đệm QF 1,25M NaCl, 50mM MOPS, 15% ethanol, pH 8,2 Bảo quản 4oC Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng Phương pháp Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADN Giới thiệu chung: Phương pháp giới thiệu cách đổ gel, lên mẫu chạy gel giải trình tự ADN Có nhiều cách đổ gel, tham khảo cách khác để chọn cách tiện ích Điều quan trọng kính phải rửa tuyệt đối 1, Mang găng tay loại bỏ hết bột găng tay Rửa kính lần với nước nóng Sau dùng bàn chải rửa với 0.5N NaOH Lau kính với dung dịch Alconox hay chất tẩy rửa có chức tương đương Sau rửa lại nước 2, Rửa kính với nước trao đổi ion sau dựng lên giá cho khô, tránh bụi bám vào kính Lau với ethanol dùng giấy Kimwipes hay Scott Utinity để lau cho không tạo vết Kiểm tra lại bụi bám vào kính để lau cho sạch, sau kính lau lớp dịch Rain-X hay Sigmacott, Gel Slick hãng AT Biochem Mục đích dùng chất giúp cho việc đổ gel dễ dàng gel không bị dính vào kính 3, Rửa lại đệm cách gel (spacer) với nước đặt vào dọc theo hai cạnh đối xứng kính 4, Ghép hai kính với Đặt cẩn thận hai kính cho hai spacer sát tận cuối gene (tạo mặt phẳng với hai kính) Nếu không đảm bảo mặt phẳng dễ bị chảy gel trình đổ gel Kẹp cạnh gel vị trí 5, Chuẩn bị gel acrylamid 8% Long Ranger (Hoefer Rig) Trộn hỗn dịch: 16 ml Acrylamid Long Ranger (LR) 50% ml 10X TBE 70 ml 10M Urea (46 gam) Đưa đến thể tích 100 ml với nước Cho vào 800 μl 10% Ammonium persulphat 50 μl TEMED Quá trình polyme hóa thực 15 -20 phút Chạy gel LR dải nhiệt độ 50-55 oC, nhiệt độ cao 55oC phá liên kết acrylamid LR gel dạng cải biến cho gel acrylamid có số ưu điểm sau: Thứ LR gel với nồng độ cao việc chạy gel gel có nồng độ thấp thông thường, ví dụ LR gel 5% tương đương 4% gel acrylamid với bisacrylamid Thứ LR gel có khả phân giải cao chạy với tốc độ nhanh 30-40% gel thông thường, gel LR khô nhanh không bị dính Một số ý thao tác:: a Trộn gel nhẹ nhàng (tránh trộn mạnh) b Hút dịch acrylamid pitpet hay dùng cốc đong c Đặt kính nghiêng 15o đổ gel cốc đong hay pipet Kiểm soát tốc độ đổ gel góc nghiêng Tránh để dòng gel đổ ngắt quãng điều dẫn đến tạo bọt Nếu phải dừng lại để hút dịch vào syringer lúc phải hạ dần kính xuống vị trí nằm ngang trước dừng đổ gel Sau lấy dịch gel vào syringer tiếp tục đổ gel trước gel lên khỏi vị trí nằm ngang Cứ thao tác đến đổ đầy gel Nếu xuất bọt đổ gel phải dừng lại nghiêng kính bọt khí lên, gõ nhẹ tay vào kính bọt khí lên hết Phải loại hết bọt khí khỏi gel, sau tiếp tục đổ gel 6, Đặt gel nằm ngang đưa cạnh lược cá mập vào gel, tạo góc nghiêng nhằm tránh tạo bọt khí Chắc chắn đặt cạnh lược vào phía gel phần cá mập nằm dọc theo đỉnh kính dài (lược nằm ngược với vị trí hình 1.10) Bổ sung thêm gel đẩy thêm lược vào vị trí cố định lược lại kẹp để tránh xê dịch 7, Bao bọc gel với giấy nilon SaranWrap để tránh gel tiếp xúc với không khí Ngoài thấm giấy lọc với đệm TBE để đậy lên Điều giữ cho gel ẩm tránh gel tiếp xúc với oxy (oxy làm cản trở trình polyme hóa) 8, Quá trình polyme xảy từ 30 phút đến Để xác định polyme hóa hút gel vào pipét pastuer để trình polyme hóa xảy Hoặc lấy gel cho vào ống falcon đậy chặt nắp lại, nhiều trường hợp gel nên polyme hóa 15-20 phút nhanh Nếu trình polyme hóa không xảy lại phải tiến hành rửa kính đổ lại gel Chú ý nhiều khả trình polyme hóa không xảy Ammonium persulphat không tốt dùng lâu, nên chuẩn bị dịch để dùng tuần Điều cần ý gel phải bọc kỹ với SaranWrap để qua đêm 9, Chuẩn bị gel trước chạy: a Lấy SaranWrap khỏi gel b Đặt gel vào thiết bị điện di (bản kính dài đặt áp vào thiết bị), chắn cắt bỏ lớp băng dính đáy gel để việc điện di xảy c Đổ 0,5X TBE vào bể đệm thiết bị, lượng đệm cần phải đủ gel nằm đệm d Đổ đệm vào bể thiết bị, đảm bảo gel nằm lớp đệm Kiểm tra xem đệm có bị chảy hay không e Chạy thử 20-30 phút hiệu điện 2000V (phải cẩn thận nguy hiểm), sau nhiệt độ gel nên đạt tới 50 oC 10, Xử lý nhiệt với mẫu ADN điện di 85 oC hút trộn đều, để đá lên mẫu 11, Tắt nguồn điện vào thiết bị điện di (nhớ ngắt nguồn điện vào thiết bị trường hợp thao tác với thiết bị) 12, Trong xử lý nhiệt với mẫu rửa bề mặt với đệm bể điện di, dùng pipet hay syringer 60 ml Mục đích thao tác loại lớp urea bề mặt gel 13, Đánh dấu vị trí đỉnh mặt gel kính trước gel 14, Đặt lược cá mập lên mặt gel, đặt mặt gel ngập sâu vào mặt gel khoảng mm Chắc chắn vùng không gian giới hạn gel Như phần lược cá mập trở thành cạnh bên giếng, bề mặt gel đáy giếng tra mẫu (hình 1.10) Hình 1.10 Vị trí đặt lược sau đổ gel Phải đảm bảo chắn làm bề mặt gel trước đặt lược cá mập lên gel Nếu không thực việc không đọc phần kết phía gel Nếu quyên thực bước rửa giếng tra mẫu việc khó khăn Nếu lên nhiều mẫu trước cần phải phải làm giếng urea khuyếch tán tích tụ bề mặt gel thời điểm lên mẫu 15, Việc xử lý nhiệt 85 oC mẫu điện di nhằm làm biến tính ADN, lên khoảng 2-4 ml mẫu cho giếng (lên mẫu theo thứ tự ACGT), dùng bút để viết lên kính nhằm tránh nhầm lẫn 16, Quá trình điện di với hiệu điện 2000V màu BPB (Bromophenolblue) di chuyển đến tận bảng gel (1-2 giờ) Nếu chạy gel có gradient muối cho phép đọc nhiều base gel việc làm ngắn lại khoảng cách băng ADN phần cuối gel Nên dừng điện di từ 45 phút – Tắt nguồn điện, bổ sung 1/2 thể tích 3M NaOAc vào bể đệm đáy, trộn Lại tiếp tục công việc chạy gel BPB di chuyển đến cuối gel Chú ý có mặt muối nồng độ cao dẫn đến nhiệt độ tăng, cần phải kiểm soát nhiệt độ trình chạy gel nhằm tránh vỡ kính hỏng gel Chuẩn bị gel cho phát ảnh phóng xạ 17, Lấy gel khỏi thiết bị, ý bể đệm đáy chứa chất phóng xạ, nucleotid dư khỏi gel 18, Đổ bỏ bể đệm 19, Đặt gel bàn thí nghiệm cho kính ngắn lên Phủ lên lớp SaranWrap, dùng đá lạnh đặt lên khoảng phút gel co lại, dùng nhựa tách lớp kính ra, giữ nguyên không cho kính tiếp xúc lại với gel gel dính bị vỡ Lúc gel dính vào kính silicon phủ đổ gel 20, Đặt giấy Whatman lên gel vuốt nhẹ nhàng, lúc gel dính vào giấy lấy dễ dàng (Chú ý trường hợp sử dụng chất phóng xạ S 35 nên cố định mẫu theo cách đây) 21, Sau lấy gel hỏi kính đáy bọc gel với SaranWrap, ý tránh không khí vào lớp SaranWrap gel, điều cản trở ảnh phóng xạ phim 22, Có thể đưa vào thiết bị sấy gel 23, Sấy gel khoảng 45 phút 80oC 24, Đặt phim X-ray theo dẫn vào gel hộp cassette (có phim có mặt thao tác phải để có ảnh phóng xạ) Thời gian nhận xạ 12-14 P 32 24-48 S35 25, Đọc kết Cố định gel: Mục đích bước loại bớt urea khỏi gel có mặt urea hạn chế phân cách ADN, bước thực sau: + Đặt kính có gel vào khay chìm hỗn dịch 15% ethanol 10% acetic acid + Cố định 10-15 phút đủ để urea khuyếch tán khỏi gel + Dùng giấy lọc để thấm hết dịch cố định khỏi gel + Tiếp tục làm theo bước quy trình ảnh phóng xạ Hóa chất cách chuẩn bị: Phương pháp: Giải trình tự ADN sợi kép sử dụng KIT biến tính nhanh với sequenase Phương pháp thích ứng với việc giải trình tự plasmid sợi đôi Bắt đầu việc gây biến tính kiềm (NaOH) glycerol, sau kết tủa ADN bắt cặp với ADN mồi dùng để giải trình tự Phương pháp giải trình tự ADN với sợi đôi cần lượng ADN mồi cao gấp 10-20 lần so với sợi đơn Việc giải trình tự gồm hai phản ứng: phản ứng đánh dấu phản ứng dừng điểm cuối Trong phản ứng đánh dấu sợi ADN bổ sung gắn kết với chất đánh dấu phóng xạ việc kéo dài chuỗi Sau phản ứng kéo dài chuỗi ADN bị dừng cách ngẫu nhiên nồng độ thấp nucleotid dịch phản ứng (0.08 mM) Bước kết thúc chỗi với dideoxynucleotid có nồng độ cao deoxyribonucleotid (33,3 mM) Các trình tự sợi khuôn xác định với nồng độ cao deoxynucleotid phản ứng đánh dấu xảy trước việc bổ sung dideoxynucleotid vào hỗn hợp phản ứng Quy trình sau rút gọn, có nhiều phần tiện ích chi tiết thay đổi tài liệu hướng dẫn Điều quan trọng để có kết tốt việc giải trình tự ADN chất lượng cao ADN plasmid Trong khâu chuẩn bị việc xuất phân tử đứt gãy dẫn đến kết không rõ, khó xác định băng Các plasmid sợi đơn phải làm biến tính cho mở xoắn trước giải trình tự Biến tính plasmid xoắn liên kết hóa trị lúc đạt xử lý nhiệt nhiệt độ bắt cặp mồi hay đệm phản ứng, lẽ nhiệt độ mở xoắn thường 105ng 105oC Có hai phương pháp nhanh tiện lợi: Một phương pháp xuất phát từ thực tế glycerol ethylen glycerol có tác dụng làm giảm nhiệt độ mở xoắn, phương pháp thứ mở xoắn môi trường kiềm Cả hai phương pháp thực đơn giản cho hầu hết loại ADN khuôn Đối với hai phương pháp biến tính ADN, nên dùng lượng ADN khuôn nồng độ 0.5 pmol (05- 0.3 mg) lượng primer 2-5 pmpol Nếu sử dụng thể tích ADN nhỏ phải pha đến nồng độ thích hợp nước Kết tốt thu theo tỷ lệ phân tử mồi : sợi khuôn : Tỷ lệ nên trì tiến hành với lượng ADN khuôn khác Trong trường hợp mà số lượng thành phần dẫn đến băng không rõ cuối gel Lượng ADN khuôn cần theo phương pháp so với sử dụng sequenase KIT 2.0 không bị ADN bước kết tủa với ethanol Tác nhân gây biến tính ADN khuôn KIT đệm 40:50 glycerol ethylen glycerol Việc bổ sung đệm vào dung dịch ADN theo tỷ lệ dẫn; 40% glycerol làm giảm nhiệt độ biến tính ADN xuống khoảng 20 oC Chý ý dùng đệm glycerol gây nên việc di chuyển không gel điện di vùng có khoảng cách 300-400 kể từ đoạn ADN mồi Nên sử dụng đệm chạy gel hạn chế tác dụng glycerol (thay taurin cho đệm chạy gel TBE) khắc phục điều ADN plasmid biến tính nhiệt độ pH kiềm (pH 13) Điều quan trọng phương pháp việc trung hòa bước biến tính kiềm HCL phải thực cách xác Như nên dùng loại pipet cho việc bổ sung kiềm trung hòa acid HCL sau Nói chung dung dịch NaOH HCL chuẩn bị có nồng độ 1M, trường hợp dùng hóa chất riêng phải đảm bảo nồng độ dao động khoảng 0,95- 1.05M Bước gây biến tính kiềm kết tủa với ethanol thực với hóa chất KIT không đạt kết mong muốn cần phải cải tiến Trong trường hợp giải trình tự với ADN sợi đơn, thực bước biến tính ADN, hỗn dịch chuẩn bị đơn giản gồm: ADN plasmid, 05 pmol primer, ml đệm phản ứng bổ sung nước cho đủ 15 ml Phản ứng tốt đọc trình tự dài khoảng 400 bps Cách tiến hành cụ thể: Biến tính ADN (theo hai cách trình bày trên) A Biến tính với glycerol: ADN: 0.5 – 0.3 mg (thể tích tối đa ml) Đệm biến tính plasmid: ml Primer: ml Nước cất dẫn đến: 13 ml Trộn đều, ủ phút 90 – 100 oC, làm lạnh nhanh đá Bổ sung thêm đệm phản ứng: ml để đạt tổng thể tích 15 ml B Biến tính với kiềm (không cần kết tủa với ethanol) Thành phần phản ứng gồm: ADN: 0.5 - 3mg (thể tích tối đa 8ml) NaOH 1M: ml Primer: ml Nước cất dẫn đến: 11 ml Trộn đều, giữ 10 phút 37oC, làm lạnh nhanh đá Điều quan trọng phương pháp bước trung hòa phải thực xác với HCL Sau bổ sung HCL 1M : ml Đệm phản ứng plasmid: ml Tổng thể tích là: 15 ml Bắt cặp mồi vào sợi khuôn: Giữ hỗn dịch ADN mồi 37 oC 10 phút, sau giữ đá lạnh (mẫu nên dùng vòng giờ) Chuẩn bị tube chứa hỗn dịch kết thúc chuỗi: Trong thực bước bắt cặp sợi khuôn sợi mồi, tiến thành hút 2,5 ml hỗn dịch kết thúc chuỗi cho loại (ddA, ddC, ddG, ddT) cho vào tube riêng biệt Đậy nắp, để đá để dùng cho bước Pha loãng dịch đánh dấu: Pha loãng dịch đánh dấu lần với nước giữ đá Không nên pha loãng dịch đánh dấu muốn đọc đoạn xa mồi Dịch đánh dấu: ml Nước: ml Tổng số: 10 ml Làm ấm mẫu đá chuẩn bị bước 3: Bốn mẫu chuẩn bị bước ACGT ủ 37oC phút Phản ứng đánh dấu (kể từ bước đầu côn pipét thực với hóa chất phóng xạ, cần phải có biện pháp bảo vệ đeo găng tay) Bổ sung thành phần sau vào 15 ml hỗn dịch bắt cặp chuẩn bị bước DTT 0.1M : ml Dịch đánh dấu (bước 4): ml Hóa chất phóng xạ: S35 (P33, P32): 0.5 ml Enzym T7 sequenase cho plasmid: ml Tổng thể tích : 20.5 ml (Thể tích chia phần bước 7) Trộn (tránh bọt), ủ hỗn dịch nhiệt độ phòng -5 phút (đối với plasmid làm biến tính glycerol ủ 5-10 phút nhiệt độ phòng phút 37 oC) Thường bổ sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid cuối cùng, sau thành phần khác bổ sung Không bổ sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid vào hỗn dịch đánh dấu, DTT hay hỗn dịch khác đệm Chú ý: Nếu trường hợp chất phóng xạ S 35 để lâu tăng lượng lên ml cho phản ứng, sau giảm lượng nước tương ứng Phản ứng kết thúc chuỗi: a Lấy 4,5 ml hỗn dịch thu từ bước cho vào thành tube kết thúc chuỗi làm ấm bước (A, C, G, T) Đậy nắp lại li tâm nhanh để trộn đều, tiếp tục ủ phút 37oC (có thể kéo dài tới 30 phút) Nếu thấy cần thiết li tâm nhanh để thu lấy hỗn dịch trước tiến hành phản ứng đánh dấu b Tại thời điểm cuối phút, bổ sung ml hỗn dịch dừng phản ứng vào thành tube đóng nắp nhanh Như dừng phản ứng thời gian thích hợp cách li tâm để dịch dừng phản ứng xuống hỗn dịch phản ứng c Ngay li tâm để dịch dừng phản ứng xuống hỗn dịch phản ứng, sau bước phản ứng đánh dấu hoàn tất mẫu giữ oC để sử dụng ngày hôm sau d Xử lý nhiệt độ 75 oC cho mẫu khoảng 2-3 phút trước tra mẫu lên gel, với mẫu chứa glycerol việc lên mẫu dễ dàng với đầu côn vàng e Lên khoảng 2-3 ml mẫu cho giếng gel giải trình tự Nên đưa lượng đồng mẫu giếng Cách tốt để lên mẫu không bị bọt hút ml mẫu tra dùng ml đủ Hóa chất: Hỗn dịch kết thúc chuỗi: Tube dATP dCTP 7-deaseGTP dTTP ddATP ddCTP ddGTP ddTTP NaCl A 80μM 80μM 80μM 80μM 8μM C 80μM 80μM 80μM 80μM G 80μM 80μM 80μM 80μM T 80μM 80μM 80μM 80μM 8μM 8μM 50 mM 50 mM 50 mM 8μM 50 mM Dịch dừng phản ứng: 95% Formamide 20mM EDTA (Na2), pH 8.0 0.05% Bromopheno Blue (BPB) 0.5% Xylen CyanolFF (XC) Chú ý, bạn gặp trục trặc với việc giải trình tự ADN plasmid nên tái tinh với Genee-Clean sắc ký trao đổi ion Hình 1.11 Tra mẫu thiết bị chạy gel Các phần đề cập đến số vấn đề nảy sinh cách giải tiến hành giải trình tự ADN - Muốn đọc trình tự ADN dài hơn: Yêu cầu phải đọc đoạn gene đến mức gel Thông thường kích thước đọc cho phản ứng gel 250-300 nucleotid Với thời gian chạy gel lâu khoảng đọc kích thước gene dài 400 nucleotid Nếu sử dụng gel gradient không phù hợp cho mục đích khoảng cách băng ADN hẹp tới mức đọc Nồng độ gel acrylamid dao động 4-6% thích hợp cho kết tốt Có giải pháp sử dụng gel với gradient muối giữ nguyên thời gian chạy gel (xem phương pháp 2, bước 16) - Sự dồn băng: Nguyên nhân chung để hoàn tất việc giải trình tự ADN băng không rõ cấu trúc bậc hai sản phẩm phản ứng kéo dài chuỗi, điều thường mô tả dồn ép băng băng bị thu hẹp cách bất thường ảnh fim kết giải trình tự ADN Các khoảng cách hoàn toàn mà khoảng liên kết G-C bổ sung kèm với 25 base dẫn đến kết đọc đoạn gene chiếm khoảng nhỏ gel Khoảng trống bất thường ảnh hưởng chuỗi với khoảng cách ngắn cấu trúc bậc có tốc độ di chuyển sợi thẳng có chiều dài ngắn, ví trí fim vùng dồn băng khoảng cách băng rộng khác thường bền cấu trúc bậc làm cho chiều dài chuỗi tăng lên di động chuỗi trở nên bình thường Việc giải trình tự qua vùng gene dồn nén khắc phục cách thực việc đọc trình tự hai sợi Sự bất thường việc di chuyển nảy sinh chuỗi có chiều dài không đủ cho việc bắt cặp Điều có nghĩa vùng gene có băng không rõ ràng khắc phục cách sử dụng dITP thay cho dGTP phản ứng giải trình tự ADN Lý base I có liên kết với C thay liên kết trường hợp với G, kết ADN dễ duỗi Kỹ thuật thường dùng, dITP có KIT sequenase Một cách khác làm bền vùng base dồn nén cặp đôi thực chạy gel điều kiện biến tính (ví dụ sử dụng formamide nước dùng đổ gel) Trong trường hợp thay 25% formamide cho nước đạt kết tốt Gel có formamide thường dùng vùng dồn nén gần mồi, nên xử lý formamide qua gel trao đổi ion trước chuẩn bị gel Trong trường hợp mà cấu trúc cặp đôi phức tạp mà vùng dồn nén lại nằm vị trí tương đồng sợi đối diện Khi cách giải trở nên khó khăn với kỹ thuật có thường đưa lại kết khác - Cường độ băng thiếu đồng nhất: Một vấn đề khác phản ứng giải trình tự ADN cường độ băng không đồng Điều thường xuất phương pháp giải trình tự với thiết bị tự động dựa vào phương pháp phát xạ huỳnh quang Sự thiếu đồng có mặt sequenase cần Mg++ gắn dideoxy kết thúc chuỗi khác vị trí khác (vấn đề bàn luận kỹ tài liệu USB sequenase) b Kỹ thuật giải trình tự ADN thiết bị giải trình tự ADN tự động: Hình 1.12 Thiết bị giải trình tự ADN tự độngg (3100-Avant Genetic Analyzer) Trong phần đề cập phản ứng giải trình tự ADN loại thiết bị chủ yếu dùng phổ biến là: Beckman Coulter ABI 3100-Avant Chuẩn bị mẫu giải trình tự ADN: Thành phần phản ứng (cho phản ứng 20 ml): - Terminator Ready Reaction Mix*: μl - Template: 80-100 ng ( với plasmid là: 300ng) - Primer : 3.2 pmol - Nước cất vô trình: đủ 20 μl Chuẩn bị Teminator Ready Reaction Mix cho phản ứng: 15 μl Bigdye Sequencing Buffer 3.1 (5X) + 15 μl nước = 30 µl (2.5X) 20 μl đệm 2.5X + 20 μl Ready Reaction Premix= 40 μl Terminator Ready Reaction Mix (dùng μl) cho phản ứng Tiến hành phản ứng: Phản ứng thực 200 ml tube hay microplate Cycling thực máy PCR theo chương trình sau: Denature 96oC: phút 96 oC: 10 giây 50oC: giây 60oC: phút Cycling: 25 cycles Kết tủa sản phẩm PCR: - Cho vào 5µl EDTA 125 mM + 60µl E-OH 100%E-OH 100% - Trộn đều, để 15 phút nhiệt độ phòng Ly tâm 15 000 v/phút - Rửa lại 60µl E-OH 70% lại ly tâm (4oC) - Làm khô mẫu nhiệt độ phòng (Speed Vac) - Khi mẫu khô, thêm 10µl Hi-Di formamide, trộn sau ủ 96oC phút - Để đá trước cho vào seq Đưa mẫu vào máy đọc trình tự Phòng thí nghiệm http://web.mit.edu/7.02/virtual_lab/PBC/PBC5virtuallab.html "ảo" : Formazan gồm MTT (3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-dihphenyl-2H-tetrazolium bromide) nước hòa tan XTT (23-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2Htetrazolium-5-carboxanilide) © http://vietsciences.free.fr http://vietsciences.org Dương Văn Hợp Nguyễn Lân Dũng