Hệ thống quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm theo HACCP

Phân tích acid nucleic

Việc tách các mảnh cắt đó được thực hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong trường xung điện (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis ).style="text-align: justify; margin- top: 6.0pt"> Như vậy kỹ thuật dấu vân tay không chỉ áp dụng trong trường hợp trên tế bào mang plasmid mà kỹ thuật này còn được sử dụng với nhiễm sắc thể cho mọi trường hợp.rường hợp.ường hợp.ường hợp. Tuy nhiên, một trong những nguyên nhân hạn chế cho phép phân tích trên là các phương pháp tách ADN thông thường đều dẫn đến thay đổi kích thước do đứt gãy ADN nhiễm sắc thể, mặt khác sự có mặt của plasmid lẫn cũng tạo ra sự khác biệt giả trong kết quả phân tích, để khắc phục nhược điểm trên người ta phải thực hiện phép phân tích ADN nhiễm sắc thể nguyên vẹn để phát hiện các nguồn ADN tạp nhiễm lẫn vào kết quả phân tích.

Lai ADN

Phương pháp PFGE hiện đang được dùng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vi sinh vật, áp dụng trên các đối tượng dễ nuôi cấy có thể cho các kết quả tốt hơn nhưng hạn chế về giá thành thiết bị cũng như yêu cầu cao về kỹ thuật và kinh nghiệm. Hạn chế của phương pháp này là không đạt được sự thích hợp cần thiết cho các thí nghiệm chẩn đoán liên quan tới xác định mẫu vi sinh vật, ví dụ thời gian bán huỷ mẫu dò ngắn, nguy hiểm cho người sử dụng và cần yêu cầu an toàn nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và cá nhân sử dụng cũng như việc quản lý chất thải. Tuy nhiên, do hầu hết các vi sinh vật có khả năng thấm (hay cho phép) các đoạn ngắn oligonucleotid đánh dấu đi vào tế bào sau khi cố định mẫu vì vậy khi sử dụng mẫu dò đánh dấu với chất nhuộm huỳnh quang đặc biệt có thể nhìn thấy được trực tiếp vi sinh vật dưới kính hiển vi huỳnh quang.

1, Mẫu dò có thể là đoạn RNA ribosom từ một loài sinh vật nào đó: ví dụ rRNA của E.coli có thể được các công ty thương phẩm cung cấp (Boeringer Mannheim), đây là mẫu dò khá thuận lợi và được đánh dấu phóng xạ hay với các cơ chất huỳnh quang. Như đã trình bày ở trên mọi mẫu dò đều cho các kết quả có sức thuyết phục tuy nhiên kỹ thuật dùng mẫu dò là đoạn RNA của ribosom đã đưa ra một cách tiếp cận mới trong nghiên cứu dịch tễ phân tử với các vi khuẩn có sự khác biệt lớn trong khi đó các mẫu dò khác chỉ giới hạn với một loài hay chỉ có ý nghĩa cho các chủng trong cùng một loài. Khi thực hiện phép lai nên chú ý nếu như dùng nguồn ARN ribosom của một chủng nào đó đánh dấu làm mẫu dò thì cần phải thay đổi điều kiện lai như nhiệt độ để phép lai được thực hiện tốt với các đoạn ADN từ các chủng vi sinh vật khác nhau.

Phương pháp đánh dấu phóng xạ (Grimont, 1986), đây là phương pháp có ưu thế là chỉ cần vài bước đơn giản cho phép lai và rửa mẫu nhưng lại mang nhiều hạn chế như: thời gian bán huỷ ngắn, yêu cầu an toàn cho phòng thí nghiệm riêng biệt, nguy hiểm cho người dùng và gặp khó khăn với việc xử lý chất thải phóng xạ. Hiện nay, có thể sử dụng các đoạn ADN tổng hợp làm mẫu dò và điều này thực tế đã làm cải thiện nhiều mặt của kỹ thuật lai như: khi có ADN tổng hợp thì không phải thực hiện các kỹ thuật tách và tinh sạch các mảnh ADN tách dòng có thể lẫn ADN plasmid. Cho dù kỹ thuật này được sử dụng tốt cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau nhưng năm 1992 Heimberger và cộng sự đã tiến hành phân tích ADN được xử lý với enzym cắt hạn chế trong trường xung điện (PFGE), kết quả này rất có ý nghĩa cho phép phân tích sâu hơn và phân biệt các chủng vi sinh vật liên quan đến sự bùng phát dịch đối với các chủng vi sinh vật khác.

Tuy nhiên, sự khác biệt ở chỗ ribotyping phản ánh sự phân bố của vị trí các enzym cắt hạn chế nằm trong các gene mã hoá cho rRNA hay nằm trong vùng nhiễm sắc thể có độ bảo thủ cao, còn đối với PFGE phản ánh sự phân bố của các enzym cắt hạn chế phân bố trên toàn bộ gene nghiên cứu.

Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN

Mẫu dò đánh dấu với kỹ thuật PCR có ưu thế hơn các phương pháp đánh dấu truyền thống bằng kỹ thuật tổng hợp các mạch đứt gãy (nick translation) hay đánh dấu với mồi ngẫu nhiên (rADN random primer labeling). Trong trường hợp này dùng kết hợp kỹ thuật PCR và xử lý sản phẩm PCR với enzym cắt hạn chế và quan sát kết quả sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose hoặc polyacrylamid Một dẫn chứng cho kỹ thuật này là kết quả nhân gene synthase citrat trong Ricketsiae sau đó sản phẩm PCR được xử lý với enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các chủng với nhau (Regnery và Ctv, 1991). Engstrand và cộng tác viên (1920) đã công bố có thể sử dụng mẫu dò là đoạn nucleotid bổ sung với đoạn 16S của rARN như là một trong số mồi cho phép nhân phiên mã ngược ARN và phép phân tích được thực hiện nhờ kỹ thuật PCR nhân sản phẩm cDNA được dùng cho phát hiện Helicobacter spp.

Thực tế phương pháp tạo ra kết quả finger printing đa dạng từ hầu hết các đại diện của Enterobacteriaceae (Versalovic và cộng sự, 1991) và được ứng dụng trên tất các vi khuẩn có mang các đoạn gene bảo thủ lặp lại trên. Khó khăn này được loại bỏ trong trường hợp dùng các mồi ngẫu nhiên hay tuỳ tiện, như vậy phương pháp phân tích không cần đến thông tin về geneome của đối tượng nghiên cứu…Cơ sở của phương pháp này đã được Welsh và McClell ADN (1990) mô tả khi dùng mồi ngẫu nhiên nhân gene và tạo ra phổ finger printing đặc trưng cho từng hệ gene (geneome). Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu.

Các gene bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau. Có hai phương pháp: Phương pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang). Hiện nay có nhiều kỹ thuật tinh sạch plasmid khác nhau, phương pháp được trình bày dưới đây là phương pháp thu được plasmid có độ tinh sạch cao, có thể dùng cho cả giải trình tự ADN thủ công và tự động hóa.

Thực tế có rất nhiều công việc phải giải trình tự một cách thủ công và các cán bộ nghiên cứu đã tìm ra nhiều phương pháp tinh sạch khác nhau để thu nhận ADN đạt độ sạch cần thiết, thậm chí có thể dùng cho giải trình tự ADN tự động.

Thành phần phản ứng (cho 1 phản ứng 20 ml)

Tiến hành phản ứng

Kết tủa sản phẩm PCR