Định danh các phân chủng vi nấm cryptococcus neoformans trên bệnh nhân HIV AIDS viêm màng não và khảo sát độ nhạy cảm đối với các thuốc kháng nấm hiện hành

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Như Quỳnh ĐỊNH DANH CÁC PHÂN CHỦNG VI NẤM CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS TRÊN BỆNH NHÂN HIV/AIDS VIÊM MÀNG NÃO VÀ KHẢO SÁT ĐỘ NHẠY CẢM ĐỐI VỚI CÁC THUỐC KHÁNG NẤM HIỆN HÀNH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Như Quỳnh ĐỊNH DANH CÁC PHÂN CHỦNG VI NẤM CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS TRÊN BỆNH NHÂN HIV/AIDS VIÊM MÀNG NÃO VÀ KHẢO SÁT ĐỘ NHẠY CẢM ĐỐI VỚI CÁC THUỐC KHÁNG NẤM HIỆN HÀNH Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS.BS TRẦN PHỦ MẠNH SIÊU Thành phố Hồ Chí Minh - 2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến:  TS BS Trần Phủ Mạnh Siêu, người tận tình dẫn, động viên, tạo điều kiện tốt cho suốt trình thực đề tài  PGS BS Cao Minh Nga, người định hướng cho việc chọn đề tài  Phòng xét nghiệm vi nấm – Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới, TP HCM hỗ trợ, giúp đỡ trình thực thí nghiệm đề tài  Quý Thầy, Cô khoa Sinh học – Trường ĐHSP Thành Phố Hồ Chí Minh tận tình dạy dỗ suốt khóa học cao học  Xin cảm ơn gia đình, bạn bè bên cạnh, động viên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Tác giả luận văn Nguyễn Như Quỳnh DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS ARV BV Bệnh Nhiệt Đới BMI Thạch BHI CLS CGB CFU CDBT DNT HIV NTCH PCR SDA SGMD VMN MIC GMX C.neoformans Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired immunodeficiency syndrome) Anti – retrovirus Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Chỉ số khối thể (Body mass index) Brain heart infusion agar Cận lâm sàng Canavanine glycine bromothyloml blue Colony forming unit Creatinine dextrose bromothymol blue thymine Dịch não tủy Human immunodeficiency virus Nhiễm trùng hội Phản ứng trùng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction) Sabouraud dextrose agar Suy giảm miễn dịch Viêm màng não Minimum Inhibit Concentration (nồng độ ức chế tối thiểu) Glycuronoxylomannan Cryptococcus neoformans MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương - TỔNG QUAN 1.1.Tình hình nhiễm HIV/AIDS Việt Nam 1.2 Sinh bệnh học HIV/AIDS 1.3 Vi nấm hội Cryptococcus neoformans 1.3.1 Định nghĩa vi nấm hội 1.3.2 Vi nấm hội Cryptococcus neoformans 1.3.3 Dịch tễ học 1.3.4 Chẩn đoán 10 1.3.5 Điều trị 12 Chương - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Môi trường 16 2.1.3.1 Môi trường nuôi cấy 16 2.1.3.2 Môi trường định danh 17 2.1.4 Thiết bị dụng cụ 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 19 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 19 2.2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu 20 2.2.3.1 Thu thập liệu 20 2.2.3.2 Kỹ thuật nghiên cứu 20 Chương III - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 3.1 Tỷ lệ cấy dương tính 29 3.1.1 Tỷ lệ cấy dương tính với Cryptococcus neoformans bệnh phẩm DNT 29 3.1.2 Tỷ lệ cấy dương tính với Cryptococcus neoformans bệnh phẩm máu 31 3.2 Đặc điểm cỡ mẫu 32 3.2.1 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo giới tính bệnh phẩm DNT 32 3.2.2 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo giới tính bệnh phẩm máu 33 3.3 Về tỷ lệ phân bố vi nấm Cryptococcus neoforman theo nhóm tuổi 33 3.3.1 Về tỷ lệ phân bố vi nấm Cryptococcus neoformans theo nhóm tuổi bệnh phẩm DNT 33 3.3.2 Về tỷ lệ phân bố vi nấm Cryptococcus neoformans theo nhóm tuổi bệnh phẩm máu 34 3.4 Tỷ lệ thứ vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố loại bệnh phẩm 35 3.4.1 Tỷ lệ thứ vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố bệnh phẩm DNT 36 3.4.2 Tỷ lệ thứ vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố bệnh phẩm máu 37 3.5 Tỷ lệ kiểu huyết vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố loại bệnh phẩm 39 3.5.1 Tỷ lệ kiểu huyết vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố bệnh phẩm DNT 40 3.5.2 Tỷ lệ kiểu huyết vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố bệnh phẩm máu 41 3.6 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương loại bệnh phẩm 41 3.6.1 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương bệnh phẩm DNT 41 3.6.2 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương bệnh phẩm máu 43 3.7 Về độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm (MIC) 45 3.7.1 Về độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm bệnh phẩm DNT 46 3.7.2 Về độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm bệnh phẩm máu 46 3.7.3 Bàn luận 46 Chương - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 KẾT LUẬN 51 4.2 KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH NGHIÊN CỨU DANH SÁCH BỆNH NHÂN ĐƯA VÀO NGHIÊN CỨU DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Tỷ lệ cấy nấm dương tính bệnh phẩm DNT 30 Bảng 3.2 Tỷ lệ cấy nấm dương tính bệnh phẩm máu 30 Bảng 3.3 So sánh tỷ lệ cấy nấm dương tính máu DNT 31 Bảng 3.4 Phân bố giới tính bệnh phẩm DNT 32 Bảng 3.5 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo giới tính bệnh phẩm DNT 32 Bảng 3.6 Phân bố bệnh nhân theo giới tính bệnh phẩm máu 33 Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo giới tính bệnh phẩm máu 33 Bảng 3.8: Tỷ lệ phân bố vi nấm Cryptococcus neoformans theo nhóm tuổi bệnh phẩm DNT 34 Bảng 3.9 Tỷ lệ phân bố vi nấm Cryptococcus neoformans theo nhóm tuổi bệnh phẩm máu 34 Bảng 3.10 Tỷ lệ thứ vi nấm Cryptococcus neoformans bệnh phẩm DNT 36 Bảng 3.11 Tỷ lệ thứ vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố bệnh phẩm máu 37 Bảng 3.12 Tỷ lệ kiểu huyết vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố bệnh phẩm DNT 40 Bảng 3.13 Tỷ lệ huyết vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố bệnh phẩm máu 41 Bảng 3.14 Tỷ lệ dương tính với Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương bệnh phẩm DNT 42 Bảng 3.15 Tỷ lệ thứ vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương bệnh phẩm DNT 42 Bảng 3.16 Tỷ lệ nhiễm Cryptococcus neoformans var gattii phân bố theo địa phương bệnh phẩm DNT 43 Bảng 3.17 Tỷ lệ nhiễm Cryptococcus neoformans var neoformans phân bố theo địa phương bệnh phẩm DNT 43 Bảng 3.18 Tỷ lệ dương tính với vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương bệnh phẩm máu 43 Bảng 3.19 Tỷ lệ thứ vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương bệnh phẩm máu 44 Bảng 3.20 Tỷ lệ nhiễm Cryptococcus neoformans var gattii phân bố theo địa phương bệnh phẩm máu 44 Bảng 3.21 Tỷ lệ nhiễm Cryptococcus neoformans var neoformans phân bố theo địa phương bệnh phẩm máu 45 Bảng 3.22 Kết làm kháng nấm đồ bệnh phẩm DNT 46 Bảng 3.23 Kết kháng nấm đồ bệnh phẩm máu 46 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình dạng vi thể Cryptococcus neoformans soi mực tàu (x40) Hình 1.2 Hình dạng vi thể Cryptococcus neoformans mô nhuộm Gram (x100) Hình 1.3 Hình dạng vi thể Cryptococcus neoformans với vỏ bao dày Hình 1.4 Khuẩn lạc nấm Cryptococcus neoformans môi trường Sabouraud nhiệt độ phòng Hình 2.1 Chai cấy máu 19 Hình 2.2 Sơ đồ định danh vi nấm Cryptococcus neoformans 25 Hình 2.3 Bảo quản chủng vi nấm 28 Hình 2.4 Bảo quản chủng vi nấm Cryptococcus neoformans nước cất 28 Hình 3.1 Kết phản ứng ngưng kết hạt Latex để phát kháng nguyên vi nấm Cryptococcus neoformans 28 Hình 3.2 Phản ứng dương tính với urê vi nấm Cryptococcus neoformans 28 Hình 3.3 Hình dạng vi thể Cryptococcus neoformans soi LPCB 28 Hình 3.4 Hình dạng vi thể vi nấm Cryptococcus neoformans với vỏ bao dày soi mực Tàu 28 Hình 3.5 Môi trường CGB 34 Hình 3.6 Hai thứ var neoformans var gattii môi trường CGB 34 Hình 3.7 Cryptococcus neoformans var neoformans mt CGB 35 Hình 3.8 Cryptococcus neoformans var gattii mt CGB 35 Hình 3.9 var neoformans (serotype A) môi trường CDBT từ bệnh phẩm DNT 39 Hình 3.10 var neoformans (serotype D) môi trường CDBT từ bệnh phẩm DNT 39 Hình 3.11 Kết làm kháng nấm đồ 44 MỞ ĐẦU  Lý chọn đề tài Tình hình nhiễm HIV/AIDS lan tràn không thu hẹp quốc gia hay khu vực mà thật tượng nơi giới Điều biểu gia tăng bệnh nhân HIV/AIDS với tốc độ ngày mạnh mẽ Theo Tổ chức Y tế Thế giới 2004: Toàn thể nhân loại đương đầu đại dịch AIDS, có 20 triệu người tử vong, 39,4 triệu mang HIV Chỉ tính riêng năm 2008, giới có khoảng 2,7 triệu người nhiễm HIV Tại Việt Nam, Bộ Y tế cho biết tính đến ngày 31/3/2011, nước có 185623 người nhiễm HIV/AIDS sống báo cáo, có 44701 bệnh nhân AIDS sống 49912 trường hợp tử vong AIDS Theo nhiều tác giả nước ngoài, tổn thương gặp tới 40% bệnh nhân nhiễm HIV nấm, vi khuẩn, virus hay ung thư Nhiễm trùng hội (NTCH) nguyên nhân gây tử vong AIDS, nhiễm Cryptococcus neoformans tác nhân gây bệnh nghiêm trọng địa suy giảm miễn dịch HIV/AIDS Cryptococcus neoformans gây bệnh viêm màng não nấm bệnh cảnh thường gặp gây tử vong hàng đầu bệnh nhân HIV/AIDS Ngày việc lạm dụng thuốc kháng nấm thuốc ức chế miễn dịch tạo điều kiện cho chủng vi nấm hội phát triển đặc biệt nước có khí hậu nóng ẩm quanh năm Việt Nam Từ đầu kỉ XX đến nay, có nhiều khảo sát Cryptococcus neoformans thực báo cáo giới, nhiên Việt Nam bệnh nấm Cryptococcus neoformans phát từ năm 1928 (chiếm 10%) sau xuất lẻ tẻ cuối thập niên 1990 chưa nghiên cứu cách có hệ thống đặc biệt chưa đề cập đến phân bố thứ, kiểu huyết Liệu cách phân lập, định danh Cryptococcus neoformans var neoformans Cryptococcus neoformans var gattii giống hay khác nhau, độ nhạy cảm tương ứng chúng thuốc kháng nấm hành vấn đề cần tìm hiểu để đưa phác đồ điều trị hiệu cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS  Đối tượng Các bệnh nhân HIV/AIDS định xét nghiệm dịch não tủy (DNT), máu  Nhiệm vụ đề tài Phân lập định danh phân chủng vi nấm Cryptococcus neoformans từ dịch não tủy, máu bệnh nhân HIV/AIDS khoa nhiễm E, Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới TP HCM So sánh khác biệt tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans theo thứ, theo kiểu huyết khảo sát độ nhạy cảm tương ứng chúng với thuốc kháng nấm hành  Mục tiêu nghiên cứu Phân lập định danh phân chủng vi nấm Cryptococcus neoformans bệnh nhân HIV/AIDS viêm màng não điều trị BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh từ 12/2010 đến 7/2011 Xác định tỷ lệ phân bố theo thứ, theo kiểu huyết mẫu bệnh phẩm DNT, máu bệnh nhân HIV/AIDS viêm màng não Cryptococcus neoformans điều trị BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh từ 12/2010 đến 7/2011 Xác định độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm hành chủng vi nấm Cryptococcus neoformans bệnh nhân HIV/AIDS viêm màng não điều trị BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh từ 12/2010 đến 7/2011  Thời gian, địa điểm phạm vi nghiên cứu Thời gian: 12/2010 đến 7/2011 Địa điểm nghiên cứu: phòng xét nghiệm vi nấm - BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh Phạm vi nghiên cứu: Tất bệnh nhân HIV/AIDS viêm màng não nhập viện BV Bệnh Nhiệt Đới TP.HCM định cấy máu soi dịch não tủy khoảng thời gian từ tháng 12/2010 đến hết tháng 7/2011 Chương - TỔNG QUAN 1.1.Tình hình nhiễm HIV/AIDS Việt Nam Đại dịch HIV/AIDS xuất từ năm 80 nhanh chóng lan toàn cầu HIV công đối tượng niên, phụ nữ, trẻ em, người có tuổi, làm nghành nghề khác nhau, người nghiện ma túy, mại dâm, đồng tính luyến Tại Việt Nam, theo báo cáo Uỷ ban phòng chống AIDS Thành phố Hồ Chí Minh đến 31/12/2002, nước tổng số người nhiễm HIV ghi nhận 59200 trường hợp, 8793 trường hợp chuyển sang AIDS có 4889 ca tử vong HIV/AIDS Số lượng người nhiễm HIV báo cáo năm qua tăng 40% so với năm trước Đến cuối năm 2002, có 12 tỉnh thành có 1000 người nhiễm HIV phát TP Hồ Chí Minh, Quảng Ninh, Hải Phòng, An Giang, Hà Nội, Lạng Sơn, Đồng Nai, Hải Dương, Nghệ An, Đồng Tháp, Bà Rịa - Vũng Tàu Cần Thơ Đứng đầu Quảng Ninh (50247/100000 dân), Hải Phòng (24565/100000) TP Hồ Chí Minh (22806/100000) [2] Năm 2007, Việt Nam có 132628 trường hợp nhiễm HIV 26828 trường hợp AIDS, số ca tử vong 15007 người Năm 2010 có 2741 trường hợp nhiễm HIV mới, tổng số bệnh nhân nhiễm HIV đến hết quý I 209424 ca; tổng số bệnh nhân AIDS 82416 ca, số tử vong 45227 ca từ cục phòng chống HIV/AIDS Bộ y tế Hình thái lây nhiễm HIV chủ yếu qua đường tiêm chích ma túy, có xu hướng gia tăng đối tượng có nguy thấp (tỷ lệ nhiễm HIV niên khám nghĩa vụ quân tăng từ 0,04% năm 1996 lên 0,15% năm 1998 tăng đến 1,31% năm 2001; tỷ lệ nữ mang thai nhiễm HIV tăng từ 0,08% năm 1999 lên 0,2% năm 2000 năm 2002 tăng 0,39%) Nhiễm HIV tiếp xúc có xu hướng gia tăng tuổi trẻ (nhóm tuổi từ 20 - 29 chiếm 29% năm 1997, tăng lên 60,4% năm 2002) Tại TP Hồ Chí Minh, từ trường hợp nhiễm HIV phát vào tháng 12 năm 1990, số trường hợp có HIV dương tính qua xét nghiệm không ngừng gia tăng Tính đến cuối năm 2010, có 13067 trường hợp nhiễm HIV toàn thành phố Tuy nhiên, tổng số người nhiễm HIV thật ước tính phải gấp - lần Trong đó, bệnh nhân AIDS 4481 chết AIDS 1732 người 1.2 Sinh bệnh học HIV/AIDS • HIV nhiễm vào thể qua giai đoạn: Giai đoạn 1: xâm nhập vào thể qua đường: sinh dục, máu, mẹ bị nhiễm truyền sang Giai đoạn 2: công vào “tế bào đích” (là tế bào hệ thống miễn dịch có bề mặt phân tử CD4+: cửa ngõ để virus xâm nhập vào), HIV xâm nhập vào nhiều loại tế bào lymphoT CD4+, monocyst, lympho B, đại thực bào Giai đoạn 3: sinh sản tế bào đích gây tượng Sự sinh sản virus làm cho tế bào bị hủy hoại nhiều chế Khi tế bào bị nhiễm virus, virus sử dụng nguồn lượng tế bào, enzym, chất liệu di truyền để tăng trưởng nhân lên, hậu cuối tế bào bị hủy hoại bị chết Tại BV Bệnh Nhiệt Đới, TP Hồ Chí Minh từ năm 2000 - 2009 số lượt bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS nhập viện điều trị bệnh nhiễm trùng hội không ngừng gia tăng, với số lượng người bệnh tăng trung bình năm khoảng 20% Cụ thể: số lượng bệnh nhân điều trị nội trú bệnh viện năm 2006 2725 trường hợp, gấp lần số lượt bệnh nhân điều trị năm 2000 Trong đó, khu vực ngoaị trú bệnh viện hàng ngày tiếp nhận điều trị cho khoảng 100 lượt bệnh nhân Riêng năm 2006, tiếp nhận khám 3800 lượt cho số 5000 bệnh nhân Vấn đề khó khăn điều trị người bệnh nhiễm HIV/AIDS đa số bệnh nhân suy kiệt mắc bệnh nhiễm trùng hội nặng, chưa có hướng điều trị hiệu trường hợp hạch ổ bụng trung thất, nhiễm trùng thần kinh trung ương Đặc biệt, với bệnh viêm màng não nấm Cryptococcus neoformans gây tử vong với tỷ lệ cao 1.3 Vi nấm hội Cryptococcus neoformans 1.3.1 Định nghĩa vi nấm hội Nấm hội định nghĩa loài nấm mà điều kiện bình thường không gây bệnh Chúng gây bệnh người có hệ miễn dịch yếu trẻ sơ sinh, người già, phụ nữ có thai, bệnh nhân sau phẫu thuật , hay suy giảm miễn dịch mắc phải bệnh nhân HIV/AIDS Nhiễm trùng hội (Opportunistic Infections - OIs) nhiễm trùng vi sinh vật gây người suy giảm miễn dịch (miễn dịch yếu Immunodeficiency bị ức chế miễn dịch - Immunosuppression) Chúng cần có hội như: - Suy dinh dưỡng - Nhiễm trùng dai dẳng - Các yếu tố gây ức chế miễn dịch ghép phủ tạng - Hóa trị ung thư - HIV/AIDS - Dị tật bẩm sinh gen - Tổn thương da - Các hình thức can thiệp y khoa khác 1.3.2 Vi nấm hội Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans tác nhân gây bệnh quan trọng y học ngày nay, đặc biệt địa suy giảm miễn dịch Đây vi nấm hạt men, gồm kiểu huyết (serotypes): A D thuộc thứ neoformans (var neoformans), kiểu huyết A với đề nghị tách riêng thành Cryptococcus neoformans var.grubii tranh cãi; kiểu huyết B C thuộc thứ gattii (var gattii) Sự phân bố địa lý, nguồn chứa, đặc điểm sinh học khả gây bệnh Cryptococcus neoformans thay đổi tùy theo thứ Cryptococcus neoformans var neoformans phân bố khắp nơi giới, phân khô loài chim, gà, đất chứa nhiều phân chim, đặc biệt chim bồ câu Các tháp lâu đài, nhà thờ, tầng tòa nhà cũ, bệ cửa sổ, kho chứa rơm, cỏ khô , nơi loài chim, dơi đến trú ngụ trở thành nguồn chứa vi nấm quan trọng [58] Tuy nhiên, phân lập vi nấm từ phân chim tươi ẩm Cryptococcus neoformans không phát triển môi trường kiềm Ngược lại, Cryptococcus neoformans var gattii xuất phân chim diện nhiều chất mục nát tích tụ hốc thân bạch đàn [49], Cryptococcus neoformans var gattii tác nhân chủ yếu nhiễm Cryptococcus neoformans vùng nhiệt đới, nơi phát triển nhiều giống Châu Phi, Australia, Châu Á Nam Mĩ Đối với thể cảm thụ, Cryptococcus neoformans var gattii có số khác biệt đặc điểm bệnh học khả đáp ứng với trình trị liệu Cryptococcus neoformans var neoformans chiếm ưu địa HIV/AIDS, Cryptococcus neoformans var gattii gây bệnh chủ yếu người khỏe mạnh nên số trường hợp khỏi bệnh cao hơn, nghĩa điều trị hiệu  Bệnh học Vi nấm có đường kính khoảng 20 µm, mô vi nấm có đường kính - 10 µm kể bao dày bên Phần bao khó nhuộm nên ta thấy lớp vỏ rộng, suốt (không ăn phẩm màu), bao quanh tế bào hạt men Vi nấm hạt men tăng trưởng cách nảy búp với cuống hẹp hạt men búp Cryptococcus neoformans cho phản ứng urê dương tính, làm môi trường đổi màu hồng sau Gây bệnh số quan thể như: màng não, máu, phổi, da, nguy hiểm bệnh viêm màng não [15], [19] Hình 1.1 Hình dạng vi thể Cryptococcus neoformans soi mực Tàu (x40) Hình 1.2 Hình dạng vi thể Cryptococcus neoformans mô nhuộm Gram (x100) Hình 1.3 Hình dạng vi thể Cryptococcus neoformans với vỏ bao dày Hình 1.4 Khuẩn lạc nấm Cryptococcus neoformans môi trường Sabouraud nhiệt độ phòng Đặc điểm lâm sàng Nhiễm Cryptococcus neoformans bao gồm thể lâm sàng phổ biến như: thể phổi nguyên phát, VMN, tổn thương da viêm xương, tủy xương Ngoài quan nói trên, vi nấm công tổ chức khác gây viêm thận, bể thận, viêm tiền liệt tuyến, viêm gan, viêm nội tâm mạc, viêm đường tiêu hóa Sau xâm nhập thể ký chủ qua đường hô hấp Cryptococcus neoformans gây phản ứng viêm thoáng qua phổi tương tự giới hạn địa miễn dịch bình thường Trên thể tạng HIV/AIDS, vi nấm từ phổi phát tán vào máu đến thần kinh trung ương gây VMNM - vị trí thường gặp nhiễm nấm toàn thân [15]  Độc tố vi nấm Nấm có yếu tố độc tính chủ yếu sau đây: - Tổng hợp sắc tố melanin : bảo vệ tế bào nấm chống lại stress oxy hóa, thực bào, thuốc chống nấm, sửa đổi chủ phản ứng miễn dịch - Phát triển vỏ polysaccharide vi nấm Cryptococus neoformans: giúp tế bào nấm chống đại thực bào phế nang thực bào Phần lớn loài nấm phát triển tối ưu 25oC 35oC, Cryptococcus neoformans sống sót đường tiêu hóa loài chim (~ 40°C), môi trường thuận lợi lây lan mầm bệnh 1.3.3 Dịch tễ học  Phân bố địa lý Năm 1894, Sanfelice phân lập từ dung dịch nước đào loại nấm men có vỏ bao dày, đặt tên cho chúng Saccharomyces neoformans [93] Đến năm 1901, Vuillemin đưa chủng nấm vào họ Cryptococcus không tìm dạng bào tử nang Saccharomyces, ông ta đặt tên lại cho Cryptococcus hominis Vào năm 1955, Emmons có viết tính gây bệnh loài nấm Cryptococcus hominis hay gọi Cryptococus neoformans Bệnh nấm Cryptococcosis chẩn đoán khắp phương Đông Tuy nhiên, hầu hết trường hợp tác nhân gây bệnh nấm Cryptoccocus neoformans Điều đáng ý có tới 75 - 90% trường hợp mắc bệnh Cyptococcosis phương Đông chủng vi nấm gây chưa tìm tất nơi cư trú vi nấm Không phải chúng cư trú đất phân chim (đặc biệt phân chim bồ câu) mà theo bác sĩ David H.Ellis làm việc bệnh viện nhi Adelaide - Australia giải đáp năm 1990 lây nhiễm theo ông liên quan tới loài mọc khắp Australia bạch đàn (Eucalyptus) Và ông cho phân bố toàn cầu loài tương ứng với phân bố dịch tễ bệnh  nấm Cryptococcus spp chủng vi nấm Cryptococcus neoformans gây [48] Điều cần phổ biến cho tất nước phương Đông Mặc dù có nhiều loài nấm Cryptococcus spp, có chủng gây bệnh người Cryptococcus neoformans Tên chủng nấm thể chất bệnh “crypto” theo tiếng Hi Lạp có nghĩa “ẩn náu” Về mặt vi sinh, thuật ngữ có nghĩa có bao nang bao quanh Cryptococcus neoformans thể nấm men có bao nang gây bệnh cho người Cryptococcus neoformans phát triển đất, khắp nơi đặc biệt phân chim bồ câu Trong đất phân chủng nấm thoát khỏi bao nang, nhờ gió bay khắp nơi phần tử gây nhiễm không bao nang có đường kính - µm xâm nhập vào phổi người Mặc dù bệnh nấm Cryptococcus spp mô tả lần đầu từ cuối năm 1880, trước thời kỳ có HIV/AIDS coi bệnh gặp Tuy nhiên, bệnh có xu hướng tăng toàn giới Theo tính toán tác giả năm NewYork có khoảng 5000 - 15000 trường hợp mắc bệnh nấm Cryptococcus spp [29] Ở Thái Lan, nguyên nhân thứ hai gây tử vong bệnh nhân AIDS Cho tới hầu hết người mắc bệnh có thiếu hụt miễn dịch qua trung gian tế bào Vì thế, người Hodgkin, bệnh nhân AIDS có lympho lao thường bị nhiễm bệnh [36] Các tế bào CD4+ T quan trọng cho đề kháng thể bệnh nhiễm vi nấm Hệ miễn dịch dịch thể tác dụng chủ yếu với vỏ polysaccharide, glucuronoxylomannan, muerin Cryptococcus neoformans  Tỷ lệ nhiễm cộng đồng Tại Thái Lan, theo tài liệu từ ĐH Harward, CDC Mỹ chương trình GAP, tỷ lệ nhiễm nấm Cryptococcus neoformans 19% - 38% [15] Tại Việt Nam, tình hình bệnh nấm Cryptococcus neoformans sau: theo thống kê bác sĩ Khoa Giải Phẫu Bệnh Bệnh Viện Chợ Rẫy từ tháng 4/1999 đến tháng 10/2001, tỷ lệ nhiễm nấm Cryptococcus spp 5% (2/40) [7]; theo thống kê tác giả Trần Phủ Mạnh Siêu BV Bệnh Nhiệt Đới TP HCM, tỷ lệ nhiễm Cryptococcus neoformans chiếm đa số bệnh nhân HIV/AIDS: năm 2003: 60 ca (57,8%); năm 2004: 83 ca (50%); năm 2005 (8 tháng đầu năm): 69 ca (60%)  Phân bố nguồn nhiễm Cryptococcus neoformans gồm kiểu huyết (serotype) xếp thành thứ (variety): kiểu huyết A, D AD thuộc var neoformans; kiểu huyết B C thuộc var gattii Gần số tác giả đề nghị tách kiểu A thành var grubii Nhưng nhiều tranh cãi Các kiểu huyết phân bố khác môi trường khác biệt đặc tính sinh học Trong tự nhiên, Cryptococcus neoformans var neoformans phân lập từ chim, đặc biệt chim bồ câu đất lẫn phân chim [63] Năm 1955, Emmons phát tồn nhiều chủng Cryptococcus neoformans var neoformans với độc lực thay đổi từ mẫu phân chim bồ câu cũ tích tụ sân thượng [50] Tiếp theo nhiều nghiên cứu giới thực để xác định vai trò chim bồ câu Cryptococcus neoformans var neoformans Năm 1974, Swine – Desgaio báo cáo diện Cryptococcus neoformans var neoformans bầu diều hâu với tỷ lệ cao 50% Mặc dù Cryptococcus neoformans diện phân chim bồ câu khả phát chúng khác biệt vùng: Luân Đôn: 7,6% [89]; Bangkok: 7,5 % [55]; Bỉ: 84% [58] Những yếu tố chi phối tượng pH, nồng độ acid uric, creatinine phân chim lượng ánh nắng mặt trời mà phân tiếp xúc Nói cách khác, thành phần hóa học phân chim bồ câu góp phần định phân bố Cryptococcus neoformans var neoformans [94] Ngoài chim bồ câu, số chim khác mang Cryptococcus neoformans var neoformans như: chim hoàng yến, chim vẹt [26] Ngược lại, nôi sinh thái Cryptococcus neoformans var gattii không liên quan đến chim bồ câu kiểu huyết có khả đồng hóa creatinine Cryptococcus neoformans var neoformans Theo Kwon - Chung, thiếu chế điều hòa trình hoạt hóa creatinine deiminase Cryptococcus neoformans var gattii ức chế phát triển chúng phân chim [58] Ellis Pfeifar công bố kết hợp var gattii Eucalyptus camldulensis thung lũng Baosa năm 1990 [48] Francisco năm 1991 [85] Một năm sau, hai tác giả phân lập vi nấm Eucalyptus tereticornic Nhiều nghiên cứu tìm thấy kết tương tự Braxin, Mexico, Uruguay [48] Tuy nhiên khảo sát Châu Phi Nam Mỹ chưa phát Cryptococcus neoformans var gattii Eucalyptus Như vậy, chứng tỏ phải tồn nôi sinh thái khác Cryptococcus neoformans var gattii Chủng var gattii phân lập từ môi trường thuộc kiểu huyết B đến chưa xác định nguồn nhiễm serotype C tự nhiên [58] Sự phân bố theo nguồn nhiễm ảnh hưởng đến tồn khác nhóm serotype địa lý địa bệnh nhân, Cryptococcus neoformans var neoformans phổ biến nước nhiệt đới, cận nhiệt đới xâm lấn bệnh nhân suy giảm miễn dịch mắc phải [58] Tại miền Bắc châu Úc, Cryptococcus neoformans var gattii chiếm 95% [58], mẫu bệnh phẩm phù hợp với diện phong phú bạch đàn xứ Dù số trường hợp nhiễm serotype B C xảy vùng giống bạch đàn (Eucalyptus), nguồn nhiễm tự nhiên Cryptococcus neoformans var gattii thật chưa xác định rõ Kết khảo sát Mỹ cho thấy Cryptococcus neoformans var gattii phân lập từ bệnh nhân sống miền nam California [32] Ở mức độ serotype, chủng vi nấm gây bệnh phổ biến Cryptococcus neoformans var neoformans thuộc serotype A, dao động từ 50 95% tùy vùng địa lý: Nhật Bản cao 95%, Đông Nam Á thấp 50% [58] Sự xuất serotype D vượt trội Đan Mạch, Ý, Thụy Sĩ với tỷ lệ 70% [57] Các đặc tính lí hóa, độc lực mức độ thích nghi thể ký chủ serotype ảnh hưởng đến số liệu Đối với Cryptococcus neoformans var gattii, Kwon - Chung Benet ghi nhận serotype B gấp 4, lần serotype C Mexico, Haiwaii vài nước châu Phi [58], [26] Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nói nôi sinh thái Cryptococcus neoformans nói chung kiểu huyết nói riêng Tuy nhiên, Việt Nam nằm khu vực Đông Nam Á, có khí hậu nhiệt đới nên nhiều khả phân bố serotype tương tự nước khu vực Thật vậy, năm 2002 Nhữ Thị Hoa phân tích chủng phân lập từ bệnh nhân thu thập vòng năm (1996 - 1997) công bố 25,7 % thuộc chủng var gattii [10], tương đồng với đánh giá Thái Lan năm 1988, cao so với Trung Quốc với Ấn Độ năm 1993 [22], [68] 1.3.4 Chẩn đoán  Chẩn đoán xác định Cryptococcus neoformans loại vi nấm hạt men hình tròn, bao quanh vách mucopolysaccharide với độ dày - µm không bắt màu phẩm nhuộm Đặc điểm áp dụng vào phương pháp soi trực tiếp DNT sau nhuộm mực Tàu để chẩn đoán Cryptococcus neoformans Ngưỡng mật độ cho phép phát mầm bệnh 103 – 104 CFU/ml DNT [37], số lượng tế bào nấm đa số bệnh nhân VMN không AIDS dao động khoảng 103 – 107 CFU/ml DNT, địa AIDS 105 - 107 CFU/ml DNT [85] Nói cách khác chẩn đoán vi nấm học không khó khăn vào thời kỳ toàn phát, giai đoạn khởi phát khả kiểm soát kỹ thuật bị hạn chế, khoảng 80% bệnh nhân nhiễm AIDS, 30 - 50% bệnh nhân không AIDS [61] Khi xét nghiệm cặn ly tâm DNT cần thiết giúp gia tăng độ nhạy Ngoài ra, âm tính giả xảy kích thước tế bào nấm nhỏ, bao nang mỏng khó nhận biết Nhìn chung kỹ thuật đơn giản trả lời kết nhanh, giá thành thấp phương pháp nhuộm mực Tàu lựa chọn ưu tiên đánh giá điều trị tế bào nấm dù chết, diện DNT thời gian, [...]... lập và định danh các phân chủng vi nấm Cryptococcus neoformans từ dịch não tủy, máu của bệnh nhân HIV/ AIDS tại khoa nhiễm E, Bệnh vi n Bệnh Nhiệt Đới TP HCM So sánh sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans theo thứ, theo kiểu huyết thanh và khảo sát độ nhạy cảm tương ứng của chúng với các thuốc kháng nấm hiện hành  Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và định danh các phân chủng vi nấm Cryptococcus. .. Cryptococcus neoformans trên bệnh nhân HIV/ AIDS vi m màng não điều trị tại BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh từ 12/2010 đến 7/2011 Xác định tỷ lệ phân bố theo thứ, theo kiểu huyết thanh trên mẫu bệnh phẩm DNT, máu ở bệnh nhân HIV/ AIDS vi m màng não do Cryptococcus neoformans điều trị tại BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh từ 12/2010 đến 7/2011 Xác định độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm hiện hành của các chủng vi nấm. .. lập, định danh Cryptococcus neoformans var neoformans và Cryptococcus neoformans var gattii giống hay khác nhau, và độ nhạy cảm tương ứng của chúng đối với thuốc kháng nấm hiện hành như thế nào là vấn đề cần tìm hiểu để có thể đưa ra phác đồ điều trị hiệu quả nhất cho các bệnh nhân nhiễm HIV/ AIDS hiện nay  Đối tượng Các bệnh nhân HIV/ AIDS chỉ định xét nghiệm dịch não tủy (DNT), máu  Nhiệm vụ đề tài Phân. .. vong của AIDS, trong đó nhiễm Cryptococcus neoformans là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng trên cơ địa suy giảm miễn dịch HIV/ AIDS Cryptococcus neoformans gây ra bệnh vi m màng não nấm là bệnh cảnh thường gặp nhất và gây tử vong hàng đầu ở bệnh nhân HIV/ AIDS Ngày nay vi c lạm dụng thuốc kháng nấm và thuốc ức chế miễn dịch đã tạo điều kiện cho các chủng vi nấm cơ hội phát triển đặc biệt là ở các nước có... nấm Cryptococcus neoformans trên bệnh nhân HIV/ AIDS vi m màng não điều trị tại BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh từ 12/2010 đến 7/2011  Thời gian, địa điểm và phạm vi nghiên cứu Thời gian: 12/2010 đến 7/2011 Địa điểm nghiên cứu: phòng xét nghiệm vi nấm - BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh Phạm vi nghiên cứu: Tất cả các bệnh nhân HIV/ AIDS vi m màng não nhập vi n BV Bệnh Nhiệt Đới TP.HCM được chỉ định. .. dạng vi thể Cryptococcus neoformans với vỏ bao dày Hình 1.4 Khuẩn lạc nấm Cryptococcus neoformans trên môi trường Sabouraud nhiệt độ phòng Đặc điểm lâm sàng Nhiễm Cryptococcus neoformans bao gồm các thể lâm sàng phổ biến như: thể phổi nguyên phát, VMN, tổn thương da vi m xương, tủy xương Ngoài các cơ quan nói trên, vi nấm có thể tấn công các tổ chức khác gây vi m thận, bể thận, vi m tiền liệt tuyến, vi m... hướng điều trị hiệu quả như các trường hợp hạch trong ổ bụng và trung thất, nhiễm trùng thần kinh trung ương Đặc biệt, với bệnh vi m màng não do nấm Cryptococcus neoformans gây tử vong với tỷ lệ rất cao 1.3 Vi nấm cơ hội Cryptococcus neoformans 1.3.1 Định nghĩa vi nấm cơ hội Nấm cơ hội được định nghĩa là những loài nấm mà dưới điều kiện bình thường không gây bệnh Chúng chỉ gây bệnh ở những người có hệ... vi m gan, vi m nội tâm mạc, vi m đường tiêu hóa Sau khi xâm nhập cơ thể ký chủ qua đường hô hấp Cryptococcus neoformans gây phản ứng vi m thoáng qua ở phổi và tương tự giới hạn trên cơ địa miễn dịch bình thường Trên thể tạng HIV/ AIDS, vi nấm từ phổi sẽ phát tán vào máu đến thần kinh trung ương gây VMNM - vị trí thường gặp trong nhiễm nấm toàn thân [15]  Độc tố của vi nấm Nấm này có các yếu tố độc tính... nhiên, Cryptococcus neoformans var neoformans được phân lập từ chim, đặc biệt là chim bồ câu và đất lẫn phân chim [63] Năm 1955, Emmons phát hiện sự tồn tại của nhiều chủng Cryptococcus neoformans var neoformans với độc lực rất thay đổi từ các mẫu phân chim bồ câu cũ tích tụ trên sân thượng [50] Tiếp theo nhiều nghiên cứu trên thế giới được thực hiện để xác định vai trò của chim bồ câu đối với Cryptococcus. .. như Vi t Nam Từ đầu thế kỉ XX đến nay, có rất nhiều khảo sát về Cryptococcus neoformans được thực hiện và báo cáo trên thế giới, tuy nhiên ở Vi t Nam bệnh nấm do Cryptococcus neoformans được phát hiện từ năm 1928 (chiếm 10%) sau đó xuất hiện lẻ tẻ cho đến cuối thập niên 1990 chứ chưa được nghiên cứu một cách có hệ thống đặc biệt chưa đề cập đến sự phân bố các thứ, các kiểu huyết thanh Liệu rằng cách phân