Định danh một số chủng vi khuẩn phân lập tại vườn quốc gai cát tiên dựa trên trình tự nucleotide của gen 16s rdna

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP ===***=== KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TẠI VƯỜN QUỐC GIA C T TI N D A TR N TR NH T NUCLEOTIDE CỦA GEN Giảng viên hƣớng dẫn: S DNA TS HÀ BÍCH HỒNG TS LÊ THỌ SƠN Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ MƠ Mã sinh viên: 1753070145 Hà Nội, tháng 06 năm 2021 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu, với tinh thần nghiêm túc, tích cực đến đề tài khóa luận đƣợc hồn thành Có kết trƣớc hết chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam giúp đỡ bảo tận tình suốt q trình thực khóa luận trƣờng, đặc biệt giúp đỡ thầy cô công tác Bộ môn Gen Di truyền phân tử Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp Nhân dịp tơi tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giáo hƣớng dẫn TS Hà Bích Hồng TS L Thọ Sơn tận tình giúp đỡ bảo tơi q trình thực khóa luận với kỹ kiến thức quý báu Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè giúp đỡ, động viên thân thành viên nhóm suốt trình học tập nghiên cứu Mặc dù cố gắng để hồn thành đề tài khóa luận song linh nghiệm thân hạn chế n n đề tài nghiên cứu khóa luận khơng thể tránh khỏi nhứng thiếu sót Tơi mong nhận đƣợc lời nhận xét, đóng góp ý kiến thầy, giáo để báo cáo đề tài khóa luận đƣợc hồn thiện Kinh ph thực đề tài đƣợc h trợ đề tài cấp Nhà nƣớc Tuyến trùng Caenorhabditis Nematoda : Rhabditidae : Đa dạng chủng loài phản ứng với vi khu n’ Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Thị Mơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Một số thông tin hệ vi khu n đất vƣờn Quốc gia Cát Ti n 1.1.1 Vƣờn Quốc gia Cát Tiên (VQGCT) 1.1.2 Ảnh hƣởng vi khu n đến thực vật 1.1.3 Ảnh hƣởng vi khu n với tuyến trùng 1.2 Các phƣơng pháp định danh vi khu n Phƣơng pháp truyền thống 1.2.1 1.2 Phƣơng pháp đại 10 Phƣơng pháp định danh vi khu n dựa tr n trình tự gen 16S rDNA 14 1.3 Một số nghi n cứu định danh vi khu n dựa tr n trình tự nucleotide gen 16S rDNA 16 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 22 2.2 Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu 22 2.3 Nội dung nghiên cứu 22 2.4 Hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu .22 2.4.1 Hóa chất tách chiết DNA tổng số 22 2.4.2 Hóa chất PCR 22 2.4.3 Hóa chất điện di 23 2.4.4 Các thiết bị dùng nghiên cứu 23 2.5.Phƣơng pháp nghi n cứu 24 2.5.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 24 2.5.2 Sàng lọc tối ƣu hóa nhiệt độ gắn mồi cặp mồi nhân đoạn gen 16S rDNA 24 Phƣơng pháp nhân đoạn gen 16S rDNA kỹ thuật PCR 26 4Phƣơng pháp điện di gel agarose 26 5 Phƣơng pháp tinh sản ph m PCR giải trình tự nucleotide gen 27 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 3.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu vi khu n 29 3.2 Kết sàng lọc tối ƣu hóa nhiệt độ gắn mồi cặp mồi nhân đoạn gen16S rDNA 29 3.3 Kết nhân đoạn gen 16S rDNA sử dụng cặp mồi lựa chọn 31 3.4 Định danh chủng Sequence dựa trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA 33 3.4.1 Định danh chủng Sequence dựa trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F2/R2 33 3.4.2 Định danh chủng Sequence dựa trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F4/R4 35 3.5 Định danh chủng 15.1 dựa trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA 37 3.5.1 Định danh chủng 15.1 dựa trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNAvới cặp mồi F2/R2 .37 3.5.2 Định danh chủng 15.1 dựa trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNAvới cặp mồi F4/R4 .39 CHƢƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 Kết luận 42 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Tên Tiếng Việt Bp Base pair Cặp bazo nito DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic Axit (DNA) EDTA Ethylene diamine tetra acid citic Etylen diamin tetraxetic Polymerase Center for NCBI Biotechnology Phản ứng chu i polimer hóa Ìnonrmation PCR RAPD Polymerase chain reaction Phản ứng chu i polymerase RDNAom Amplification Đa hình DNA nhân ngẫu of Polymorphic DNA nhiên rDNA DNA ribosome Riboxom ADN RNA Ribonucleic acid Ribonucleic Axit TAE Tris - Acetic – EDTA Tris - Acetic – EDTA 10 UV Untraviolet Tia cực tím DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Kết sàng lọc tối ƣu hóa nhiệt độ gắn mồi cặp mồi 30 Hình 3.2 Kết nhân đoạn gen16S rDNA sử dụng cặp mồi 32 Hình 3.3 Trình tự nucleotide chủng sequence với mồi F2/R2 33 Hình 3.4 Cây quan hệ di truyền chủng sequence với cặp mồi F2/R2 34 Hình 3.5 Trình tự nucleotide chủng sequence với mồi F4/R4 35 Hình 3.6 Cây quan hệ di truyền chủng sequence với cặp mồi F4/R4 36 Hình 3.7 Trình tự nucleotide chủng 15.1 với cặp mồi F2/R2 37 Hình 3.8 Cây quan hệ di truyền chủng 15.1 với cặp mồi F2/R2 39 Hình 3.9 Trình tự nucleotide chủng 15.1 với mồi F4/R4 40 Hình 3.10 Cây quan hệ di truyền chủng 15.1 với cặp mồi F4/R4 41 ĐẶT VẤN ĐỀ Trên giới có nhiều nghiên cứu vi khu n ứng dụng chúng, chúng tạo sản ph m đa dạng cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học y học nông nghiệp, nhƣ kháng khu n, kháng nấm, diệt côn trùng ức chế tuyến trùng thực vật, chống viêm, chống ung thƣ kháng virus Những nghiên cứu phân loại loài vi khu n cịn hạn chế nghiên cứu hình thái, sinh hóa, thử hoạt tính sinh hóa phức tạp, để ổn định phải yêu cầu điều kiện thí nghiệm nghiêm ngặt Theo truyền thống, phịng thí nghiệm vi sinh vật học lâm sàng quan y tế cơng cộng dựa vào phƣơng pháp kiểu hình để xác định vi khu n gây bệnh, nhƣng phƣơng pháp đƣợc sử dụng cho vi khu n nuôi cấy Các vi khu n phát triển chậm vi khu n có kiểu hình khơng phổ biến khiến cho việc xác định trở n n khó khăn tốn thời gian Hiện nay, việc sử dụng sinh học phân tử phân loại ch nh xác nhanh chóng Đối với vi khu n vùng gen 16S rDNA có nhiều ƣu điểm sử dụng rộng rãi định loại xác định quan hệ di truyền Gen 16S rDNA dài khoảng 1500 bp bao gồm chín vùng biến đổi (si u đƣợc đặt t n V1 đến V9, xen kẽ với vùng đƣợc bảo tồn Vì gen 16S rDNA diện tất vi khu n có tốc độ tiến hóa khác tùy thuộc vào vùng gen đƣợc xem xét, nên lịch sử, đƣợc sử dụng để phân loại dòng phân lập, gần mẫu phức tạp đến từ nhiều môi trƣờng khác nhau, chẳng hạn nhƣ nhƣ ruột ngƣời, đất … đƣợc sử dụng để xác định số lƣợng vi khu n thành phần mẫu Trên sở đó, chúng tơi thực đề tài: Định danh số chủng vi hu n ph n ập t i vƣờn Quốc gia Cát Tiên dựa t ên t nh tự nuc eotide gen 16S DNA” CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Một số th ng tin hệ vi hu n ất t i vƣờn Quốc gia Cát Tiên 1.1.1 Vườn Quốc gia Cát Tiên (VQGCT) Vƣờn Quốc gia Cát Tiên (VQGCT) nằm vùng chuyển tiếp từ cao nguyên xuồng đồng qua địa phận ba tỉnh: huyện Cát Tiên, Bảo Lâm (tỉnh Lâm Đồng); Bù Đăng tỉnh Bình Phƣớc ; Vĩnh Cửu, Tân Phú (tỉnh Đồng Nai) Chính vƣờn có nhiều dạng địa hình: từ núi cao, sƣờn dốc, đồi nhấp nhơ thềm sông phẳng, nhiều thác ghềnh, suối lớn vùng đầm lầy ngập nƣớc VQGCT cách thành phố Hồ Chí Minh 150 km với tổng diện tích 73878 ha, tài nguyên thiên nhiên phong phú, đa dạng Vƣờn Quốc gia lớn Việt Nam Hệ thực vật Vƣờn Quốc gia Cát Tiên có nhiều dạng sinh cảnh: rừng nguyên sinh thứ sinh tr n đất thấp ƣu loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae); rừng nửa rụng nguyên sinh thứ sinh đất thấp ƣu loài Lagertroemia sp đất ngập nƣớc trảng cỏ ngập nƣớc theo mùa ƣu loài Saccharum sp., rừng ngập lụt ƣu loài Hydrocarpus sp xen lẫn Ficus benjamina kiểu sinh cảnh thứ sinh nhƣ rừng tre nứa, trảng cỏ… Hệ thực vật ghi nhận 1362 loài thực vật bậc cao có mạch, số có 34 lồi có t n Sách Đỏ” Việt Nam nhiều lồi g có giá trị nhƣ gõ đỏ, xoay, c m lai, giáng hƣơng to Hệ ộng vật Theo thống kê ghi nhận 77 loài thú, 318 loài chim, 58 lồi bị sát, 26 lồi ếch nhái, 130 lồi cá Trong số có lồi thú lớn q số lồi có nguy đe dọa tuyệt chủng tồn cầu nhƣ t giác Java, bị sát, voi Châu Á, cá sấu nƣớc (Crocodylus siamensis); số loài chim đặc hữu nhƣ gà so cổ (Arborophila davidi), gà tiền mặt vàng (Polyplectron germani), số loài chim nƣớc quý nhƣ quằn cánh xanh (Pseudibis davisoni), ngan cánh trắng (Cairina scutulata), già đẫy nhỏ (Leptoptilos javanicus) Đối tƣợng bảo tồn rừng họ Dầu, hệ sinh thái đặc thù, loài tê giác, cá sấu, bị tót, lồi chim đặc hữu VQGCT thực kho tàng bách khoa toàn thƣ sống cho công tác nghiên cứu giới tự nhiên 1.1.2 Ảnh hưởng vi khuẩn đến thực vật Các vi khu n đa dạng giống loài chế tƣơng tác Những vi khu n phận quan trọng trình phát triển thực vật Mặc dù nghiên cứu vi khu n tƣơng tác thực vật chủ yếu tập trung vào vi sinh vật gây bệnh thực vật vi sinh vật cố định nito Tuy nhiên, mối quan tâm đa dạng vi khu n kích th ch sinh trƣởng thực vật gia tăng Và thực tế tự nhiên có nhiều loại vi khu n có khả k ch th ch sinh trƣởng thực vật, nhƣng chúng chiếm tỷ lệ nhỏ quần thể vi sinh vật Những vi khu n có vai trị quan trọng nơng nghiệp hay mơi trƣờng Những tiến kỹ thuật sinh thái di truyền vi sinh vật phát nhiều lồi vi khu n có ch, có tác động tích cực lên sinh trƣởng phát triển thực vật Vi khu n đƣợc chia làm hai nhóm: nhóm vi khu n có lợi cho thực vật nhóm vi khu n bất lợi cho thực vật Các vi khu n có lợi chiếm ƣu vi khu n kích thích sinh thực vật sinh trƣởng Việc tìm hiểu xác định chế khó khăn đa dạng chế Đối với vi khu n cố định đạm, k ch th ch sinh trƣởng thấy rõ sống tr n vùng đất nghèo đạm Đến khả k ch th ch sinh trƣởng thực vật đến đƣợc hiểu theo đƣờng chính:  Gia tăng lƣợng chất dinh dƣỡng dạng dễ sử dụng cho  Sản xuất phytohormone k ch th ch sinh trƣởng thực vật  Tăng cƣờng ảnh hƣởng có lợi tƣơng tác cộng sinh  Giảm tác động có hại mầm bệnh 1.1.2.1 Các vi khuẩn ức chế tác hại mầm bệnh lên thực vật (thường tìm thấy vi khuẩn nội sinh) Các vi khu n nội sinh bảo vệ khỏi công mầm bệnh chế sau: C nh tranh m i t ƣờng sống dinh dƣỡng Các endophyte thuộc nhóm có khả sinh sản nhanh chóng, chúng vƣợt qua số lƣợng mầm bệnh ức chế sinh sản nhƣ dinh dƣỡng mầm bệnh (ví dụ: số lồi nấm men, sinh sản cách nảy chồi khiến nấm men nhân lên số lƣợng cách nhanh chóng khiến nảy mầm bào tử B cinerea hoàn toàn bị ức chế) Sự tổng hợp lo i hợp chất thứ cấp Trong nhiều nghiên cứu ngƣời ta nhận thấy vi khu n nội sinh có sản sinh loại chất thứ cấp có hoạt tính kháng sinh chúng có khả ức chế tiêu diệt số loại nấm bênh Nhƣ trƣờng hợp loại kháng sinh tự nhiên Sporothrix ysloccolsa sản xuất là: heptadeceonic methyl – hepadecenoic có khả kháng khu n số loại nấm nhƣ: B cinerea, Fusarium oxysporum sp Urquhart Punja 2002 tinh chế ester acid béo với hoạt tính kháng nấm từ Tuietiopsis pallescens Emzyme phân hủy vách tế bào Nghiên cứu cho thấy vi khu n có khả sinh loại enzyme phân hủy thành lysis tế bào loại mầm bệnh nhƣ: emzyme chitinase, P – 1,3 – glucanase… Trong cơng trình Madhaiyan cộng 2004 chứng to mối tƣơng quan khả kháng bệnh lúa xử lý với vi khu n Methylobacterium sp gia tăng polyphenol oxidase [20] Kích thích phản ứng phịng vệ chủ Sự cảm ứng li n quan đến việc sản xuất số hợp chất nhƣ phenylalanine ammonia lyase phytoalexin, peroxidase ethylene mô tế bào thực vật 1.1.2.2 Vi khuẩn gia tăng dinh dưỡng cho Khả cố định nito (biến đổi nito thành amonia) chủ yếu giới hạn giới prokaryotes nhƣng đa dạng giống vi khu n Nằm số gần 100 loại cố định nito (diazotrophic), có vài loại có tính chun biệt cao, tƣơng tác mật thiết tạo quan hay quan có cấu trúc giống với quan chủ Tƣơng tác đạt cực đại chúng chuyển sang cố định nito cho chủ, theo cung cấp hợp chất giàu lƣợng cho hoạt động cố định nito Các vi khu n cố định đạm bao gồm vi khu n cộng sinh họ đậu, vi khu n tự cố định đạm, vi khu n lam… đặc hiệu thể băng DNA với k ch thƣớc khoảng gần 400 bp; cặp mồi F4/R4 F5/R5 ngồi băng DNA sáng rõ cịn xuất số băng phụ mờ Từ kết tr n cho thấy cặp mồi F4/R4 F5/R5 cần đƣợc tiếp tục tối ƣu hóa nhiệt độ gắn mồi, cặp mồi F1/R1 phù hợp với mục ti u định danh chủng vi khu n nghi n cứu với nhiệt độ gắn mồi th ch hợp 56C Hình 1C kết phản ứng PCR 02 cặp mồi F4/R4, F5/R5 nhiệt độ gắn mồi 60oC Với nhiệt độ gắn mồi 60oC, sản ph m PCR cặp mồi F4/R4 F5/R5 băng DNA sáng rõ xuất số băng phụ mờ Từ kết tr n cho thấy, cặp mồi F4/R4 F5/R5 chƣa tìm đƣợc nhiệt độ gắn mồi phù hợp Việc sử dụng cặp mồi nhân gen 16S rDNA tr n đối tƣợng vi khu n xuất th m vài sản ph m phụ b n cạnh sản ph m PCR ch nh Do đó, sử dụng cặp mồi mà sản ph m PCR bao gồm sản ph m phụ cần phải tinh lấy sản ph m PCR ch nh để tiến hành xác định trình tự Kết luận: Sàng lọc tối ƣu hóa nhiệt độ gắn mồi 02 cặp mồi F1/R1 F2/R2 với nhiệt độ gắn mồi tƣơng ứng 56oC 54oC Với cặp mồi F3/R3 khơng cho sản ph m PCR khơng phù hợp với nghi n cứu Cặp mồi F4/R4 F5/R5 đƣợc thử nghiệm ba nhiệt độ gắn mồi khác 54oC, 56oC, 60oC nhƣng kết không xuất sản ph m PCR đặc hiệu mà bao gồm số băng sản ph m PCR phụ Do đó, 02 cặp mồi F4/R4 F5/R5 lựa chọn nhiệt độ gắn mồi 56oC nhiệt độ sản ph m phụ phản ứng PCR xuất t thể băng mờ tr n hình 1B Dựa tr n kết định danh chủng vi khu n thuộc đề tài, chúng tơi nhận thấy cặp mồi F2/R2 F4/R4 có hiệu định danh tốt chƣa công bố , chúng tơi lựa chọn 02 cặp mồi để phục vụ định danh 02 chủng vi khu n Sequence 15 3.3 Kết nhân o n gen 16S rDNA sử dụng cặp mồi lựa chọn Sau sàng lọc tối ƣu hóa nhiệt độ gắn mồi cặp mồi thành cơng chúng tơi chọn 02 cặp mồi F2/R2 F4/R4 với nhiệt độ gắn mồi Ta = 54C để tiến hành nhân đoạn gen 16S rDNA Từ mẫu DNA tổng số tách đƣợc từ chủng vi khu n Sequence S 15 1, sử dụng cặp mồi đặc hiệu để tiến hành phản ứng 31 PCR nhân đoạn DNA Kết PCR cho thấy hai mẫu DNA tách chiết từ hai chủng vi khu n đƣợc nhân thành công Phản ứng PCR đƣợc thực với thành phần chu kỳ nhiệt phù hợp: chu trình nhiệt: 94C: phút (-94C: 30 giây, 56C: 30 giây, 72C: 30 giây) x 35 chu kỳ -72C: phút Thành phần phản ứng gồm: 2X PCR marter mix, dH2O deion, DNA (sequence, 15.1), cặp mồi (F2/R2; F4/R4) Sản ph m PCR tất mẫu thí nghiệm đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1,0% Hình 3.2 Kết nhân đoạn gen16S rDNA sử dụng cặp mồi (A): Cặp mồi F2/R2; (B): Cặp mồi F4/R4; M: DNA marker (A: marker 100bp; B: marker 1000bp) Qua hình 3.2.A cho thấy kết điện di sản ph m PCR đoạn gen 16S DNA với cặp mồi F2/R2 khuếch đại thành công 02 chủng vi khu n Ở mẫu thu đƣợc băng DNA sáng rõ nét, khơng có băng DNA phụ xuất hiện, k ch thƣớc khoảng 300bp phù hợp với k ch thƣớc lý thuyết đoạn gen F2/R2 dự kiến nhân Kết tƣơng tự đƣợc quan sát thấy lần PCR thứ thứ Kết khẳng định phƣơng pháp tách chiết DNA từ vi khu n mà sử dụng hoàn toàn phù hợp, nồng độ DNA thu đƣợc thấp nhƣng hoàn toàn đủ ti u chu n làm khuôn để thực thành công phản ứng PCR Sản ph m PCR nhân đoạn gen 16S rDNA sử dụng cặp mồi F2/R2 đặc hiệu sử dụng trực tiếp sản ph m để xác định trình tự nucleotide phục vụ định danh chủng vi khu n nghi n cứu Kết điện di sản ph m PCR cho thấy, đoạn gen F4/R4 khuếch đại thành 32 công 02 mẫu vi khu n Sequence S 15 Ở mẫu thu đƣợc băng DNA sáng rõ nét với k ch thƣớc gần 1000 bp phù hợp với k ch thƣớc lý thuyết đoạn gen F4/R4 dự kiến nhân Hình B vài băng DNA phụ sản ph m nhân không đặc hiệu cặp mồi F4/R4 Do cặp mồi F4/R4 xuất băng phụ nên tiến hành cắt gel thu lấy băng DNA ch nh có k ch thƣớc gần 1000 bp, sau sử dụng phƣơng pháp thơi gel để tinh sản ph m PCR Sản ph m PCR sau đƣợc tinh đƣợc dùng để xác định trình tự nucleotide 3.4 Định danh chủng Sequence dựa trình tự nucleotide o n gen 16S rDNA 3.4.1 Định danh chủng Sequence dựa trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F2/R2 Theo t nh toán lý thuyết, sản ph m PCR nhân đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F2/R2 có k ch thƣớc khoảng 300bp Tuy nhi n, sau giải trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F2/R2 chủng Sequence (S) thu đƣợc đoạn trình tự có k ch thƣớc 274bp để phân t ch so sánh Trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F2/R2 chủng sequence đƣợc thể hình 3.3 Hình 3.3 Trình tự nucleotide chủng sequence với mồi F2/R2 Sử dụng cơng cụ BLAST tr n NCBI để so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA chủng Sequence với trình tự tƣơng đồng tr n ngân hàng gen cho thấy chủng Sequence tƣơng đồng 100% với loài vi khu n có t n khoa học Escherichia coli Lựa chọn 03 lồi có trình tự đoạn gen 16S rDNA tƣơng đồng cao với chủng Sequence 01 loài vi khu n có độ tƣơng đồng thấp nhƣ bảng để xây dựng quan hệ di truyền chủng Sequence 04 mẫu nhƣ hình 33 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự đoạn gen S rDNA tương đồng với trình tự gen 16S rDNA với mồi F2/R2 chủng sequence ngân hàng gen NCBI STT Tên lồi Kí hiệu Tỷ lệ tƣơng ồng Escherichia coli(1) MN712503.1 100% Escherichia coli(2) MH880133.1 100% Escherichia coli(3) MK342573.1 100% Orientocreadium sp MK342573.1 99,24% Kết so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F2/R2 chủng sequence với trình tự đoạn gen 16S rDNA lồi Escherichia coli (MN712503.1) cho thấy mức độ tƣơng đồng đạt 100% Chủng sequence nghi n cứu có quan hệ gần với lồi Orientocreadium sp (MK342573.1 Hình thể mối quan hệ di truyền gần chủng Sequence nghi n cứu với loài Escherichia coli ngân hàng gen Quốc tế đƣợc nhóm thành nhóm tr n quan hệ di truyền với mức độ tƣơng đồng 100% Từ kết kết luận chủng Sequence nghi n cứu có t n khoa học Escherichia coli sử dụng cặp mồi F2/R2 Hình 3.4 Cây quan hệ di truyền chủng sequence với cặp mồi F2/R2 34 3.4.2 Định danh chủng Sequence dựa trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F4/R4 Theo t nh toán lý thuyết, sản ph m PCR nhân đoạn gen 16S rDNA với mồi F4/R4 có k ch thƣớc khoảng 1000 bp Tuy nhi n, sau giải trình tự nucleotide, kết thu đƣợc đoạn trình tự có k ch thƣớc 748bp Nguy n nhân phần hai đầu đoạn gen 16S rDNA đƣợc nhân với cặp mồi F4/R4 có chất lƣợng giải trình tự khơng tốt n n chúng tơi sử dụng đoạn trình tự có k ch thƣớc 748 bp để phân t ch so sánh Trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA chủng Sequence đƣợc thể hình 3.5 Hình 3.5 Trình tự nucleotide chủng sequence với mồi F4/R4 Sử dụng trình tự đoạn gen 16S rDNA đƣợc nhân với cặp mồi F4/R4 chủng Sequence để so sánh với trình tự tƣơng đồng tr n ngân hàng gen quốc tế Kết cho thấy chủng Sequence có tƣơng đồng cao với loài Escherichia coli 35 97,22% Lựa chọn 03 lồi có trình tự đoạn gen 16S rDNA tƣơng đồng cao với chủng Sequence 01 loài tƣơng đồng thấp nhƣ bảng để xây dựng quan hệ di truyền So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA đƣợc nhân với cặp mồi F4/R4 chủng Sequence với trình tự tƣơng đồng tr n ngân hàng gen cho thấy chủng Sequence tƣơng đồng cao 97 22% với chủng vi khu n có t n khoa học Escherichia coli (MN704519.1, MN704519.1, MN704513.1) có sai khác nhỏ với loài Shigella dysenteriae (CP026842.1) 94,55% với giá trị bootstrap 100% Kết so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F4/R4 chủng sequence với trình tự đoạn gen 16S rDNA loài Escherichia coli (MN704513 cho thấy mức độ tƣơng đồng đạt 97 22% sai khác 06 nucleotide Bảng 3.2 Một số lồi có trình tự đoạn gen gen S rDNA tương đồng với trình tự S rDNA đư c nhân với cặp mồi F4/R4 chủng Sequence ngân hàng gen NCBI STT Tên lồi Escherichia coli(1) Escherichia coli(2) Escherichia coli(3) Shigella dysenteriae Kí hiệu MN704526.1 MN704519.1 MN704513.1 CP026842.1 Tỷ lệ tƣơng ồng 97,22% 97,22% 97,22% 94,55% Hình 3.6 Cây quan hệ di truyền chủng sequence với cặp mồi F4/R4 36 Kết luận Từ kết so sánh xây dựng quan hệ di truyền chủng Sequence nghi n cứu dựa tr n trình tự nucleotide hai đoạn gen 16S rDNA đƣợc nhân 02 cặp mồi F2/R2 F4/R4 khẳng định chủng Sequence nghi n cứu có t n khoa học Escherichia coli Hiệu định danh hai chủng vi khu n nghi n cứu cặp mồi F2/R2 tổt so với cặp mồi F4/R4 Nhận định thể mức độ tƣơng đồng 100% trình tự đoạn gen 16S rDNA nhân với cặp mồi F2/R2 chủng Sequence với loài Escherichia coli, với cặp mồi F4/R4 mức độ tƣơng đồng đạt 97,2% Tuy nhi n, việc sử dụng ri ng rẽ cặp mồi chƣa đạt đƣợc độ ch nh xác mà kết hợp nhiều cặp mồi với Sử dụng trình tự nucleotide gen 16S rDNA với cặp mồi đặc hiệu để định danh lồi nói chung vi khu n nói ri ng chứng minh có độ tin cậy cao đƣợc kết hợp với phƣơng pháp định danh truyền thống độ ch nh xác đạt đến 100% 3.5 Định danh chủng 15.1 dựa trình tự nucleotide o n gen 16S rDNA 3.5.1 Định danh chủng 15.1 dựa trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNAvới cặp mồi F2/R2 Theo t nh toán lý thuyết, sản ph m PCR nhân đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F2/R2 có k ch thƣớc gần 300bp Tuy nhi n, sau giải trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F2/R2 chủng 15 chúng tơi thu đƣợc đoạn trình tự có k ch thƣớc 268bp để phân t ch so sánh Trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F2/R2 chủng 15 đƣợc thể hình 3.7 Hình 3.7 Trình tự nucleotide chủng 15.1 với cặp mồi F2/R2 37 Sử dụng công cụ BLAST tr n NCBI để so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA chủng 15 với trình tự tƣơng đồng tr n ngân hàng gen quốc tế Kết cho thấy chủng 15 tƣơng đồng 99,61% với lồi vi khu n có t n khoa học Acinetobacter johnsonii Lựa chọn 04 lồi có trình tự đoạn gen 16S rDNA tƣơng đồng cao với chủng 15 01 lồi vi khu n có độ tƣơng đồng thấp nhƣ bảng 3 để xây dựng quan hệ di truyền chủng 15 05 mẫu nhƣ hình Bảng 3.3 Một số lồi có trình tự đoạn gen S rDNA tương đồng với trình tự gen 16S rDNA với mồi F2/R2 chủng 15.1 ngân hàng gen NCBI STT Tên lồi Kí hiệu Tỷ lệ tƣơng ồng Acinetobacter johnsonii MN826586.1 99,61% Acinetobacter johnsonii(2) MN826149.1 99.61% Acinetobacter bouvetii MT478039.1 99,61% Elaeis guineensis KJ830522.1 78,84% Kết so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi F2/R2 chủng 15 với trình tự đoạn gen 16S rDNA loài Acinetobacter johnsonii (MN826586.1 cho thấy mức độ tƣơng đồng đạt 99 61% Hình thể mối quan hệ di truyền gần chủng 15 nghi n cứu với loài thuộc chi Acinetobacter tr n ngân hàng gen Quốc tế đƣợc nhóm thành nhóm tr n quan hệ di truyền với giá trị bootstrap 100% Từ kết kết luận chủng 15 nghi n cứu có t n khoa học Acinetobacter johnsonii sử dụng cặp mồi F2/R2 38 Hình 3.8 Cây quan hệ di truyền chủng 15.1 với cặp mồi F2/R2 3.5.2 Định danh chủng 15.1 dựa trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNAvới cặp mồi F4/R4 Theo t nh toán lý thuyết, sản ph m PCR nhân đoạn gen 16S rDNA với mồi F4/R4 có k ch thƣớc khoảng 1000bp Tuy nhi n, sau giải trình tự nucleotide, kết thu đƣợc đoạn trình tự có k ch thƣớc 748bp Nguy n nhân phần hai đầu đoạn gen 16S rDNA với mồi F4/R4 có chất lƣợng giải trình tự khơng tốt n n chúng tơi sử dụng đoạn trình tự có k ch thƣớc 748bp để phân t ch so sánh Trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA với mồi F4/R4 chủng 15 đƣợc thể hình 3.9 39 Hình 3.9 Trình tự nucleotide chủng 15.1 với mồi F4/R4 Sử dụng trình tự đoạn gen 16S rDNA với mồi F4/R4 chủng 15 để so sánh với trình tự tƣơng đồng tr n ngân hàng gen quốc tế Kết cho thấy chủng 15 có tƣơng đồng cao với loài Acinetobacter johnsonii 98,52% Lựa chọn 04 lồi có trình tự đoạn gen 16S rDNA với mồi F4/R4 tƣơng đồng cao với chủng 15.1 01 lồi vi khu n có độ tƣơng đồng thấp nhƣ bảng để xây dựng quan hệ di truyền chủng 15 04 lồi nhƣ hình 3.10 Bảng 3.4 Một số lồi có trình tự đoạn gen S rDNA tương đồng với trình tự gen 16S rDNA với mồi F4/R4 chủng 15.1 ngân hàng gen NCBI STT Tên lồi Kí hiệu Tỷ lệ tƣơng ồng Acinetobacter johnsonii MT145529.1 98,52% Acinetobacter johnsonii(2) MT145509.1 98,52% Acinetobacter bouvetii MT478039.1 98,52% Helicobacter pylori DQ198799.1 71,57% 40 So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA đƣợc nhân với cặp mồi F4/R4 chủng 15 với trình tự tƣơng đồng tr n ngân hàng gen cho thấy chủng 15 tƣơng đồng cao 98 52% với chủng vi khu n có t n khoa học Acinetobacter johnsonii ( MT145529.1); Acinetobacter johnsonii(2) (MT145509.1); Acinetobacter bouvetii (MT478039.1) có sai khác với lồi Helicobacter pylori (DQ198799.1) (với khoảng cách di truyền > 0,50) Kết so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA chủng 15 với trình tự đoạn gen 16S rDNA lồi Acinetobacter johnsonii ( MT145529.1) cho thấy mức độ tƣơng đồng đạt 98 52% sai khác 07 nucleotide Hình 3.10 Cây quan hệ di truyền chủng 15.1 với cặp mồi F4/R4 Kết luận Từ kết so sánh xây dựng quan hệ di truyền chủng 15 nghi n cứu dựa tr n trình tự nucleotide hai đoạn gen 16S rDNA đƣợc nhân 02 cặp mồi F2/R2 F4/R4 khẳng định chủng 15.1 nghi n cứu có t n khoa học Acinetobacter johnsonii Kết hợp kết định danh hai chủng vi khu n Sequence 15 thấy hiệu định danh cặp mồi F2/R2 tổt so với cặp mồi F4/R4 41 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết uận - Tách chiết thành công DNA tổng số từ 02 mẫu vi khu n sử dụng tr n kit tinh sản ph m PCR InTron- Hàn Quốc Hàm lƣợng DNA tổng số không cao nhƣng đủ ti u chu n để thực phản ứng PCR - Lựa chọn đƣợc 02 cặp mồi F2/R2 F4/R4 để nhân đoạn gen 16S rDNA phục vụ mục ti u định danh chủng vi khu n nghi n cứu xác định đƣợc nhiệt độ gắn mồi tối ƣu 02 cặp mồi F2/R2 F4/R4 Ta = 54C - Nhân thành công 02 đoạn gen 16S rDNA sử dụng 02 cặp mồi đặc hiệu F2/R2 F4/R4 - Giải trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA đƣợc nhân với cặp mồi F2/R2 F4/R4 chủng Sequence chủng 15 phục vụ cho việc định danh loài - Định danh đƣợc 02 chủng vi khu n chủng Sequence chủng 15 sử dụng đoạn gen 16S rDNA với 02 cặp mồi đặc hiệu F2/R2 F4/R4 Trong đó, chủng Sequence lồi Escherichia coli chủng 15 loài Acinetobacter johnsonii - Hiệu định danh chủng vi khu n cặp mồi F2/R2 tốt so với cặp mồi F4/R4 4.2 Kiến nghị Cơng bố trình tự nucleotide đoạn gen 16S rDNA chủng Sequence chủng 15 l n ngân hàng gen Quốc tế làm sở liệu phục vụ giám định loài nghi n cứu li n quan Sử dụng cặp mồi F2/R2 F4/R4 để nhân phân t ch trình tự nucleotide gen 16S rDNA phục vụ định danh vi khu n 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Văn An, Nguyễn Thái Sơn, Đinh Thị Thu Hằng 2015 , Thiết kế tối ƣu hóa phản ứng multiplex pcr ch n đốn đồng thời vi khu n than vi khu n dịch hạch”, Tạp chí y - Dƣợc học quân số 4, 67-71 Nguyễn Đức Lƣợng 2002 , Th nghiệm Cơng nghệ Sinh học, tập 2, Thí nghiệm ci sinh học”, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh, 3-67, 260-291, 445 L Thị Hồng Minh, Vũ Thị Quy n , Nguyễn Mai Anh1, Đoàn Thị Mai Hƣơng , Brian T Murphy , Châu Văn Minh , Phạm Văn Cƣờng 1026 , Phân lập, sàng lọc định danh chủng vi sinh vật có hoạt t nh kháng sinh từ vùng biển đông bắc Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 539-547 Trần Thị Na , Nguyễn Hoàng Anh 2017 , Tuyển chọn định danh vi khu n Bacillus có khả sinh enzyme -galactosidase chịu nhiệt”, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2017, 1070-1076 Kiều Phƣơng Nam 2005 , Phân lập, định danh khảo sát tác động vi khu n Methylobacterium sp Lên phát sinh hình thái thực vật”, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhi n, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Pha, Nguyễn Hữu Hiệp 2012 , Khảo sát vùng gen 16s rDNA số dịng vi khu n có khả cố định đạm đất vùng rễ lúa tỉnh Đồng Tháp”, Tạp chí Khoa học 184-192 Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thế Quyết , Hà Viết Cƣờng, Phạm Xuân Hội (2019), Phân lập, định danh chủng vi khu n chịu mặn, có hoạt t nh phân giải lân vơ cho vùng Đồng sông Cửu Long”, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa học Nông nghiệp Tràm Linh Thƣớc 2002 , Phƣơng pháp phát triển vi sinh vật nƣớc, thực ph m mỹ ph m”, Nhà xuất Giáo dục, 43-100 Tràm Linh Thƣớc 2002 , Thực tập vi sinh vật học”, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh, 418-462 10 Huỳnh Thị C m Tiên, Hồ Viết Thế 2019 , Phân lập định danh số chủng bacillus spp có hoạt t nh cao tầng đất mặt đƣợc thu thập từ tỉnh Bình 43 Thuận” Trƣờng Đại học Cơng nghệ TP.HCM, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thực ph m 48-62 11 L Xuân Trƣờng, Nguyễn Vũ Uy n 2014 , khảo sát giá trị xét nghiệm định danh vi khu n bệnh nhân nhiễm khu n mắt dựa tr n đoạn gen 16s rDNA”, Y Học TP Hồ Chí Minh, Tập 18, Phụ Số 12 Báo cáo tổng kết Đề tài Khoa học cấp Nhà nƣớc KHCN.02.07B (1996- 2000): Nghiên cứu công nghệ vi sinh (vi khu n, nấm, virut để sản xuất chế ph m sinh học bảo vệ thực vật phòng trừ sâu hại trồng TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH 13 Baharum S.N (2012) Application of 16S rDNA DNA cytochrome b ribosomal markers in studies of lineage ADN fish populations structure of aquatic species Molecular biology reports 39 (5): 5225-5232 14 Daniela B., Paola C., Lorenzo B., Fabio Q., Milena B., Daniele D., Piero A., (2009), Endophytic bacterial diversity in grapevine (Vitis vinifera L.) leaves described by 16S-rDNA gene sequence analysis and length heterogeneity-PCR, Journal of Microbiology, 47, pp 393 - 401 15 Henegariu O, Heerema N A, Dlouhy S R et al Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol Biotechniques 1997, 23 (3), pp.504-511 16 Koenig R L, Moris R o , Polacci J c 2002 tRNA is urie source of low – level trans-zeatin production in Methylobacterium spp”, Journal of bacteriology, vol 184, No.7, pp 1832-1842 17 Koto Y , Ashara M , Arai D , Goto K , Vokota A 2005 , Reclassitication of Methylobacterium dichloromethaneicum as a subjective synonyms Methylobacterium extorquens and of Methylobacterium rhodesiamorria” J Gen Appl Microbiol, vol.51, pp, 287-289 18 Kumar S., Stecher G., Tamura K (2015) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729 19 Laurie Vingataramin and Eric H Froct 2015 , A single protocol for extraction of gDNA from bacteria and yeast”, Université de Sherbrooke, Sherbooke, Quebec, Canada BioTechniques 58:120-125 20 Madhaiyan M., Poonguzhali s., Lee H.S., Hải K., Sundaram S.P., Sa T.M 44 2005 , Pink-pigmented isacultative methylotrophic bacteria accelerate germination, growusi and yied ò sugarcane clone Co86032 (Saccharum oficinarum L.), Biol Fertil Soils, 41: 350-358 21 Mignard S , Flandrois JP, 2006, 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment, J Microbiol Methods, 67(3).574-81 22 Monstein H, Nikpour-Badr S, and Jonasson J Rapid molecular identification and subtyping of Helicobacter pylori by pyrosequencing of the 16S rDNA variable V1 and V3 regions FEMS Microbiol Lett 2001; 199(1): 103-107 23 Omer Z , s Tombolini R , Gerhardson B , 2004 , Plant colonization by pink – pigmented isacultative menitylotxophic bacteria PPFMs ”, FEMS Mcrobiolgy Ecology 47: 319-326 24 Safari Foroshani N, Karami A, Pourali F Simultaneous and rapid detection of Salmonella typhi, Bacillus anthracis, and Yersinia pestis by using multiplex polymerase chain reaction (PCR) Iran Red Crescent Med J 2013, 15, pp.e9208 25 Vesey J K, 2003 Plant growusi promoting rhizobacteria as biofertilizers” Plant Soil, 255, 571-586 45