Octylphenol polyethoxylate (OPEOn) có tên công nghiệp là Triton X-100, là hợp chất hoạt động bề mặt do con người tổng hợp, nó có khả năng tẩy rửa, phân tán và nhũ hóa rất tốt vì thế được sử dụng rộng rãi trong nhiều sản phẩm công nghiệp như sơn, bột giấy, vải, thuốc trừ sâu... Chúng có thể “ngụy trang” thành các nội tiết tố (hormone) tự nhiên và do đó nó có khả năng hoạt động như các chất phá hủy hệ thống nội tiết của sinh vật thủy sinh.
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY OCTYLPHENOL POLYETHOXYLATE (OPEOn) TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngô Thị Kim Ngân*, Nguyễn Yến Nhi, Trương Xuân Trung Trường Đại học Tôn Đức Thắng *Tác giả liên lạc: kimngan281097@gmail.com TĨM TẮT Octylphenol polyethoxylate (OPEOn) có tên cơng nghiệp Triton X-100, hợp chất hoạt động bề mặt người tổng hợp, có khả tẩy rửa, phân tán nhũ hóa tốt sử dụng rộng rãi nhiều sản phẩm công nghiệp sơn, bột giấy, vải, thuốc trừ sâu Chúng “ngụy trang” thành nội tiết tố (hormone) tự nhiên có khả hoạt động chất phá hủy hệ thống nội tiết sinh vật thủy sinh Ngày nay, tác động khơng mong muốn hóa chất lên sức khỏe người quan tâm hướng xử lí thường ưu tiên biện pháp xử lý sinh học Trong nguyên cứu này, phân lập 18 chủng vi khuẩn gram âm có khả phân hủy OPEOn từ ba nguồn mẫu bao gồm đất nơng nghiệp, nước sơng bùn sơng Trong đó, chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng phát triển cao chọn lọc, giải trình tự để định danh Klebsiella variicola S9, Klebsiella sp B12 Klebsiella variicola W2 Các trình tự đưa lên ngân hàng liệu genebank với số accession numbers MH578615; MH578616 MH578617 Từ khóa: Chất hoạt động bề mặt, Octylphenol Polyethoxylate, Triton X-100 ISOLATION AND IDENTIFICATION OF OCTYLPHENOL POLYETHOXYLATE (OPEOn) - BIODEGRADING BACTERIA TRAINS IN HO CHI MINH CITY Ngo Thi Kim Ngan*, Nguyen Yen Nhi, Truong Xuan Trung Ton Duc Thang University *Corresponding Author: kimngan281097@gmail.com ABSTRACT Octylphenol polyethoxylate (OPEOn) is a synthetic surfactant compound, which has the ability to cleanse, disperse, and emulsify very well so it is widely used in many industrial products such as paints, pulp and cloth, pesticides They can “camouflage” into the natural hormones and therefore are capable of acting as endocrine disrupters of aquatic animals Todays, the unwanted effects of chemicals on human health have been the subject of concern and the direction of treatment often prioritizes biological treatments In this study, we isolated 18 gram-negative bacterial strains capable of decomposing OPEOn from three sources including agricultural land, river water and river mud Three of the highest growth and developmental strains were selected for sequencing namely Klebsiella variicola S9, Klebsiella sp B12 and Klebsiella variicola W2 The sequences were posted to Genebank data with accession numbers as MH578615, MH578616 and MH578617 Keywords: Biodegradable, Octylphenol Polyethoxylate, Triton X-100 121 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 MỞ ĐẦU Alkylphenol ethoxylate chất hoạt động bề mặt không chứa ion, bao gồm nhóm alkylphenol phân nhánh kết hợp với chuỗi ethoxylate (Hình 1) Các alkylphenol sử dụng nonylphenol (NP) octylphenol (OP) với nonylphenol ethoxylates (NPEOn) chiếm khoảng 80% thị trường giới octylphenol ethoxylates (OPEOn) chiếm 20% lại (White et al., 1994) Sản lượng chất hoạt động bề mặt toàn giới năm 2008 13 triệu Trong năm 2014, thị trường giới chất hoạt động bề mặt đạt khối lượng 33 tỷ đô la Mỹ Các nhà nghiên cứu thị trường mong đợi doanh thu hàng năm tăng 2,5% năm lên khoảng 40,4 tỷ đô la Mỹ năm 2022 (Alexander Stark, 2017) Chiều dài chuỗi ethoxylate thay đổi từ đến 50 đơn vị ethoxy, tùy thuộc vào ứng dụng (A Michael Warhurst, 1995) Ký hiệu “X” “Triton X-100” bắt nguồn từ octylphenol trùng ngưng với ethylene oxide Số (“-100”) liên quan đến số đơn vị ethylene oxide cấu trúc X100 chứa 9,5 đơn vị ethylene oxide phân tử, với trọng lượng phân tử trung bình 625 Cấu trúc OPEO với X gần 9.5 (Chen et al 2005) OPEOn tồn nguồn nước nhà máy, nước thải sinh hoạt khu dân cư, đất nông nghiệp gây hậu nặng Kỷ yếu khoa học nề không cho sinh vật nước mà cho người Phát triển nghiên cứu phương pháp hiệu quả, đơn giản, khơng tốn nhiều chi phí, khơng gây ảnh hưởng mặt sức khỏe người để xử lí OPEOn điều hồn tồn hợp lý cần thiết Việt Nam Nhiều nghiên cứu cho q trình loại bỏ OPEOn mơi trường tiến hành OPEOn bị phân hủy mơi trường thủy sinh phương pháp hóa học sử dụng xạ siêu âm để công chuỗi ethoxylated (EO) vòng thơm (Chen et al., 2005) Tuy nhiên, kỹ thuật đòi hỏi thiết bị đắt tiền với quy trình vận hành phức tạp điều hạn chế việc áp dụng chúng thực tiễn Chúng ta ngày quan tâm đến tác động khơng mong muốn chất hóa học lên sức khỏe người nên hướng xử lí mơi trường với biện pháp sinh học không gây hại cho sinh vật nên quan tâm so với biện pháp xử lí hóa học tốn Phương pháp phân hủy sinh học OPEOn cách sử dụng dòng vi khuẩn tiến hành giới coi giải pháp hữu hiệu tốn cho trình xử lý Tuy nhiên, Việt Nam nghiên cứu phân hủy OPEOn thiếu nên ta phải nghiên cứu phát triển phương pháp Việt Nam Hình Cấu trúc phân tử OPEOn VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chất hoạt động bề mặt môi trường nuôi cấy vi khuẩn Chất hoạt động bề mặt OPEOn (tên thương mại, Triton X-100) mua từ VWR Chemical Co (Pháp) với độ tinh khiết 98% vật liệu để 122 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 đánh giá phân hủy sinh học vi khuẩn Cấu trúc phân tử Triton X100 thể hình Tất chủng thử nghiệm nghiên cứu ni cấy mơi trường M9 có chứa Triton X-100 nguồn cacbon Thành phần 1L M9 stock 10X bao gồm 75.2 g Na2HPO4.2H2O, 30g K2HPO4, 5g NH4Cl, g NaCl Tất hóa chất mua từ Cơng ty Hóa chất Merck (Darmstadt, Đức) với độ tinh khiết 98– 99,5% Môi trường tăng trưởng chất pha loãng cho dung dịch tiệt trùng cách hấp tiệt trùng (121oC, 15 phút) cho thí nghiệm ni cấy Nguồn vi khuẩn Các chủng vi khuẩn nghiên cứu nghiên cứu phân lập từ mẫu đất nơng nghiệp, nước sơng bùn sơng, nơi có mức độ nhiễm cao Thành phố Hồ Chí Minh Để sàng lọc chủng vi khuẩn phân hủy Triton X-100 từ mẫu môi trường bị ô nhiễm, 0.1% Triton X-100 thêm vào môi trường M9 nguồn cacbon Sự tăng sinh tiến hành cách chuyển phần mười môi trường ni cấy sang mơi trường mới, lặp lại lần Sau nuôi cấy phù hợp với nồng độ Triton X-100, tốc độ tăng trưởng vi khuẩn tăng lên, nồng độ Triton X-100 tăng lên 0.5% Sự phát triển vi khuẩn nồng độ Triton X-100 cho tất chủng đánh giá Phân lập xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn Chọn lọc chủng vi khuẩn phát triển mạnh có hình thái khuẩn lạc khác để tiếp tục nghiên cứu Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc nhuộm gram để quan sát đặc điểm chủng vi khuẩn Soi kính hiển vi nhúng dầu với độ phóng đại 100X Phương pháp phân tích Kỷ yếu khoa học Máy quang phổ (6705 UV/VIS, Jenway, Anh) sử dụng để đo phát triển vi khuẩn cách sử dụng độ hấp thụ OD 600 nm để ước tính mức độ phát triển Các chủng giải trình tự định danh Trình tự Nucleotide đoạn rDNA khuếch đại tìm kiếm GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ blast.cgi) chỉnh cách sử dụng Bioedit ClustalX Đưa trình tự lên ngân hàng genebank Tạo phân lồi với chủng có khả phân hủy Triton X-100 Njplot Xác định khả phân hủy Octylphenol Polyethoxylate Đo full scan mẫu môi trường M9+0.5% Triton X-100 trước nuôi cấy mẫu nuôi cấy Tất mẫu trước đo full scan ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết phân lập vi khuẩn Sau 36 giờ, mẫu nước sơng, khuẩn lạc đa số có dạng vết, phẳng, màu trắng đục, đường kính khoảng 3-4mm, số có hình trịn, nhỏ, lồi, màu trắng đục, không đều, mật độ thưa Trong mẫu đất nơng nghiệp, khuẩn lạc có dạng hình trịn, màu trắng đục, không đều, lồi, mật độ thưa Và mẫu bùn sơng, khuẩn lạc có dạng hình trịn, nhỏ, màu trắng đục, không đều, lồi, mật độ dày Sự phát triển chủng vi khuẩn ghi lại qua 24 giờ, 36 48 Nhìn vào biểu đồ, thấy chủng vi khuẩn khác có phát triển khác Từ đó, sàng lọc vi khuẩn có phát triển cao nhất: 1.2, 1.9,1.13 mẫu đất, 2.2, 2.4, 2.12 mẫu bùn sông 3.2, 3.6, 3.11 mẫu nước sông 123 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học Đường cong tăng trưởng vi khuẩn ∆OD (600nm) Đường cong tăng trưởng số chủng vi khuẩn phân lập 1.5 1.2 1.9 0.5 1.13 14 27 Time (days) 35 39 2.2 2.4 Hình Đồ thị thể đường cong tăng trưởng chủng vi khuẩn lọc từ mẫu đất nông nghiệp (1.2, 1.9, 1.13), mẫu bùn sông (2.2, 2.4, 2.12) mẫu nước sơng (3.2, 3.6, 3.11) Nhìn vào biểu đồ, thấy MH578615; 2.12: MH578616; 3.2: tăng trưởng mạnh mẽ số MH578617 tương ứng với Klebsiella chủng vi khuẩn Trong đó, mẫu đất variicola S9, Klebsiella sp B12, nông nghiệp, mẫu 1.2 có phát triển Klebsiella variicola W2 cao nhất, đạt 1.2 600nm, Kết khả phân hủy tiếp mẫu 1.13 1.2 Octylphenol Polyethoxylate đạt khoảng 0.5 0.35 Ở mẫu bùn Có thể thấy rằng, sau ni cấy 14 sơng, chủng vi khuẩn có phát triển ngày, hàm lượng Triton có sụt giảm cao 2.12 với OD 1.2, rõ rệt Môi trường ban đầu có OD mẫu cịn lại 2.2 2.4 đạt 0.78, nhiên sau cho vi khuẩn 0.87 0.32 Ở mẫu đất, chủng vi vào ni cấy 14 ngày OD 0.28 khuẩn có phát triển khác Kết luận: Chủng vi khuẩn nuôi với mẫu 3.2, 3.6 3.11 cấy có khả phân hủy Triton X1.05, 0.92 0.82 Dựa vào đó, 100 chọn lọc chủng vi khuẩn có phát triển cao đường biểu diễn KẾT LUẬN có xu hướng lên mẫu 1.9, 2.12, Các chủng vi khuẩn phân lập 3.2 để giải trình tự định danh vi khuẩn Gram âm, sàng lọc từ mẫu đất nông nghiệp, nước sông Kết đặc điểm vi khuẩn Các chủng vi khuẩn chọn lọc bùn sông, nơi có mức độ nhuộm gram quan sát hình nhiễm cao Trong nghiên cứu này, từ thái Kết sau quan sát 18 chủng vi khuẩn phân lập được, kính hiển vi độ phóng đại 100X Các chủng vi khuẩn phát triển mạnh chủng vi khuẩn chọn lọc có hình giải trình tự, định danh thái khác thuộc Gram âm Klebsiella variicola S9, Klebsiella sp B12, Klebsiella variicola W2 Trình tự Kết định danh Trình tự gen 16S rRNA xác định chủng đưa lên ngân nghiên cứu gửi vào sở hàng Genebank với số accession liệu ngân hàng gen NCBI numbers MH578615, accession number: 1.9: MH578616 MH578617 124 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Các chủng vi khuẩn phân lập có khả phân hủy Triton X-100 phát triển mạnh điều kiện phát triển bình thường (nhiệt độ phịng, khơng lắc), hóa chất sử dụng cho mơi trường ni cấy dễ tìm chi phí thấp Điều tạo điều kiện thuận lợi cho Kỷ yếu khoa học việc ứng dụng nghiên cứu vào thực tiễn để xử lý vấn đề môi trường tương lai Việc sử dụng vi khuẩn trình phân hủy sinh học Triton X-100 không hiệu mặt chi phí mà cịn đảm bảo an tồn mặt sinh thái TÀI LIỆU THAM KHẢO ALEXANDER STARK (2017) Report on the Global Market for Surfactants Market Study: Surfactants, Ceresana Publishes Market Analysis, 3rd edition CHIU TS, HSIEH CY, MIAW CL, LIN CN, CHANG TC, YEN CH, CHIOU MT (2014) Alkylphenol polyethoxylate derivatives in groundwater and blood samples collected from pig herds in Taiwan Veterinary Medical Science,76 (7), 971–975 H.J YANG Isolation, Identification of a octylphenol polyethoxylate degradaing strains and its degradation study Zhongguo Huanjing Kexue/China Environmental Science 34 (6):1556-1563, June 2014 HSI-JIEN CHEN, DYI-HWA TSENG, SHIR-LY HUANG (2005) Biodegradation of octylphenol polyethoxylate surfactant Triton X-100 by selected microorganisms Bioresource Technology, 96 (13), 1483-1491 MICHAEL WARHURST (1995) An Environmental Assessment of Alkylphenol Ethoxylates and Alkylphenols Friend of the Earth, 7/2018, Việt Nam 125 ... Nguồn vi khuẩn Các chủng vi khuẩn nghiên cứu nghiên cứu phân lập từ mẫu đất nơng nghiệp, nước sơng bùn sơng, nơi có mức độ nhiễm cao Thành phố Hồ Chí Minh Để sàng lọc chủng vi khuẩn phân hủy Triton... 3.11 cấy có khả phân hủy Triton X1.05, 0.92 0.82 Dựa vào đó, 100 chọn lọc chủng vi khuẩn có phát triển cao đường biểu diễn KẾT LUẬN có xu hướng lên mẫu 1.9, 2.12, Các chủng vi khuẩn phân lập 3.2... thái Kết sau quan sát 18 chủng vi khuẩn phân lập được, kính hiển vi độ phóng đại 100X Các chủng vi khuẩn phát triển mạnh chủng vi khuẩn chọn lọc có hình giải trình tự, định danh thái khác thuộc Gram