Định danh và xác định hoạt tính của mốt số dòng nấm có khả năng kích thước tạo trầm hương tại hương khê hà tĩnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP ===***=== KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NĂM HỌC 2020 - 2021 ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA MỘT SỐ DỊNG NẤM CĨ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TẠO TRẦM HƯƠNG TẠI HƯƠNG KHÊ - HÀ TĨNH Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Hồng Gấm Sinh viên thực : Lương Thị Bảo Ngọc Hà Nội, 2021 LỜI MỞ ĐẦU Trong trình thực đề tài Khóa luận tốt nghiệp, em nhận giúp đỡ tận tình từ thầy giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - trường Đại học Lâm nghiệp Nhân dịp này, Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS Nguyễn Thị Hồng Gấm - người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ đóng góp ý kiến quý báu để em hoàn thành đề tài Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, thầy cô thuộc môn Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Công ty Cổ phần Công nghệ cao Trầm Tuệ tài trợ kinh phí cho tơi thực đề tài nghiên cứu Thơng qua q trình thực đề tài, em học nhiều điều rút nhiều học kinh nghiệm quý báu Vì kiến thức thân cịn hạn chế, q trình thực đề tài không tránh khỏi sai sót em kính mong nhận ý kiến đóng góp q báu thầy Em xin trân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2021 Sinh viên Lương Thị Bảo Ngọc i MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU i MỤC LỤC ii DANH MỤC KÍ HIỆU TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG BIỂU .v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Dó Bầu 1.1.1 Đặc điểm sinh thái Dó Bầu .3 1.1.2 Đặc điểm hình thái Dó Bầu 1.1.3 Đặc điểm sinh học Dó Bầu .5 1.1.4 Địa điểm phân bố Dó bầu 1.1.5 Cơng dụng Dó bầu 1.2 Tổng quan nghiên cứu tạo Trầm hương 1.2.1 Nghiên cứu tạo Trầm hương Việt Nam .9 1.2.2 Nghiên cứu tạo Trầm hương giới 10 1.3 Các phương pháp kích thích tạo Trầm hương 10 1.3.1 Phương pháp tạo trầm hương truyền thống 11 1.3.2 Phương pháp tạo trầm hương đại 12 1.4 Một số cơng trình nghiên cứu cấy tạo trầm hương nhân tạo 15 PHẦN 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu .18 2.3 Vật liệu nghiên cứu .18 ii 2.3.1 Mẫu vật: 18 2.3.2 Các thiết bị, dụng cụ hóa chất 18 2.3.3 Môi trường 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phương pháp phân lập nấm 19 2.4.2 Phương pháp định danh nấm .20 2.4.3 Phương pháp xác định khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào 21 2.4.4 Phương pháp tạo chế phẩm vi sinh có khả kích thích tạo Trầm hương 22 2.4.5 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 23 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .24 3.1 Kết phân lập chủng nấm tạo Trầm Hương từ Dó Bầu 24 3.2 Kết định danh tên loài chủng nấm phân lập .25 3.2.1 Kết sơ định danh thơng qua đặc điểm hình thái nấm 25 3.2.2 Kết định danh nấm kỹ thuật sinh học phân tử .28 3.3 Kết xác định hoạt tính enzyme số chủng nấm 33 3.4 Kết nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học có khả kích thích tạo Trầm hương .36 KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO .41 iii DANH MỤC KÍ HIỆU TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ DNA Deoxyribonucleic acid ITS Internal transcribed spacer NCBI National Centerfor Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction PDA Potato dextrose agar PEC2 2-phenylethyl STT Số thứ tự iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các nghiên cứu tạo trầm hương phương pháp sinh học 12 Bảng 2.1: Cơng thức phối trộn dịng nấm 22 Bảng 3.1: Kết phân lập chủng nấm tạo Trầm hương 24 Bảng 3.2: Kết xác định loài sinh học phân tử chủng nấm 33 Bảng 3.3 Đường kính vịng phân giải (cm) chất chủng nấm 33 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Hình thái Trầm hương Hình 1.2: Mặt cắt ngang thân Dó bầu có trầm hương Hình 2.1: Đĩa môi trường cấy mẫu mẫu sau ngày ni cấy 20 Hình 3.1: Chủng nấm H4.1 đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) 26 Hình 3.2: Chủng nấm M9.3 đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) 26 Hình 3.3: Chủng nấm H4.5b đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) 27 Hình 3.4: Chủng nấm M9.5 đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) 27 Hình 3.5: Kết so sánh trình tự gen chủng H4.1 BLAST NCBI 28 Hình 3.6: Sơ đồ di truyền chủng H4.1 29 Hình 3.7: Kết so sánh trình tự gen chủng M9.3 BLAST NCBI 30 Hình 3.8: Sơ đồ di truyền chủng M9.3 30 Hình 3.9: Kết so sánh trình tự gen chủng H4.5b BLAST NCBI 31 Hình 3.10: Sơ đồ di truyền chủng H4.5b 31 Hình 3.11: Kết so sánh trình tự gen chủng M9.5 BLAST NCBI 32 Hình 3.12: Sơ đồ di truyền chủng M9.5 32 Hình 3.13: Biểu đồ thể khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào 34 Hình 3.14: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm M9.3 35 Hình 3.15: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm H4.5b 35 Hình 3.16: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm H4.1 35 Hình 3.17: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm M9.5 36 Hình 3.18: Các chế phẩm vi sinh phối trộn 37 Hình 3.19: Kết phân lập lại dòng nấm từ chế phẩm vi sinh 37 Hình 3.20: Chủng nấm H4.5b sau phân lập lại cấy chuyển nhiều lần 38 Hình 3.21: Chủng nấm M9.3 sau phân lập lại cấy chuyển nhiều lần 38 vi Hình 3.22: Chủng nấm H4.1 sau phân lập lại cấy chuyển nhiều lần 39 Hình 3.23 Chủng nấm M9.5 sau phân lập lại cấy chuyển nhiều lần 39 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Trầm dó, Dó bầu, Dó núi (Danh pháp khoa học: Aquilaria crassna) loài thực vật thuộc họ Trầm - Thymelaeaceae Lồi phân bố Đơng Nam Á đảo New Guinea Trầm hương sinh từ vết thương Dó Bầu Thế nhưng, khơng phải Dó bầu sinh trầm hương Chính vậy, Trầm hương q lại hết Cây Dó bầu tiết chất nhựa tự vệ xung quanh vết thương Thông thường, thân Dó có vết côn trùng đục, người ta hay gọi mắt thân Nhựa tiết thời gian trở nên đậm đặc hơn, mùi thơm hương dĩ nhiên thu hút loài kiến đến ăn, phân tử loài nấm mà kiến mang đến vơ tình “cấy” vào lớp nhựa Trải qua thời gian dài chịu ảnh hưởng nhiều tác động từ thiên nhiên sinh loại sản phẩm đặc biệt gọi Trầm hương hay Kì nam Trầm hương từ ngàn đời xem vị thuốc quý chữa nhiều bệnh tật Trước hàng vua quan, quý tộc có điều kiện dùng Chính mà Trầm hương có giá trị kinh tế cao thị trường, điều làm cho Dó bầu trở thành loài thực vật đặc biệt nhiều nhà khoa học người dân ý, có giá trị đặc biệt mặt nghiên cứu khoa học Việt Nam nói riêng nước giới nói chung Trong với rừng nguồn Trầm hương tự nhiên ngày cạn dần Cùng với khai thác mức người làm cho lồi thuộc chi Aquilaria có khả cho Trầm bị cạn kiệt Ở Việt Nam, người khai thác Trầm chặt đốn bừa bãi Dó bầu độ tuổi mà thời gian ngắn số lượng thuộc họ Dó bầu cho Trầm hương tự nhiêm bị sụt giảm nhanh chóng Trước tình hình đó, nước ta có nhiều tổ chức, quan, cá nhân trồng Dó bầu đại trà, nhằm mục đích phủ xanh đất trống đồi trọc, góp phần xóa đói giảm nghèo, cải thiện kinh tế, v.v… Tuy nhiên, việc tạo trầm hương tự nhiên hay biện pháp thủ cơng cịn hạn chế Với biện pháp học, phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực có nhược điểm xác suất thành công thấp Đối với phương pháp dùng hố chất có ưu điểm hiệu quả, tạo nhiều trầm thời gian ngắn, nhược điểm phương pháp sản phẩm cịn dư thừa thành phần hố chất độc hại Cl-, SO4 2-, NO2 PO4 3-,… ảnh hưởng đến sản phẩm không người tiêu dùng ưa chuộng Phương pháp mang tính khả quan sử dụng chủng nấm có khả kích thích tạo trầm cấy trực tiếp vào thân cây, với ưu điểm tỷ lệ thành công cao khơng để lại lượng hố chất độc hại tồn dư sản phẩm Vì vậy, trí ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, môn Công nghệ tế bào, hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hồng Gấm, thực đề tài: “Định danh xác định hoạt tính số dịng nấm có khả kích thích tạo trầm hương Hương Khê - Hà Tĩnh” nhằm thu nhận số dịng nấm ngồi tự nhiên để nhân ni xác định hoạt tính chúng, làm sở để tạo chế phẩm vi sinh nhân tạo có khả kích thích tạo trầm hương thân Dó bầu 3.2.2 Kết định danh nấm kỹ thuật sinh học phân tử 3.2.2.1 Chủng nấm H4.1 Kết giải trình tự chủng nấm H4.1 có trình tự đây: GGGTTCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTT GCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCG GGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAA GTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGAT CTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTA GTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACAT TGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGC TGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGG GGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGA GCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGC CGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGG ATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA Hình 3.5: Kết so sánh trình tự gen chủng H4.1 BLAST NCBI Xây dựng di truyền: 28 Hình 3.6: Sơ đồ di truyền chủng H4.1 Căn vào kết so sánh mức độ tương đồng kết hợp với xây dựng di truyền từ trình tự DNA thu chủng H4.1, chủng H4.1 định tên Aspergillus flavus Năm 2016, Muthuraj Sangareswari Nagajothi cộng phân lập gỗ Trầm hương tự nhiên, thấy diện chủng nấm Aspergillus, Lasiodiploidia, Chaetomium, Fusarium Penicillium [9] Vậy chủng nấm H4.1 thuộc chi Aspergillus 3.2.2.2 Chủng nấm M9.3 Kết giải trình tự chủng nấm M9.3 có trình tự đây: CCAGCCCATGTGACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGGATCGCCCCGG GCGCCTCGTGTGCCCCGGATCCGGCGCCCGCCTAGGAACCTTAACTC TTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAGTAGTTTTTACAAATAAATAAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC GAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAA TCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGT CTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGA TCGGCCAAGGCCCGCAAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCG GACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGAAGTAGTGATATTCCGCATCGGAG AGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCCAAGGTTGACCT CAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCA 29 Hình 3.7: Kết so sánh trình tự gen chủng M9.3 BLAST NCBI Xây dựng di truyền: Hình 3.8: Sơ đồ di truyền chủng M9.3 Căn vào kết so sánh mức độ tương đồng kết hợp với xây dựng di truyền từ trình tự DNA thu chủng M9.3, chủng M9.3 định tên Clonostachys rosea Vậy chủng nấm M9.3 thuộc chi Clonostachys 3.2.2.3 Chủng nấm H4.5b Kết giải trình tự chủng nấm H4.5b có trình tự đây: TCACCTTCTCCCAAAATCCCAACCCCTGTGACCTTACCTCAGTTGCCT CGGCGGGAACGCCCCGGCCGCGAATTTCGGAGCCGGCGCCGGACCC AGGCGCCCGCCGCAGGGATCTCAAACTCTCTTGCATTACGCCCAGCG GGCGGAATTTCTTCTCTGAGTTGCACAAGCAAAAACAAATGAATCGT AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCA 30 GCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCC TGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTG TTGGGGGACGGTCACCATCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCCCCG CCGCAGTCTCCCCT Hình 3.9: Kết so sánh trình tự gen chủng H4.5b BLAST NCBI Xây dựng di truyền: Hình 3.10: Sơ đồ di truyền chủng H4.5b Căn vào kết so sánh mức độ tương đồng kết hợp với xây dựng di truyền từ trình tự DNA thu chủng H4.5b, chủng H4.5b định tên Purpureocillium lilacinum Loài ban đầu mô tả nhà nấm học người Mỹ Charles Thom vào năm 1910, tên Penicillium lilacinum Chi Purpureocillium tạo để giữ đơn vị phân loại Tên chung dùng để bào tử bào tử màu tím nấm tạo 31 Vậy chủng nấm H4.5b thuộc chi Purpureocillium 3.2.2.4 Chủng nấm M9.5 Kết giải trình tự chủng nấm M9.5 có trình tự đây: GCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGAC CAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTG AGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACT TTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATC TTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTC CGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGG GATCGGCCCTCCCTCTGCGGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGG TCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGG AGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTG ACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCTAGGT GGGG Hình 3.11: Kết so sánh trình tự gen chủng M9.5 BLAST NCBI Xây dựng di truyền: Hình 3.12: Sơ đồ di truyền chủng M9.5 32 Căn vào kết so sánh mức độ tương đồng kết hợp với xây dựng di truyền từ trình tự DNA thu chủng M9.5, chủng M9.5 định tên Trichoderma hazianum Mohamed cộng (2010) phân lập chủng nấm thuộc loài Curvularia, Cunninghamella, Trichoderma Fusarium đất thân trầm hương Malaysia [13] Vậy chủng nấm M9.5 thuộc chi Trichoderma Từ kết thu việc định danh dòng nấm phân lập nhờ thị phân tử, tổng hợp bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết xác định loài sinh học phân tử chủng nấm STT Ký hiệu chủng Quan hệ gần gũi với loài H4.1 Aspergillus flavus Mức độ tương đồng 100% M9.3 Clonostachys rosea 99,80% H4.5b Purpureocillium lilacinum 95,74% M9.5 Trichoderma harzianum 99,61% Kết luận H4.1 thuộc chi Aspergillus M9.3 thuộc chi Clonostachys H4.5b thuộc chi Purpureocillium M9.5 thuộc chi Trichoderma 3.3 Kết xác định hoạt tính enzyme số chủng nấm Khả sinh enzym ngoại bào chủng nấm mục nghiên cứu môi trường lỏng bổ sung 1% chất CMC, tinh bột, pectin nuôi cấy 28˚C Sau 5-7 ngày, li tâm thu dịch nuôi cấy, nhỏ vào lỗ thạch môi trường chứa chất tương ứng agar Quan sát vòng phân hủy chất sau 24 giờ, kết thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Đường kính vịng phân giải (cm) chất chủng nấm Chủng nấm Cơ chất Tinh bột M9.3 H4.5b H4.1 M9.5 0,54±0,03 0,8±0,05 0,7±0,14 0,7±0,02 33 Pectin 1,34 ± 0,05 1,09±0,07 1,6±0,03 1,06±0,03 CMC 0,8 ± 0,04 0,9±0,06 1,44±0,4 1,07±0,04 Kết nghiên cứu cho thấy chủng nấm có khả tạo vòng phân hủy chất, điều chứng tỏ khả sinh enzyme ngoại bào Khi nhỏ dịch nuôi cấy chứa enzym cellulase, amylase pectinase vào lỗ thạch môi trường chứa chất tương ứng, enzym xúc tác trình phân giải CMC, tinh bột pectin thành đơn phân cấu thành nên chất đó, vùng xảy thủy phân chất enzym không bắt màu với thuốc nhuộm tạo thành vòng phân giải suốt đĩa thạch Trong đó, chủng nấm H4.5b có khả sinh tổng hợp enzyme amylase cao với đường kính vịng phân giải 0,8 cm Trong đó, chủng nấm H4.1 cho khả sinh tổng hợp enzyme pectinase enzyme cellulase cao với đường kính vịng phân giải 1,6 cm 1,44 cm 1.5 Tinh bột Pectin CMC 0.5 M9.3 H4.5b H4.1 M9.5 Hình 3.13: Biểu đồ thể khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào 34 M9.3 – Tinh bột M9.3 – Pectin M9.3 - CMC Hình 3.14: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm M9.3 D H4.5b – Tinh bột H4.5b - Pectin H4.5b – CMC Hình 3.15: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm H4.5b H4.1 – Tinh bột H4.1 - Pectin H4.1 – CMC Hình 3.16: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm H4.1 35 M9.5 – Tinh bột M9.5 – Pectin M9.5 – CMC Hình 3.17: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm M9.5 Với kết nghiên cứu Phạm Minh Tuấn cộng phân lập tiến hành đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm phân lập Trong đó, chúng nấm T24 có khả sinh enzyme cellulase ngoại bào cao 1,33cm [6] So sánh với kết nghiên cứu trên, chủng nấm H4.1 phân lập có hoạt tính enzyme cellulase cao so với chủng nấm đề tài nghiên cứu tác giả Phạm Minh Tuấn Với nghiên cứu Phạm Thị Huyền (2009), hai chủng nấm mốc phân giải tinh bột mạnh M12 M23 có đường kính vịng phân giải tinh bột lên đến 1,525cm chủng M12 1,45cm chủng M23 [7] Như vậy, chủng nấm H4.1, M9.3, H4.5b, M9.5 phân lập có hoạt tính enzyme amylase tương đối Phạm Thị Ngọc Lan cs (2017) công bố kết phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả phân giải pectin: đường kính vịng phân giải chủng nấm mốc dao động từ 1,733 cm đến 3,033 cm [8] So sánh với kết nghiên cứu trên, chủng nấm H4.1, M9.3, H4.5b, M9.5 phân lập có hoạt tính enzyme amynase thấp so với chủng nấm đề tài 3.4 Kết bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học có khả kích thích tạo Trầm hương Các dịng nấm ni môi trường lỏng 48h sử dụng để phối trộn thành công thức chế phẩm vi sinh khác bảng 2.1 Kết thu bình dịch chế phẩm vi sinh khác hình 3.21 36 Hình 3.18: Các chế phẩm vi sinh phối trộn Để đánh giá khả sống dòng nấm sau phối trộn tạo chế phẩm vi sinh, chúng tơi phân lập lại dịng nấm từ dịch chế phẩm sau ngày nuôi lắc bình chế phẩm vi sinh Lấy 0,3 ml dịch bình chế phẩm, cấy trải mặt đĩa pettri có mơi trường PAG Theo dõi đĩa phân lập sau ngày, kết thể hình 3.22 Hình 3.19: Kết phân lập lại dòng nấm từ chế phẩm vi sinh Kết quan sát cho thấy: với công thức chế phẩm vi sinh (A1), kết phân lập thấy dòng nấm mọc lan đĩa mơi trường, dịng nấm H4.5b M9.5 chiếm tỷ lệ sợi ăn lan đĩa cao so với dòng nấm lại, điều chứng tỏ chúng có khả sống sinh trưởng tốt 37 Với công thức chế phẩm vi sinh (A2) dịng nấm mọc lan đĩa mơi trường dòng nấm M9.5 H4.5b chiếm tỷ lệ sợi ăn lan đĩa cao so với dịng nấm cịn lại Với cơng thức chế phẩm (A3) thấy rõ dịng nấm có sợi phân bố bề mặt đĩa, dòng nấm M9.5 H4.5b có tỷ lệ sợi ăn lan đĩa cao Như vậy, 04 dòng nấm sau phối trộn thành công thức chế phẩm vi sinh khác ni sau ngày kết phân lập lại quan sát 04 dòng nấm mọc đĩa môi trường Điều chứng tỏ dịng nấm sống khơng có triệt tiêu công thức chế phẩm vi sinh sau ngày phối trộn Điều có ý nghĩa áp dụng vào sản xuất tạo chế phẩm vi sinh kích thích tạo trầm hương Hình 3.20: Chủng nấm H4.5b sau phân lập lại cấy chuyển nhiều lần Hình 3.21: Chủng nấm M9.3 sau phân lập lại cấy chuyển nhiều lần 38 Hình 3.22: Chủng nấm H4.1 sau phân lập lại cấy chuyển nhiều lần Hình 3.23 Chủng nấm M9.5 sau phân lập lại cấy chuyển nhiều lần 39 KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ Kết luận Từ mẫu gỗ Dó bầu có trầm tự nhiên thu thập Hương Khê - Hà Tĩnh tiến hành phân lập định danh chủng nấm: H4.1, M9.3, H4.5b, M9.5 thơng qua hình thái phân tích trình tự vùng gen ITS: chủng nấm H4.1 thuộc chi Aspergillus, chủng nấm M9.3 thuộc chi Clonostachys, chủng nấm H4.5b thuộc chi Purpureocillium chủng nấm M9.5 thuộc chi Trichoderma Cả 04 chủng nấm có khả sinh enzym ngoại bào, chủng nấm H4.5b có khả sinh tổng hợp enzyme amylase cao với đường kính vịng phân giải 0,8 cm Chủng nấm H4.1 cho khả sinh tổng hợp enzyme pectinase enzyme cellulase cao với đường kính vịng phân giải 1,6 cm 1,44 cm Ba chế phẩm vi sinh tạo từ công thức phối trộn dịng nấm khác có khả sinh enzyme amylase, cellulase pectinase ngoại bào Cả dịng nấm sống khơng có triệt tiêu công thức chế phẩm vi sinh sau ngày phối trộn Tồn Do thời gian thực nghiên cứu hạn chế nên chưa đánh giá hiệu sử dụng chế phẩm vi sinh thực địa để thử nghiệm khả kích thích tạo trầm Dó bầu chế phẩm tạo Kiến nghị Tiếp tục đánh giá khả kích thích tạo trầm chế phẩm vi sinh Dó bầu thời gian dài 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Tài liệu Việt Nam Đỗ Tất Lợi, 1986 Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà Xuất Bản Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, trang 435-436 Hoàng Đăng Hiếu, Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định danh lồi tập đồn Dị bầu (Aquilaria sp) Hà Tĩnh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 2012 Nguyễn Khởi Nghĩa (2017), Phân lập tuyên chọn số dòng nấm từ gỗ mục có khả loại màu thuốc nhuộm Đồng sơng Cửu Long –Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ, tập 53 tr 87 Nguyễn Ngọc Trúc Ngân, Phạm Thị Ngọc Lan (2014), Tìm hiểu khả phân giải cellulose vi sinh vật phân lập từ chất thải rắn nhà máy FOCOCEV – Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, tập số tr16, nhà xuất Đại học khoa học Huế Phạm Tiến Lợi, Nghiên cứu gây tạo Trầm hương Dó bầu phương pháp vi sinh hố học, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, 2006 Phạm Minh Tuấn, Phân lập đánh giá khả sinh enzyme cellulase ngooại bào chủng nấm mốc Phạm Thị Huyền cộng (2009), Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả phân giải tinh bột Phạm Thị Ngọc Lan, Ngô Thị Bảo Châu, Nguyễn Quỳnh Chi (2017), Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả phân giải pectin Báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ 7: trang 1304–1310 Tài liệu nước Cheng Seng Tan, Nurulhikma Md Isa, Ismanizan Ismail and Zamri Zainal, "Agarwood Induction: Current Developments and Future Perspectives." 41 10 Chhipa, H., Chowdhary, K., and Kaushik, N (2017) Artificial production of agarwood oil in Aquilaria sp by fungi: a review Phytochem Rev doi: 10.1007/s11101-017-9492-6 11 Claudio Guedes Salgado, Jorge Pereira and partner, Isolation of Fonsecaea pedrosoi from thorns of Mimosa pudica, a probable natural source of chromoblastomycosis, 2004 12 Lawrence,1998.AgarwoodChemistry.http://www.cropwatch.org/agarc hem.htm 13 Mohamed R, Jong PL, Zali MS (2010) Fungal diversity in wounded stems of Aquilaria malaccensis Fungal Divers 43: 67–74 14 Rozi Mohamedel at (2017), History and perspectives of induction technology for agarwoodproduction from cultivated Aquilaria in Asia: a review, Northeast Forestry University and Springer-Verlag GmbH Germany, part of Springer Nature 2018 15 Tian, J J., Gao, X X., Zhang, W M., Wang, L., and Qu, L H.(2013) Molecular identification of endophytic fungi from Aquilaria sinensis and artificial agarwood induced by pinholes-infusion technique Afr J Biotechnol 12, 3115–3131 doi: 10.5897/AJB11.3159 16 White, T., Bruns, T., Lee, S & Taylor, J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In: M Innis, D Gelfand, J Sninsky & T White (Eds.), PCR protocols A guide to methods and applications (pp 315–322) New York: Academic Press 42