Bài viết trình bày kết quả phân lập, định danh một loài thuộc chi Arthrospira tại hồ Văn Quán (Hà Nội) và đánh giá sơ bộ đặc điểm sinh trưởng làm cơ sở để khai thác nguồn gen này làm thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và thức ăn nuôi trồng thủy sản.
Vietnam J Agri Sci 2021, Vol 19, No 5: 672-683 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2021, 19(5): 672-683 www.vnua.edu.vn ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN LAM Arthrospira platensis PHÂN LẬP TỪ HỒ VĂN QUÁN Nguyễn Đức Bách1*, Chu Đức Hà2, Vũ Lê Diệu Hương1, Phí Thị Cẩm Miện1 Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Khoa Công nghệ Nông nghiệp, Trường Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội * Tác giả liên hệ: ndbach@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 06.04.2021 Ngày chấp nhận đăng: 05.05.2021 TÓM TẮT Tảo xoắn Spirulina (Arthrospira platensis) lồi vi khuẩn lam ni phổ biến làm thực phẩm chức năng, mỹ phẩm thức ăn thủy sản giàu protein, sắc tố, vitamin, axit béo không no nguyên tố vi lượng Ở Việt Nam, nghiên cứu tảo xoắn Spirulina cuối năm 1980, tập trung chủ yếu đánh giá yếu tố môi trường kỹ thuật nuôi Tuy nhiên, nghiên cứu phân lập, định danh xác định đặc điểm sinh học lồi tảo xoắn có nguồn gốc địa hạn chế Với mục tiêu khai thác nguồn gen địa, chủng vi khuẩn lam phân bố hồ Văn Quán (Hà Nội) phân lập, định danh xác định đặc điểm sinh trưởng mơi trường Hoagland, BBM, BG11, ½ Chu-10 Zarrouk Phân tích đặc điểm hình thái sử dụng kính hiển vi quang học điện tử quét kết hợp với phân tích vùng trình tự 16S rRNA, cho thấy chủng vi khuẩn lam phân lập xác định thuộc lồi Arthrospira platensis Ngoại trừ mơi trường Zarouck, lồi vi khuẩn lam có khả sinh trưởng tốt môi trường BG11 BBM Nghiên cứu tạo tảng ban đầu để khai thác nguồn gen địa cho thực phẩm chức năng, mỹ phẩm thức ăn ni trồng thủy sản Từ khóa: Arthrospira platensis, hồ Văn Quán, môi trường BG11, phân lập, tảo xoắn Spirulina Isolation and Characterization of the Strain Arthrospira plastensis Isolated from Van Quan Lake ABSTRACT Spirulina (Arthrospira platensis) is a species of Cyanobacteria and is widely cultivated for functional foods, cosmetics and aquaculture feed due to its rich protein, pigments, vitamins, unsaturated fatty acids and trace elements In Vietnam, Spirulina was first studied in the late 1970s, mainly focused on investigating environmental and nutritive factors as well as culture techniques However, very few studies on isolation, identification and characterization of native strain have been done With the aim of exploiting the indigenous genetic resources, a strain of Cyanobacteria distributed in Van Quan lake (Hanoi) was isolated, identified and cultured in the medium of Hoagland, BBM, BG-11, ½ Chu-10 and Zarrouk By morphological analysis using optical and electron scanning microscopy combined with 16S rRNA sequence analysis, the isolated strain was identified as Arthrospira platensis As the results attained, except for Zarrouk media, this species can grow well in in BG-11 and BBM media The study provided an initial scientific basis for exploiting indigenous genetic resources for functional foods, cosmetics and aquaculture feeds Keywords: Arthrospira platensis, BG11 medium, isolation, Spirulina, Van Quan lake ĐẶT VẤN ĐỀ Arthrospira chi thuộc nhóm vi khuẩn lam với cấu trúc dạng sợi xoắn đa bào phân bố rộng hầu hết thủy vực 672 giới Cho đến nay, loài tảo xoắn thuộc chi Arthrospira nuôi trồng quy mô lớn nhiều quốc gia giới A maxima A platensis Tên gọi tảo xoắn Spirulina mang tính lịch sử tên gọi chung loài Nguyễn Đức Bách, Chu Đức Hà, Vũ Lê Diệu Hương, Phí Thị Cẩm Miện A maxima A platensis Tảo xoắn sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực thực phẩm, hóa dược, thức ăn ni trồng thủy sản giàu protein (60-65%), sắc tố phycocyanin, -carotene, chlorophyll a axit béo không no (-linolenic acid/GLA) nguyên tố vi lượng kẽm, sắt, canxi (Menegotto & cs., 2016; Ahsan & cs., 2008; Vonshak, 1997) Về mặt lịch sử, từ cuối kỷ XIX, Gomont đề cập đến chi Arthrospira Spirulina (Gomont, 1982), sau chi Arthrospira khơng coi chi riêng rẽ hợp với chi Spirulina (Geitler, 1925) Gần đây, cách so sánh đồng thời đặc điểm hình thái trình tự DNA, Arthrospira Spirulina xác định lại thành chi riêng rẽ (Komárek & cs., 2014; Sili & cs., 2012) Ngồi khác đặc điểm hình thái di truyền, khác biệt chi thể khả tổng hợp -linolenic acid (GLA), Arthrospira có khả tổng hợp axit -linolenic acid (GLA), Spirulina khơng tổng hợp GLA (Vonshak, 1997) Trên giới, chủng tảo xoắn đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp biết đến chủ yếu Spirulina platensis Gomont, S platensis NIES-39, S platensis Geitler, S platensis (Nordstedt) Geitler, S maxima (S geitleri) (Setch et Gardner), Arthrospira fusiformis (Voronichin) A maxima Trong số loài thuộc chi Arthrospira, loài A platensis A maxima phát hồ nhiệt đới cận nhiệt đới có pH kiềm với nồng độ carbonate (CO32-) bicarbonate (HCO3-) cao (Habib & cs., 2008) Loài A platensis phát châu Phi, châu Á Nam Mỹ, loài A maxima phát Trung Mỹ (Vonshak, 1997) Cho đến Việt Nam, nghiên cứu vi khuẩn lam chủ yếu tập trung vào việc nuôi để thu sinh khối tảo xoắn Spirulina (Nguyễn Thuý Nga & cs., 2020; Nguyễn Đức Bách & cs., 2020; Đặng Đình Kim & cs., 2011) đánh giá phân bố số loài thuộc chi Anabaena, Nostoc, Hapalosiphon, Mastigocladus, Synechocystis, Gloeocapsa, Chroococcus, Microcystis, Aphanocapsa, Microcoleus, Lyngbya, Phormidium Oscillatoria với mục tiêu sử dụng làm phân bón giàu nitơ cho ruộng lúa (Nguyễn Xuân Hoà & cs., 2020; Nguyễn Thị Hạnh Nguyên & cs., 2019; Nguyễn Đình San & cs., 2015) nghiên cứu khả sinh độc tố hồ (Dương Thị Thuỷ & cs., 2012) Mặc dù phân bố tảo lam nhiều thuỷ vực nước đề cập, nhiên việc phân lập định tên lồi thuộc chi Arthrospira Việt Nam cịn hạn chế Trong số năm gần đây, nhóm nghiên cứu Đặng Diễm Hồng khảo sát phân lập số chủng vi khuẩn lam thuộc loài A platensis (Đặng Diễm Hồng, 2019) Qua khảo sát sơ mẫu nước thu thập từ số thuỷ vực nước Hà Nội cho thấy đa dạng lồi vi khuẩn lam có lồi thuộc chi Arthrospira Nghiên cứu trình bày kết phân lập, định danh loài thuộc chi Arthrospira hồ Văn Quán (Hà Nội) đánh giá sơ đặc điểm sinh trưởng làm sở để khai thác nguồn gen làm thực phẩm chức năng, mỹ phẩm thức ăn nuôi trồng thủy sản PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Thu thập mẫu tảo Chủng tảo xoắn thu thập tầng nước mặt ven hồ Văn Quán, quận Hà Đông, Hà Nội, cách sử dụng lưới vớt tảo kích thước lỗ 2030m Thời điểm thu mẫu từ 10-11 sáng (6/2020) Mẫu tảo sau thu thập quan sát kính hiển vi quang học (Olympus CX41, Nhật Bản) độ khuếch đại 100 400 lần (tương ứng vật kính 10X 40X) để đánh giá đặc điểm hình thái 2.1.2 Môi trường nuôi tảo Để phân lập nuôi chủng tảo phân lập, môi trường sử dụng bao gồm môi trường Hoagland (Hoagland & cs., 1933), môi trường Bold's Basal Medium/BBM (Nichols & cs., 1965), môi trường 1/2 Chu-10 (Stein, 1973), môi trường BG11 (Waterbury & cs., 1991) môi trường Zarrouk (Zarrouk, 1966) Các môi trường thạch sử dụng để phân lập bổ sung agar với hàm lượng 15 g/l Thành phần môi trường tổng hợp bảng 673 Định danh xác định đặc điểm sinh trưởng chủng vi khuẩn lam Arthrospira platensis phân lập từ hồ Văn Quán Bảng Thành phần môi trường Hoagland, BBM, 1/2 Chu-10, BG11 Zarrouk Thành phần Môi trường (mg/l) Hoagland BBM ½ Chu-10 BG11 Zarrouk KNO3 300 - - - - Ca(NO3)2.4H2O 20 - - - - - 18,87 - - - 22,5 - - - - CaCl2 Fe (chelate) FeSO4.7H2O - 4,98 ( ) - NaNO3 - 250 - 1.500 2.500 K2HPO4.3H2O - 75 250 40 660 KH2PO4 10 136 175 - - - K2SO4 - - - - 1.000 CaCl2.2H2O - 25 - 36 30 C6H8O7.H2O - - - - MgSO4.7H2O - 36,63 1,25 g 75 - MgCl2 240 - - - - MnSO4 - - 0,147 1,81 - NaCl - - - - 1000 NaHCO3 - - - - 17.000 Na2CO3 - - - 20 - 0,05 80 Na2EDTA - 63,61 ( ) KOH - 31 ( ) - - - CoCl2.6H2O - - 0,01 - - Co(NO3).6H2O - 0,49 - 0,0494 0,044 CuSO4.5H2O - 1,57 0,01 - 0,079 Fe2(C4H4O6)3 - - - - FeCl3.6H2O - - 40 - - Fe(NH4)3(C6H5O7)2 - - - - H3BO3 11,42 0,124 2,86 2,86 K2Cr2(SO4)4.24H2O - - - - 0,096 0,016 1,44 - - 1,81 MnCl2.4H2O MoO3 Na2MoO4.2H2O 0,71 - 1,19 0,006 0,39 0,39 15 - - - - NH4VO3 - - - - 0,023 NiSO4.7H2O - - - - 0,048 Na2WO4.H2O - - - - 0,018 Ti(SO4)3 - - - - 0,04 (NH4)2NO3 ZnSO4.7H2O 0,22 8,82 0022 - 0,222 Vitamin B1 - - 50g - - Vitamin B7 - - 2,5g - - Vitamin B12 - - 2,5g - - Biotin pH - - 2,5g - - 6,8-7,0 (H2SO4) 6,6-6,7 (H2SO4) 8,3-8,5 (KOH) 7,5 (KOH) 9,0 Ghi chú: (1) dung dịch gốc pha 4,98g FeSO4.7H2O lít nước axit hố 1ml H2SO4; (2) Dung dịch gốc 50g EDTA 31g KOH hồ tan lít H2O 674 Nguyễn Đức Bách, Chu Đức Hà, Vũ Lê Diệu Hương, Phí Thị Cẩm Miện 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập làm Mẫu tảo sau thu thập rửa lần môi trường lỏng vô trùng (Hoagland, BBM, BG11, ½1/2 Chu-10 Zarrouk) cách ly tâm tốc độ 1.500g 10 phút nhiệt độ phịng (25C) Cặn tế bào sau pha lỗng cấy trải mơi trường thạch tương ứng ngày thu mẫu Mẫu tảo nuôi đĩa Petri giữ nhiệt độ phòng (25-28C) chiếu sáng với chu kỳ sáng tối (16:8) đèn huỳnh quang, cường độ 1.500Lux Trong trình ni, khuẩn lạc quan sát trực tiếp kính hiển vi soi (Nikon SMZ745, Nhật Bản) Hình thái vi tảo quan sát cách lấy mẫu từ khuẩn lạc đơn soi kính hiển vi quang học (Olympus CX41, Nhật Bản) độ phóng đại 100 400 lần Các sợi tảo đơn riêng rẽ sau phân lập cách sử dụng micropipette quan sát kính hiển vi soi (Robert, 2015) Sợi tảo đơn sau cấy trải mơi trường thạch, sau tiếp tục pha lỗng ni điều kiện mơ tả Q trình lặp lại khuẩn lạc chứa sợi tảo với đặc điểm hình thái đồng khơng cịn nhiễm khuẩn nấm Trong q trình phân lập, để hạn chế sinh trưởng vi khuẩn, lồi tảo thuộc nhóm nhân chuẩn (eukaryote) nấm, kháng sinh cycloheximide bổ sung nồng độ từ 25 g/ml Để thu chủng khiết, sau ngày nuôi cấy môi trường lỏng, chủng phân lập rửa cách ly tâm lần mơi trường BG-11 (vơ khuẩn), sau cặn tế bào hồ tan lại mơi trường BG-11 bổ sung hỗn hợp kháng sinh neomycin (50 g/ml) cycloheximide (20 g/ml) ni lắc nhẹ (100 vịng/ phút) máy lắc (HY-5A, Trung Quốc) tối nhiệt độ phịng Sau dịch huyền phù ly tâm tái hồ tan mơi trường BG-11 có bổ sung cycloheximide 25 g/ml chiếu sáng đèn huỳnh quang cường độ ánh sáng 1.500Lux Quá trình lặp lại nhiều lần chủng tảo phân lập khiết (Gang-Guk & cs., 2008; Rout & cs., 2013) 2.2.2 Mô tả đặc điểm hình thái Chủng tảo xoắn sau phân lập ni bước bình nón thuỷ tinh tích 50ml sau tăng dần thể tích sau ni bình thuỷ tinh Pyrex từ 200ml đến lít nhiệt độ phòng (25 ± 3°C), chiếu sáng liên tục đèn huỳnh quang T8 Deluxe 36W (Rạng Đông) sục khí nén (lọc vơ khuẩn qua màng lọc 0,25m) với tỉ lệ khí sục 10-15% (thể tích khí sục so với thể tích huyền phù tảo phút) Trong q trình ni, thể tích huyền phù tảo chiếm khoảng 1/3 đến ½ thể tích bình ni Khi mật độ tảo đo bước sóng 750nm (OD750) đạt từ 0,8-1,0 cấy chuyển sang bình Trong thí nghiệm, mật độ tảo ban đầu đặt OD750 = 0,1 (đo bước sóng 750nm) Hình thái chủng vi tảo phân lập sau làm mơ tả dựa vào quan sát kính hiển vi quang học (độ khuếch 100X 400X) kính hiển vi điện tử quét (độ khuếch đại từ 1.000X đến 5.000X) Để quan sát cấu trúc siêu hiển vi chủng tảo phân lập, mẫu tảo tươi cố định quan sát kính hiển điện tử quét (SEM) Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương S-4800 (M: x25-x800.000, d: 1nm, U: 0,5-30kV) Hình thái vi khuẩn lam Arthrospira mô tả theo nghiên cứu Vonshak (Vonshak & cs., 1997) 2.2.3 Xác định môi trường nuôi phù hợp tốc độ sinh trưởng riêng chủng vi tảo phân lập Chủng tảo xoắn sau làm thử nghiệm nuôi môi trường (Bảng 1) để xác định môi trường nuôi phù hợp dựa vào khối lượng sinh khối khô (g/l) tốc độ sinh trưởng riêng () tính tốn từ đường cong sinh trưởng Tốc độ sinh trưởng chủng vi khuẩn lam xác định gián tiếp thông qua khối lượng sinh khối khơ mật độ quang đo bước sóng 750nm (Melinda & cs., 2011) Năng suất sinh khối (PX) xác định theo phương trình: PX = (Xt – X0)/(t - t0), Xt sinh khối (g/l) thời gian t (tính theo ngày) X0 lượng sinh khối (g/L) thời điểm t0 Tốc độ sinh trưởng riêng (µ) tảo sinh trưởng pha logarit xác định theo phương trình 675 Định danh xác định đặc điểm sinh trưởng chủng vi khuẩn lam Arthrospira platensis phân lập từ hồ Văn Quán = ln(Xt/X0)/(t – t0) Thời gian nhân đơi hệ (doubling time) Td = ln(2)/µ (tính theo ngày) 2.2.4 Xác định mối tương quan khối lượng tảo khô mật độ quang OD750 Để xác định khối lượng khô huyền phù tảo tương ứng mức độ hấp thụ quang bước sóng 750nm (OD750) khác nhau, đồ thị tương quan khối lượng tảo khô mật độ quang OD750 xây dựng Bước sóng ánh sáng 750nm sử dụng sở nghiên cứu khảo sát tương quan bước sóng ánh sáng với khối lượng khô (Melinda & cs., 2011) Dịch huyền phù tảo giai đoạn cuối pha sinh trưởng logarit đo quang phổ bước sóng 750nm, đồng thời lấy 100ml dịch huyền phù tế bào ly tâm tốc độ 6.000g 10 phút 10°C (Centrifuge 5403, Eppendorf, Đức) để thu tế bào Tế bào thu hồi cách lọc qua giấy lọc (Whatman GF/C filter No 1, 11m, 80mm đường kính) Giấy lọc chứa sinh khối tảo sấy khô 60°C khối lượng không đổi (khoảng 10 giờ) sau cân khối lượng giấy lọc cân phân tích (SHIMADZU AUX 120, Nhật Bản) Khối lượng khơ thực tảo tính chênh lệch khối lượng giấy lọc có chứa tảo tươi trước sau sấy khô theo đơn vị g/l (m0) Dịch huyền phù tảo pha loãng liên tiếp 2, 4, 8, 16 32 lần, mức độ pha loãng dịch huyền phù tảo đo quang phổ bước sóng 750nm Khối lượng tảo khơ mức độ pha loãng tương ứng (m2, m4, m8, m16, m32) suy diễn dựa vào khối lượng khô xác định từ dịch huyền phù gốc ban đầu (m0) Mối tương quan độ hấp thụ quang học với khối lượng khô xây dựng theo phương trình tuyến tính 2.2.5 Tách DNA phân tích trình tự 16S rRNA DNA tổng số tách từ tảo tươi theo quy trình sử dụng CTAB (Doyle & cs., 1987) Hút 1,5ml huyền phù tảo ly tâm ống eppendort 2ml ly tâm tốc độ 10.000g 15 phút để thu tế bào Tế bào sau rửa lần cách ly tâm dung dịch đệm TE (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, pH 8,4) Tế bào 676 nghiền thành bột mịn cối chày sứ sử dụng nitơ lỏng Bột mịn đưa vào ống eppendorf 2ml bổ sung 1ml dung dịch đệm chiết (100mM Tris-HCl pH 8,0; 1,4M NaCl; 2% CTAB; 20mM EDTA 0,4% -mercaptoethanol bổ sung trước dùng) DNA tổng số kiểm tra cách chạy điện di gel agarose 1% nhuộm Ethidium bromide DNA thang chuẩn 1kb (Promega) Nồng độ DNA xác định đo quang phổ bước sóng 260nm 280nm sử dụng máy (UVVIS SHIMADZU UV-1800, Nhật Bản) Tỉ lệ OD260/OD280 > 1,8 coi Nồng độ DNA xác định theo công thức = 50 g/ml × OD260 × hệ số pha loãng (Barbas & cs., 2007) Hàm lượng DNA sử dụng cho PCR xác định thực nghiệm dựa việc pha loãng từ DNA tổng số Trình tự 16S rRNA nhân PCR sử dụng cặp mồi CYA106F (CGGACGGGTGA GTAACGCGTGA) CYA781R (GACTACT GG GGTATCTAATCC CA TT) cho vùng 16S rRNA vi khuẩn lam (Nübel & cs., 1997) Chu kỳ nhiệt PCR biến tính 96C phút, tiếp 35 chu kỳ với nhiệt độ biến 94C 30 giây, gắn mồi 56C 30 giây, tổng hợp 72C 30 giây kéo dài tổng 72C 10 phút giữ 4C Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% (w/v) Sản phẩm PCR gửi đọc trình tự trực tiếp sử dụng cặp mồi nêu Trình tự nucleotide đăng ký ngân hàng gen NCBI Trình tự nucleotide vùng 16S rRNA so sánh với trình tự cơng cụ Blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) để xác định trình tự lồi có mối quan hệ gần gũi Dựa vào kết Blastn, 10 vùng trình tự có mức giống lớn với trình tự truy vấn sử dụng để xây dựng tiến hoá chương trình Mega-X với thuật tốn Maximum Likelihood (ML), thơng số kiểm định (Bootstrap replication = 1000), tham số mơ hình (Kimura2-parameter/K2P), tốc độ biến đổi vị trí theo phân bố Gamma, thông số khác đặt mặc định chương MEGA-X (www.megasoftware.net) (Kumar & cs., 2018) Nguyễn Đức Bách, Chu Đức Hà, Vũ Lê Diệu Hương, Phí Thị Cẩm Miện 2.2.6 Phân tích số liệu Mỗi thí nghiệm lặp lại lần để phân tích giá trị trung bình độ lệch chuẩn (SD) Chương trình Microsolf Excel (2016) sử dụng để vẽ đồ thị Sự sai khác giá trị trung bình phân tích phân tích phương sai (ANOVA) với mức ý nghĩa = 0,05 Hậu kiểm Tukey’s test áp dụng để xác định khác cặp giá trị trung bình cơng thức thí nghiệm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn lam Sau pha lỗng cấy mơi trường thạch từ đến tuần, chủng vi khuẩn lam bắt đầu hình thành khuẩn lạc nhỏ quan sát được, sau khuẩn lạc lan rộng bề mặt đĩa thạch với màu xanh đặc trưng Trong số mơi trường thử nghiệm, chủng vi khuẩn lam phát triển môi trường bao gồm Hoagland, BBM, 1/2 Chu-10 BG-11 Khi so sánh xuất kích thước khuẩn lạc, tảo sinh trưởng nhanh môi trường BG-11 BBM Ở môi trường BG11 BBM sau 3-4 tuần xuất khuẩn lạc, mơi trường Hoagland 1/2 Chu-10 tảo phát triển chậm, sau đến tuần thấy xuất khuẩn lạc Môi trường Zarrouk không phù hợp cho sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn lam Sau tuần khơng quan sát thấy hình thành khuẩn lạc Sự sinh trưởng chủng phân lập môi trường Zarrouk thay đổi mơi trường nước tự nhiên hồ Văn Quán với môi trường Zarrouk dẫn đến sốc chậm thích nghi điều kiện phân lập Trong năm gần đây, nhóm nghiên cứu Đặng Diễm Hồng khảo sát phân lập số chủng vi khuẩn lam thuộc chi Arthrospira nhiều thuỷ vực nước Việt Nam lưu giữ Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam (ký hiệu S platensis BM, CNT, DL, TL, ST CNT1 IET) (Đặng Diễm Hồng, 2019) Nhóm nghiên cứu Nguyễn Xuân Hoà phân lập làm chủng vi khuẩn lam môi trường BG11 có bổ sung nitơ (BG11-N) có khả cố định nitơ để sản xuất phân bón sinh học cho lúa Nhóm nghiên cứu phát lồi vi khuẩn lam phân bố thuỷ vực nước thường sinh trưởng thích hợp khoảng nhiệt độ từ 20-30C, pH từ 6,0 đến 7,0 (Nguyễn Xuân Hịa & cs., 2020) Bằng cách pha lỗng liên tục, tách riêng sợi vi khuẩn lam cấy đĩa môi trường thạch BBM BG-11 Trong trình phân lập, điều thú vị chủng vi khuẩn lam tồn dạng sợi xoắn với bước xoắn rộng dạng cuộn tròn Ban đầu tồn dạng hình thái cho chủng khác Tuy nhiên q trình ni, dạng cuộn trịn quan sát mơi trường thạch (Hình 1) Trong mơi trường ni lỏng, chủng vi khuẩn lam tồn dạng hình thái sợi dài dạng sóng Hiện tượng tương tự mô tả số nghiên cứu đánh giá khả thay đổi hình thái tảo xoắn (Martin & cs., 2008; Noor & cs., 2008) 3.2 Hình thái tế bào Phân tích chi tiết hình thái, nhờ quan sát độ phóng đại 400 1.000 lần kính hiển vi quang học cho thấy chủng vi tảo có dạng xoắn đặc trưng có chiều rộng khoảng 5m, chiều dài dao động từ 50 đến lớn 400m Khi nuôi môi trường lỏng, dạng cấu trúc xoắn giữ ổn định điển hình chi Arthrospira Khi phân tích hình thái mức phân giải cao sử dụng kính hiển vi điện tử (SEM), sợi vi tảo cấu tạo tế bào dạng hình trụ (trichomes) nối với có tế bào phần cuối sợi thắt nhỏ lại (Hình 2b) Bằng chứng rõ rệt để phân biệt vi khuẩn lam thuộc chi Arthrospira Spirulina cấu trúc vách ngăn tế bào (Hình 2d, e) Khảo sát thực tế số thuỷ vực nước ngọt, đặc biệt hồ khu vực nội ngoại thành Hà Nội cho thấy nhiều lồi vi khuẩn lam có hình thái tương tự với chủng phân lập Hồ Văn Quán (Hà Nội) (số liệu chưa công bố) Điều chứng tỏ lồi vi khuẩn lam thuộc chi Arthrospira có khả phân bố rộng thích nghi tốt điều kiện tự nhiên 677 Định danh xác định đặc điểm sinh trưởng chủng vi khuẩn lam Arthrospira platensis phân lập từ hồ Văn Quán Ghi chú: Chủng tảo xoắn hình thành sợi mọc lan bề mặt đĩa mơi trường thạch sau tuần môi trường BG-11 (trái), dạng sợi xoắn dạng sợi cuộn trịn mơi trường thạch quan sát kính hiển vi độ phóng đại 50 lần (trái) Thang đo 20µm Hình Hình thái sợi chủng tảo xoắn Arthrospira platensis phân lập 10 µm 20 µm a c b d e Ghi chú: Dạng sợi uốn sóng với cấu trúc tế bào tách biệt (trichomer) cấu trúc màng (a); hình thái xoắn độ phóng đại 400 lần (b); hình dạng tế bào cố định quan sát kính hiển vi SEM (c); tế bào riêng rẽ tạo thành dạng cấu trúc đốt tế bào (d); kích thước sợi tế bào riêng rẽ độ phóng đại 5.000 lần (e) Hình Hình thái hiển vi chủng tảo xoắn phân lập 3.3 Tách DNA nhân đoạn gen 16S rRNA xác định trình tự DNA tổng số chủng vi khuẩn lam tách theo phương pháp cải tiến sử dụng CTAB (Doyle & cs., 1987) chạy điện di gel 678 agarose 1% (Hình 3a) Kết PCR với cặp mồi CYA106F CYA781R thu băng đặc hiệu nhất, có kích thước khoảng 650bp (Hình 3), Như vậy, cặp mồi CYA106F CYA781R phù hợp với chủng vi khuẩn lam phân lập (Nübel & cs., 1997) Nguyễn Đức Bách, Chu Đức Hà, Vũ Lê Diệu Hương, Phí Thị Cẩm Miện 3.4 So sánh vùng trình tự 16S rRNA xác định mối quan hệ tiến hố chủng vi khuẩn lam phân lập Trình tự sau thu loại bỏ trình tự nucleotide bị nhiễu đầu có chiều dài 555bp đăng ký vào ngân hàng NCBI (MW791382) Kết Blastn sử dụng trình tự truy vấn (query) với ngân hàng liệu nucleotide NCBI cho thấy, trình tự thu có mức giống đến 99% với trình tự 16S rRNA chủng khác thuộc loài A platensis sở liệu ngân hàng gen NCBI (Hình 3) Dựa vào kết Blastn, 10 trình tự có mức giống cao với vùng trình tự 16S rRNA chủng vi khuẩn lam phân lập (MN615886.1, LC455668.1, MH318616.1, MG098079.1, CP013008.1, KC217542.1, JX872527.1, MW628543.1, KC1985869.1, KC195870.1) sử dụng để so sánh trình tự xây dựng tiến hố chương trình Mega-X (Hình 4) Kết phân tích cho thấy, có gốc chia thành nhóm, nhóm thứ gồm trình tự tất thuộc lồi A platensis, nhóm thứ loài vi khuẩn lam phân lập hồ Văn Quán (Hà Nội) tách riêng thành nhóm (A platensis VQ VN), nhóm thứ lồi A platensis YZ (CP013008.1) với vùng trình tự bắt cặp với trình tự truy vấn từ vị trí 2643707 đến 2464259 genome (Hình 4) Khoảng cách lồi A platensis VQ VN rấ nhỏ so với nhóm thứ gồm loài (giá trị bootstrap 98%) Ghi chú: (A): Giếng tương ứng 10l DNA tổng số; (B): Giếng sản phẩm PCR nhân cặp mồi CYA106F CYA781R có kích thước khoảng 650bp, M: Thang chuẩn 1kb (Promega) Hình Điện di DNA tổng số sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn lam Ghi chú: Thông số chương trình Blastn đặt mặc định với 10 trình tự có mức giống cao với trình tự truy vấn hiển thị Hình Blastn vùng 16S rRNA chủng vi khuẩn lam với ngân hàng sở liệu NCBI 679 Định danh xác định đặc điểm sinh trưởng chủng vi khuẩn lam Arthrospira platensis phân lập từ hồ Văn Quán Hình Mối quan hệ tiến hoá chủng vi khuẩn lam A platensis VQ-VN với 10 loài A platensis sở liệu NCBI Hình Mối tương quan mật độ quang học với khối lượng tảo khô đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn lam phân lập mơi trường ni Bằng cách kết hợp phân tích đặc điểm hình thái so sánh trình tự vùng 16S rRNA chủng vi khuẩn lam phân lập hồ Văn Quán (Hà Nội) xác định chủng vi khuẩn thuộc loài A platensis đặt tên A platensis VQ-VN Theo cơng trình cơng bố nghiên cứu giới, vi khuẩn lam thuộc lồi A platensis làm nguồn dinh dưỡng thực phẩm chức cho người động vật Cho đến nay, nghiên cứu vi khuẩn lam A platensis Việt Nam nhóm nghiên cứu Đặng Diễm Hồng & cs (2019) khảo sát phân lập số chủng vi khuẩn thuỷ vực nước Một 680 số nhóm nghiên cứu phân lập, làm xác định đặc điểm chủng vi khuẩn lam thuộc Chroococcales Nostocales, bao gồm chi Anabaena, Nostoc, Hapalosiphon Mastigocladus (Nguyễn Xuân Hòa & cs., 2020; Nguyễn Thị Hạnh Nguyên & cs., 2019) Nghiên cứu vi khuẩn lam độc nước nhóm nghiên cứu Đặng Đình Kim thực khảo sát nhiều thuỷ vực nước (Đặng Đình Kim & cs., 2014) Thực tế vi khuẩn lam (cyanobacteria) ngành lớn gồm nhiều loài khác nhau, hiểu biết thành phần loài đặc điểm sinh học loài thuộc ngành Nguyễn Đức Bách, Chu Đức Hà, Vũ Lê Diệu Hương, Phí Thị Cẩm Miện vi khuẩn cịn hạn chế Việc phân loại hình thái vi khuẩn lam nhìn chung gặp nhiều khó khăn với chi Arthrospira bắt gặp cấu trúc sợi có chứa tế bào dị hình (heterocyst) (Fujisawa & cs., 2010) Ngồi ra, phân tích hệ gen Arthrospira cho thấy số gen chịu trách nhiệm cho việc hình thành tế bào dị patU, hetR, hetF cố định N có mặt genome Arthrospira (Furmaniak & cs 2017) Ngay số loài thuộc chi Planktothrix có cấu trúc dạng sợi xoắn gồm tế bào ngăn cách với (trichome) (Liu & cs., 2013) Chính vậy, việc kết hợp phân tích hình thái, sinh lý phân tích trình tự DNA xây dựng tiến hố để xác định lồi tiêu chí quan trọng cho phân loại Ngồi trình tự 16S rRNA, việc phân tích trình tự khác cpcBA-IGS rpoC1 kết hợp với phân tích phổ axit béo, gen liên quan đến khả sinh độc tố (cyanotoxin) cần thiết (Liu & cs., 2013) 3.5 Đánh giá khả sinh trưởng chủng vi khuẩn lam phân lập phịng thí nghiệm Mặc dù tốc độ phát triển khuẩn lạc chủng vi khuẩn lam A platensis VQ-VN môi trường Hoagland 1/2 Chu-10 tương đối chậm, nhiên để đánh giá khả phát triển chủng điều kiện nuôi lỏng, môi trường Hoagland, BBM, BG-11 1/2 Chu-10 thử nghiệm Tảo nuôi qua bước cấy chuyển với thể tích nhỏ sau chuyển sang ni bình thuỷ tinh Duran thể tích lít điều kiện phịng thí nghiệm chiếu sáng đèn huỳnh quang cường độ 2.500Lux, chu kỳ chiếu sáng 16:8, nhiệt độ 25 3C tốc độ sục khơng khí 10% (thể tích/phút) Khả thích ứng sinh trưởng chủng vi khuẩn lam phân lập xác định dựa vào mật độ quang huyền phù tảo bước sóng 750nm (Melinda & cs., 2011) khối lượng tảo khô Mối tương quan khối lượng khơ mật độ quang học bước sóng 750nm (OD750) trình bày hình Kết thử nghiệm môi trường cho thấy, chủng vi khuẩn lam phân lập có khả sinh trưởng tốt môi trường BG1-1 BBM Thời gian sinh trưởng tảo để đạt mật độ tối đa từ 14 đến 16 ngày Khối lượng tảo khô nuôi môi trường BG11 BBM tương ứng đạt 0,96 0,89 g/l Môi trường Hoagland 1/2 Chu-10 không thích hợp cho sinh trưởng chủng vi khuẩn lam này, thời gian từ thời điểm cấy giống đạt mật độ tối đa khoảng từ 16-18 ngày, nhiên mật độ tảo thấp so với điều kiện mơi trường BG11 (Hình 6) Khối lượng tảo khô thu nuôi môi trường Hoagland 1/2 Chu-10 đạt 0,68 0,41 g/l Tốc độ sinh trưởng riêng (/ngày) chủng vi khuẩn lam giai đoạn sinh trưởng logarit môi trường BG-11, BBM, 1/2 Chu-10 Hoagland tương ứng 0,211 0,023; 0,185 0,022; 0,169 0,016 0,134 0,012 (P