Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm định danh quần thể tế bào đầu dòng tiết dopamin ở não giữa phôi chuột cống trắng. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 ĐỊNH DANH TẾ BÀO ĐẦU DỊNG TIẾT DOPAMIN TRÊN PHÔI CHUỘT CỐNG TRẮNG MARKER VIMENTIN VÀ THYROXIN HYDROXYLASE Nguyễn Thị Bình*; Nguyễn Phúc Hồn* Nguyễn Thanh Hoa*; Nguyễn Mạnh Hà* TÓM TẮT Mục tiêu: định danh quần thể tế bào đầu dòng tiết dopamin não phôi chuột cống trắng Phương pháp: ống thần kinh não phôi chuột cống trắng giai đoạn 12,5 - 13,5 ngày tuổi (E.12,5 - E.13,5) trích thủ từ phơi chuột phần nhuộm hóa mơ miễn dịch với marker vimentin thyroxin hydroxylase (TH); phần phân lập, nuôi cấy môi trường (DMEM/F12; 1:1) có bổ sung b-FGF2, EGF số yếu tố tăng trưởng khác Tiếp tục nhuộm tế bào thu sau nuôi cấy với marker Kết quả: biểu vimentin có hầu hết tế bào ống thần kinh phôi chuột, giai đoạn E.13,5 dương tính mạnh E.12,5 Biểu TH bắt đầu thấy E.13,5 Sau nuôi cấy, tế bào tăng sinh mạnh, hầu hết tế bào dương tính với vimentin, số tế bào dương tính với TH * Từ khố: Tế bào đầu dòng tiết dopamin; Vimentin; Thyroxin hydroxylase Identify Dopaminergic Precursor Cells in Rat’s Embryo by Vimentine and Thyroxin Hydroxylase Summary Objectives: To identify dopaminergic precursor cells in rat mesencephalon tube by vimentine and thyroxin hydroxylase (TH) Methods: Rat mesencephalic cells from embryonic days 12.5 13.5 (E.12.5 - E.13.5) days were dissected, a half of pieces were immunostained with vimentine and TH’s markers; the others were isolated and cultured in the medium composed of DMEM/F12 (1:1), supplemented with b-FGF2, EGF and growth factors Harvest cells were immunostained with these makers Results: While vimentine was positive in almost all cells of the mesencephalon tube, TH was not positive until E.13.5 Ventral mesencephalon cells were proliferated and differentiated after - days culture A large number of harvest cells were positive with vimentin and some of them were positive with TH * Keywords: Dopaminergic precursor cells; Vimentine; Thyroxine hydroxylase ĐẶT VẤN ĐỀ Trước đây, hệ thần kinh coi hệ quan “thầm lặng” thể tế bào không tiếp tục tạo sau trẻ đời Tuy nhiên, Joshep Alman CS Viện Nghiên cứu Massachusette (Hoa Kỳ) đ làm thay đổi quan điểm cơng bố có tồn H3-thymidin, chất đánh dấu phân chia tế bào não chuột cống trắng * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Phúc Hoàn (phuchoan85@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 30/08/2017 Ngày báo đăng: 01/09/2017 179 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 trưởng thành (1962) [1] Sau đó, nhiều nghiên cứu khác đ tồn tế bào gốc thần kinh não [2] Tế bào gốc có khả phân chia phát triển thành tế bào chuyên biệt quan thể Nếu phôi tế bào gốc vạn - chịu trách nhiệm hình thành nên quan, hệ quan thể trưởng thành tế bào gốc đơn tiềm đa tiềm đóng vai trò việc thay tế bào thối hóa, góp phần sửa chữa quan, vùng quan bị tổn thương Như vậy, tế bào gốc nói chung tế bào gốc thần kinh nói riêng phân lập từ nhiều nguồn tế bào khác nhau: sớm từ lúc phơi phôi nang từ phôi giai đoạn phát triển khác người trưởng thành Chính thế, việc định danh tế bào phân lập để nhận biết xác nguồn tế bào sử dụng thách thức lớn với nhà khoa học Với tế bào gốc thần kinh, nhiều marker sử dụng như: nestin, vimentin, musashi 1, SOX1, PAX6… [3] Tuy nhiên, chưa có marker thực đặc hiệu, việc sử dụng phối hợp nhiều marker giúp tăng giá trị chẩn đốn dương tính xét nghiệm Nằm đề tài nghiên cứu ứng dụng quy trình phân lập tế bào gốc não thần kinh phôi chuột để điều trị bệnh Parkinson thực nghiệm, sử dụng hai marker vimentin TH để nhận biết tế bào đầu dòng tiết dopamin tế bào lấy từ não phôi chuột cống trắng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Phôi chuột cống giai đoạn 12,5 - 13,5 ngày tuổi (E.12,5 - E.13,5) Phƣơng pháp nghiên cứu * Mơ hình nghiên cứu: Tạo phơi chuột Não phơi chuột E.12,5 - E.13,5 Nhuộm hóa mơ miễn dịch với vimentin TH Phân lập nuôi cấy tăng sinh * Tạo phôi chuột: - Chuột cống đực trưởng thành nhốt qua đêm (từ 19 ngày hôm trước tới sáng ngày hôm sau) - Kiểm tra phiến đồ âm đạo chuột vào buổi sáng hơm sau Nếu có tinh trùng âm đạo, chuột coi có thai ngày 0,5 Nếu khơng, coi khơng có thai - Phẫu tích lấy phôi chuột vào thời điểm E.12,5 - E.13,5 180 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Trích thủ mơ não phôi chuột E.12,5 - E.13,5: - Cắt rời phần đầu phôi cho vào môi trường HBSS - Đặt não phôi theo mặt ngang, cắt thẳng đứng từ xuống, giới hạn phía trước có rãnh não n o trước, giới hạn phía sau có rãnh não vào não sau - Loại bỏ ngoại bì da màng não phía ngồi kính hiển vi soi * Phân lập nuôi cấy tăng sinh mảnh mơ sàn não phơi chuột: - Phẫu tích cắt bỏ vùng trần não giữa, giữ lại mảnh mô sàn não - Dùng enzym dispase trypsin EDTA để ly giải mô sàn não thành dịch treo - Chuẩn bị mơi trường ni cấy: DMEM/F12 (1:1) có bổ sung thêm transferin (100 mg/ml), insulin (25 ng/ml), progesteron (20 nM), putrescin (62 mM) muối selinit (30 nM), 20 ng/ml EGF FGF-2 (sigma), penicillin (100 UI/ml), streptomycin (100 µg/ml), amphotericin B (0,25 µg/ml) - Ni cấy dịch treo tế bào phân lập với mật độ 1,5 x 104/cm2 slide chambre - Khi tế bào mọc kín đáy slide chambre, tiến hành nhuộm hóa mơ miễn dịch * Kỹ thuật nhuộm hố mơ miễn dịch với marker vimentin TH não phôi chuột: Mảnh mô não phơi chuột sau loại bỏ ngoại bì da màng n o cố định PFA 4% nhiệt độ phòng, tiếp tục ngâm sucrose 20% qua đêm 40C, sau đúc khn OCT để lạnh nhiệt độ -200C đến -800C Dùng máy cắt lạnh cắt lát mỏng - 10 µm tiến hành hoạt hóa kháng ngun dung dịch đệm natri citrat 0,1 M, pH 6,0 96°C, đưa lại nhiệt độ thường rửa nước Tiếp theo, tiến hành block kháng nguyên không đặc hiệu dung dịch 5% NGS, 0,1% triton X-100 PBS 0,1 M Nhuộm kháng thể vimentin (abcam, ab92745 pha loãng 1/300) TH (abcam, ab112 pha loãng 1/750) qua đêm 4°C Rửa PBS 0,1 M lần, sau tiếp tục nhuộm kháng thể huỳnh quang (alexa flour 546 pha lỗng 1/200 nhiệt độ phòng; cuối nhuộm nhân tế bào sytox green (pha loãng 1/10.000) phút Rửa PBS 0,1 M, dán lamelle soi kính hiển vi huỳnh quang * Kỹ thuật nhuộm hóa mơ miễn dịch với marker vimentin TH tế bào não phôi chuột sau nuôi cấy: Các mẫu tế bào sau hút bỏ môi trường nuôi cấy, cố định dung dịch PFA 4% 20 phút Rửa PFA PBS 0,1 M Sau ủ với marker vimentin (abcam, ab92745 pha lỗng 1/300) TH (abcam, ab112 pha loãng 1/750), nhiệt độ 40C qua đêm Tiếp tục phủ kháng thể gắn huỳnh quang (alexa flour 546 pha loãng 1/200) nhiệt độ phòng Nhuộm nhân tế bào sytox green (pha loãng 1/10.000) 30 giây Rửa lần PBS 0,1 M Mẫu tế bào chụp ảnh kính hiển vi huỳnh quang * Chỉ tiêu nghiên cứu: - Hình ảnh não phơi chuột cống trắng E.12,5 nhuộm vimentin, TH - Hình ảnh não phôi chuột cống trắng E.13,5 nhuộm vimentin, TH - Hình ảnh tế bào não phơi chuột sau ni cấy nhuộm vimentin, TH 181 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Thời gian địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành từ tháng 10 - 2014 đến 10 - 2016 Bộ môn Mô phôi, Trường Đại học Y Hà nội * Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm chuột cống trắng đ Hội đồng Đạo đức Trường Đại học Y Hà Nội phê duyệt KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Biểu marker vimentin não phơi chuột E.12,5 - E.13,5 Hình 1: Nhuộm hóa mô miễn dịch marker vimentin thành não phôi chuột E.12,5 - E.13,5 (A, B: biểu marker vimentin (màu đỏ); C,D: nhuộm nhân với sytox (xanh)) Bằng phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch mảnh mơ não phơi chuột cống trắng giai đoạn E.12,5 - E.13,5, quan sát thấy thời điểm E.12,5 (hình 1A) tế bào dương tính với vimentin (màu đỏ), số tế bào có xu hướng tạo nhánh, chạy xuyên suốt thành não giữa, nhân tế bào bắt màu xanh (hình 1B) 182 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Não phơi chuột E.13,5, tế bào ống thần kinh não tăng mạnh số lượng, thành ống dày đặc nhân tế bào Bào tương tế bào bắt màu mạnh với marker vimentin (màu đỏ, hình 1C), nhánh bào tương chạy vng góc với thành não giữa, nhân tế bào bắt màu xanh (hình 1D) Biểu marker TH não phơi chuột E.12,5 - E.13,5 Hình 2: Nhuộm hóa mơ miễn dịch marker TH thành não phôi chuột E.12,5 - E.13,5 (A, B: giai đoạn E.12,5, không thấy biểu marker TH (màu đỏ - A); B: nhuộm nhân màu xanh với sytox; C, D: giai đoạn E.12,5, bắt đầu xuất số tế bào TH (+) (màu đỏ) Hai hình ảnh A, B chụp kênh màu cấu trúc) Khi nhuộm hóa mơ miễn dịch ống thần kinh não phôi chuột với marker TH, không quan sát thấy tế bào có biểu marker giai đoạn E.12,5 (hình 2A, B) Tuy nhiên, giai đoạn E.13,5, bắt đầu quan sát số tế bào dương tính với TH vùng sàn não (hình 2C, D) 183 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Biểu marker vimentin TH tế bào não phôi chuột sau nuôi cấy Hình 3: Nhuộm hóa mơ miễn dịch marker vimentin TH tế bào não phôi chuột sau nuôi cấy (A, B: hình ảnh sau ni cấy ngày, nhiều tế bào dương tính với marker vimentin (màu đỏ - A); nhân tế bào màu xanh với sytox (B); hình ảnh 3A 3B hai kênh màu chụp cấu trúc C, D: hình ảnh sau ni cấy ngày, số tế bào dương tính với marker TH (màu đỏ - AC); nhân tế bào màu xanh với sytox (D); hình ảnh 3C 3D hai kênh màu chụp cấu trúc) Các tế bào sàn não phôi chuột E.12,5 - E.13,5 ngày phân lập nuôi cấy tăng sinh môi trường chuyên biệt, thu nhiều cụm tế bào “dạng nơ ron”: có nhiều nhánh bào tương, nhánh dài ngắn khác nhau, có xu hướng nối với tạo thành mạng lưới Sau - ngày nuôi cấy, tế bào nhuộm với marker vimentine TH, kết cho thấy hầu hết tế bào ni cấy dương tính với marker vimentin, số tế bào dương tính với marker TH (hình 3) 184 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 BÀN LUẬN Về marker vimentin Vimentin loại xơ trung gian tham gia cấu tạo khung tế bào, có vai trò việc vận chuyển số phần tử protein nhân màng tế bào Từ năm 1980, vimentin đ sử dụng marker đánh dấu tế bào gốc thần kinh Tapscott CS (1981) quan sát thấy vimentin tế bào vùng ống thần kinh phôi gà 33 - 38 sau thụ tinh phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch Fedoroff CS (1983) nghiên cứu biểu vimentin vùng não phôi chuột 14 ngày, kết thấy tế bào dương tính mạnh với marker vimentin âm tính với marker GFAP - marker đánh dấu nơ ron trưởng thành Tuy nhiên, chuột sinh - n o cấu tạo chủ yếu nơ ron trưởng thành, tế bào có biểu dương tính với hai loại marker [4] Trong nghiên cứu này, quan sát thấy xơ vimentin tế bào ống thần kinh phôi chuột (hình 1) Các nhánh bào tương chứa xơ vimentin có xu hướng tạo góc với thành não biểu dương tính mạnh giai đoạn muộn (E.13,5) so với giai đoạn sớm (E.12,5) Theo Shults (1990), tế bào tế bào thần kinh xuyên tâm (radial glial cell) có vai trò q trình di cư nơ ron tiết dopamin nguồn gốc nơ ron tế bào thần kinh đệm thể trưởng thành [5] Tuy vậy, hạn chế lớn vimentin biểu khơng tế bào gốc thần kinh mà nơ ron trưởng thành số loại tế bào có nguồn gốc trung mơ Vì vậy, ngày ngồi vimentin, nhà nghiên cứu sử dụng nestin - loại xơ trung gian khác để đánh dấu tế bào gốc thần kinh nestin thường khơng có biểu nơ ron đ trưởng thành Mặc dù vậy, phủ nhận vimentin loại xơ trung gian xuất sớm loại xơ khác q trình hình thành biệt hóa tế bào thần kinh [4, 6, 7] Về marker TH TH enzym tham gia vào trình tổng hợp dopamin Trong nghiên cứu này, không quan sát thấy tế bào dương tính với marker TH ống thần kinh não phôi chuột giai đoạn E.12,5 Tuy nhiên, giai đoạn E.13,5, bắt đầu thấy có xuất tế bào dương tính với marker TH (hình 2) Các tế bào xuất dương tính với marker TH nằm vị trí sàn não Theo Shults (1990), bắt đầu quan sát tế bào dương tính với marker TH ống thần kinh phôi chuột giai đoạn E13 Ban đầu, tế bào có hình đa diện nằm dọc theo sàn não giữa, không thấy nhiều mối liên hệ với tế bào xuyên tâm Sang giai đoạn E14, quan sát thấy tế bào có xu hướng nằm dọc theo nhánh tế bào xuyên tâm bắt đầu trình di cư từ vùng sàn não hướng phía đầu phôi trục phôi Phôi giai đoạn E.15 - E.18 diễn di cư mạnh mẽ tác giả quan sát thấy nhiều nơ ron dương tính với TH sàn não [5] Chính biệt hóa nơ ron tiết dopamin sàn não giữa, chúng tơi sử dụng mảnh mơ sàn não 185 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 phơi chuột giai đoạn E.12,5 E.13,5 để ni cấy Mục đích giúp tăng sinh tế bào tiết dopamin Kết sau trình ni cấy khoảng - ngày, chúng tơi thu lượng lớn nơ ron đĩa cấy Các nơ ron có xu hướng mọc thành cụm tế bào (neurosphere) Các tế bào sau nuôi cấy tiếp tục sử dụng marker vimentin TH để đánh giá Kết thu khả quan, gần toàn tế bào sau q trình ni cấy dương tính với marker vimentin có số tế bào, cụm tế bào dương tính với marker TH (hình 3) Tuy marker TH quan sát thấy dương tính tế bào ống thần kinh phôi chuột giai đoạn E.13,5, lấy não phôi chuột giai đoạn E.12,5 nuôi cấy, thu nơ ron tiết dopamin với số lượng không nhỏ so với tuổi phơi giai đoạn E.13,5 Điều giải thích, việc xuất enzym thyroxin hydroxylase bào tương tế bào tiết dopamin coi giai đoạn cuối q trình biệt hóa nơ ron tiết dopamin in vivo Thực tế, góc độ sinh học phân tử, nơ ron đ “cam kết biệt hóa” thành nơ ron tiết dopamin trước Theo nghiên cứu Emily Gale (2008), q trình biệt hóa tế bào ống thần kinh thành nơ ron tiết dopamin chuột nhắt giai đoạn E.7,75 Ban đầu, tế bào sàn não tiếp nhận tín hiệu Shh FGF8 Ở bên tế bào diễn loạt phản ứng sinh học, dẫn tới biệt hóa thành tế bào đầu dòng tiết dopamin có biểu gen LmxIa, MsxI Foxa2 Các tế bào tiếp tục phân chia biểu marker nơ ron TujI NurrI 186 Cuối cùng, biểu TH Pitx3 xuất sớm vào giai đoạn E.11,5 Tuy nhiên, giai đoạn sớm, phát kỹ thuật sinh học phân tử [8] KẾT LUẬN Trong đề tài này, sử dụng nguồn tế bào ống thần kinh não phôi chuột để nghiên cứu, tế bào sau q trình ni cấy tiếp tục phân chia biệt hóa thành tế bào “dạng nơ ron” có diện enzym thyroxin hydroxylase bào tương Vì vậy, việc sử dụng marker vimentin TH để xác định quần thể tế bào gốc thần kinh nói chung tế bào đầu dòng tiết dopamin nói riêng phù hợp Tuy vimentin loại xơ trung gian xuất sớm tế bào gốc thần kinh nhà nghiên cứu sử dụng làm marker đánh dấu tế bào gốc thần kinh từ giai đoạn đầu, tính đặc hiệu vimentin khơng cao Vì vậy, dùng marker vimentin để đánh dấu tế bào gốc thần kinh giai đoạn phơi thai Còn thể trưởng thành hay phôi giai đoạn sớm (phôi dâu, phôi nang), cần kết hợp nhiều marker khác để tăng giá trị chẩn đốn dương tính xác định tế bào gốc thần kinh LỜI CẢM ƠN Nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn tới Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc Gia, Bộ Khoa học Công nghệ đ tài trợ cho nghiên cứu TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 mesencephalon of the rat Neuroscience 1990, 38 (2), pp.427-36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Altman J Are new neurons formed in the brain of adult mammals Science 1962, 135, pp.1127-8 Stagaard M, Mollgard K The developing neuroepithelium in human embryonic and fetal brain studied with vimentin-immunocytochemistry Williams J.P Neurons Neurobiology 2001, 11, pp.564-7 stem cells Anat Embryol (Berl) 1989, 180 (1), pp.17-28 Dahlstrand J, Lardelli M, Lendahl U Nestin Bazan E et al In vitro and in vivo characterization of neural stem cells Histol Histopathol 2004, 19 (4), pp.1261-75 mRNA expression correlates with the central Webster F, Astrom K.E Gliogenisis: Historical Perspectives 2009, 108, pp.1839-1985 system Brain Res Dev Brain Res 1995, 84 (1), Shults C.W et al Dopaminergic cells align Gale E, Li M Midbrain dopaminergic neuron fate specification: of mice and embryonic stem cells Mol Brain 2008, 1, pp.8 along radial glia in the developing nervous system progenitor cell state in many, but not all, regions of developing central nervous pp.109-29 NUÔI CẤY TĂNG SINH VÀ BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO GỐC NGOẠI BÌ THẦN KINH NÃO GIỮA PHÔI CHUỘT CỐNG TRẮNG 187 ... lập tế bào gốc não thần kinh phôi chuột để điều trị bệnh Parkinson thực nghiệm, sử dụng hai marker vimentin TH để nhận biết tế bào đầu dòng tiết dopamin tế bào lấy từ não phôi chuột cống trắng. .. thành tế bào “dạng nơ ron” có diện enzym thyroxin hydroxylase bào tương Vì vậy, việc sử dụng marker vimentin TH để xác định quần thể tế bào gốc thần kinh nói chung tế bào đầu dòng tiết dopamin. .. HỌC-2017 Biểu marker vimentin TH tế bào não phôi chuột sau ni cấy Hình 3: Nhuộm hóa mơ miễn dịch marker vimentin TH tế bào não phôi chuột sau ni cấy (A, B: hình ảnh sau ni cấy ngày, nhiều tế bào dương