Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá khả năng bảo quản lạnh sâu mô tinh hoàn chuột cống trắng chưa trưởng thành khi sử dụng phương pháp hạ nhiệt độ theo chương trình và phương pháp thuỷ tinh hoá.
Tạp chí y - dợc học quân số 6-2016 KẾT QUẢ BẢO QUẢN LẠNH SÂU MƠ TINH HỒN CHUỘT CỐNG TRẮNG CHƯA TRƯỞNG THÀNH Nguyễn Thị Hiệp Tuyết*; Bùi Thanh Thủy* Phạm Minh Huệ*; Nguyễn Khang Sơn** TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá khả bảo quản lạnh sâu mơ tinh hồn chuột cống trắng chưa trưởng thành sử dụng phương pháp hạ nhiệt độ theo chương trình phương pháp thuỷ tinh hoá Phương pháp: bảo quản mơ tinh hồn chuột cống trắng chưa trưởng thành (5 tuần tuổi) phương pháp đơng chậm theo chương trình thủy tinh hóa tuần Kết quả: tỷ lệ ống sinh tinh (OST) bảo vệ tốt hai phương pháp 79,9% 34,2% Đường kính OST giảm nhẹ phương pháp đơng chậm tăng lên phương pháp thuỷ tinh hóa Tuyến kẽ không bị tổn thương sau bảo quản hai lô thực nghiệm 70,5% 28,4% Kết luận: mơ tinh hồn bảo quản tốt nitơ lỏng Phương pháp đơng chậm theo chương trình bảo vệ mơ tinh hồn tốt so với phương pháp thủy tinh hóa * Từ khố: Mơ tinh hồn; Bảo quản lạnh sâu; Đơng chậm theo chương trình; Thủy tinh hóa Result of Cryopreservation of Immature Rat Testicular Tissue Summary Objectives: To evaluate the ability of cryopreservation of immature rat testicular tissue when using the controlled slow freezing and vitrification Subjects and methods: Testicular tissue of immature rat (5 weeks) were cryopreserved by controlled slow freezing and vitrification in weeks Results: Structure seminiferous tubules were protected well which were 79.9% and 34.2%, respectively Tubular diameter decreased slightly in controlled slow freezing and increased in vitrification Intact Leydig cell clusters were seen in 70.5% and 28.4%, respectively Conclusion: Testicular tissue can be cryopreserved in liquid nitrogen Controlled slow freezing protected testicular tissue better than vitrification * Key words: Testicular tissue; Cryopreservation; Controlled slow freezing; Vitrification ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, tỷ lệ trẻ trai sống lâu sau điều trị ung thư tăng cao Tuy nhiên, điều trị ung thư có nguy làm giảm khả sinh sản ảnh hưởng độc hại trị liệu lên biểu mơ tinh q trình sinh tinh Đến nay, chưa có liệu pháp cụ thể để giúp trẻ trai phục hồi chức sinh sản nội tiết sau điều trị ung thư [2] Bảo quản mơ tinh hồn, ứng dụng ni cấy tế bào ghép lại mô sau bảo quản phương pháp tiềm lớn việc bảo tồn khả sinh sản cho nam giới * Trường Đại học Y - Dược Thái nguyên ** Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Hiệp Tuyết (huynhthituyet@hosrem.vn) Ngày nhận bài: 20/05/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/07/2016 Ngày báo đăng: 22/07/2016 36 Tạp chí y - dợc học quân số 6-2016 Đơng lạnh chậm theo chương trình phương pháp nhiều tác giả nghiên cứu cho thấy khả bảo quản tốt mảnh mô [3, 4] Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi cần có máy hạ nhiệt, tiêu tốn nhiều nitơ lỏng thời gian hạ nhiệt Bên cạnh đó, số nghiên cứu lại cho thấy phương pháp đơng nhanh thuỷ tinh hố mảnh mơ thu kết tốt [3] Phương pháp đông nhanh giúp tiết kiệm trang thiết bị, nitơ lỏng thời gian thực quy trình Tuy nhiên, phương pháp cần nồng độ cao chất bảo vệ lạnh, có khả gây độc cho tế bào Hiện chưa có nhiều nghiên cứu so sánh khả bảo vệ mơ tinh hồn hai phương pháp đơng lạnh Chúng tiến hành nghiên cứu thực nghiệm nhằm: Đánh giá khả bảo quản lạnh sâu mô tinh hoàn chuột cống trắng chưa trưởng thành sử dụng phương pháp hạ nhiệt độ theo chương trình phương pháp thuỷ tinh hoá ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng phân lô nghiên cứu 75 mẫu mơ tinh hồn 15 chuột cống trắng chưa trưởng thành (5 tuần tuổi) chia thành lô: - Lơ A1 (lơ chứng): 25 mẫu tinh hồn tươi, khơng bảo quản lạnh - Lô A2: 25 mẫu bảo quản nitơ lỏng, đơng chậm theo chương trình - Lô A3: 25 mẫu bảo quản nitơ lỏng, đơng nhanh thủy tinh hóa Phương pháp phương tiện nghiên cứu - Phương pháp: nghiên cứu thực nghiệm mơ tả có đối chứng - Phương tiện: máy hạ nhiệt độ theo chương trình Nicool 40PC; kính hiển vi đa Zeiss - Axioplan kết hợp với camera máy tính, sử dụng phần mềm KS400 thiết bị phục vụ làm tiêu mô học Quy trình nghiên cứu Tinh hồn chuột cắt thành mảnh nhỏ vị trí sát với màng trắng: kích thước - mm3 với phương pháp đông chậm với nhóm chứng; kích thước - mm3 với phương pháp đông nhanh (tham khảo theo Baert Y, 2013) [3] - Quy trình bảo quản lạnh mơ tinh hồn sử dụng phương pháp đơng chậm theo chương trình rã đông Mẫu mô bảo quản rã đơng tham khảo theo quy trình Wyns C (2008) [3] Các mẫu mô sau rửa HBSS, đưa vào ống cryovial 1,8 ml (5 mẫu/ống), có chứa 1,5 ml dung dịch chất bảo quản lạnh (4oC) gồm: 0,7 M DMSO; 0,1 M sucrose 10% FBS pha dung dịch HBSS Sử dụng máy Nicool 40 PC để hạ nhiệt: để mẫu 4oC 30 phút, sau hạ với tốc độ 1oC/phút đến 0oC, để phút; tiếp tục hạ với tốc độ -0,5oC/phút đến -8oC, để 15 phút, thực bước tạo tinh thể đá nhân tạo (seeding); sau hạ nhiệt với tốc độ -0,5oC/phút đến -40oC, để 10 phút; tiếp tục hạ nhiệt với tốc độ -7oC/phút đến -70oC; mẫu đạt -70oC, chuyển mẫu vào nitơ lỏng 37 T¹p chí y - dợc học quân số 6-2016 Sau tuần bảo quản nitơ lỏng, thực rã đông theo bước: để ống bảo quản nhiệt độ phòng phút Sau ngâm vào cốc nước ấm 37oC băng tan hết (2 phút) Cuối cùng, rửa mẫu lần qua nồng độ sucrose giảm dần (0,1 M; 0,05 M; M) pha HBSS lạnh, lần phút - Quy trình bảo quản lạnh mơ tinh hồn theo phương pháp thủy tinh hóa rã đơng: Mẫu mơ tinh hồn chuột bảo quản rã đông, tham khảo theo quy trình Baert Y (2012) [2] Với quy trình đông lạnh, mẫu mô ngâm dung dịch DMEM có pha 1,05 M DMSO 1,35 M EG 10 phút Sau ngâm dung dịch DMEM có pha 2,1 M DMSO, 2,7 M EG, 20% FBS 0,5 M sucrose phút Cuối cùng, chuyển mẫu mô sang ống cryovial 1,8 ml nitơ lỏng Các mẫu rã đông sau bảo quản tuần nitơ lỏng Rã đông theo bước: nhỏ trực tiếp dung dịch DMEM pha 0,5 M sucrose 20% FBS nhiệt độ 37oC vào ống chứa mẫu, giữ ống nhiệt độ 37oC phút Tiếp theo, rửa mẫu dung dịch DMEM pha 20% FBS 37oC phút Chỉ tiêu nghiên cứu - Đánh giá hình thái học OST: + Số lượng đường kính OST tổng hợp tồn mẫu lơ + Đánh giá hình thái cấu trúc OST (tham khảo Keros V 2005 [5]: cấu trúc biến đổi, ngun vẹn: điểm; tổn thương nhẹ < 50%: điểm; tổn thương nhiều > 50%: điểm OST đạt điểm coi bảo vệ tốt 38 + Đánh giá tế bào biểu mô tinh: đánh giá tỷ lệ % OST với loại tế bào có hình thái bình thường, tham khảo theo phương pháp đánh giá Milazzo JP (2008) [6] Hình thái tế bào bình thường: nhân tế bào tròn, cân đối, chất nhiễm sắc phân bố đều, màng nhân mịn Bào tương tế bào mịn, tế bào xếp sát Hình thái bị tổn thương: nhân tế bào bị đơng vón, bào tương thối hóa, tế bào tách rời - Đánh giá mô kẽ: đánh giá tan rã mô kẽ Quan sát cụm tuyến kẽ, đếm số lượng cụm đánh giá có bị tổn thương hay khơng dựa vào hình thái tế bào Leydig (giống đánh giá tế bào biểu mô tinh) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hình thái OST mơ tinh hồn chuột sau bảo quản lạnh sâu Sau bảo quản lạnh sâu, mô tinh hồn lơ chuột có nhiều OST giữ cấu trúc gần bình thường (đạt điểm) Bên cạnh đó, có OST bị tổn thương với đặc điểm: tế bào biểu mơ có nhân bị đơng vón, bắt màu đậm; bào tương thối hóa, biểu mô tinh xuất khoảng trống Ở phương pháp đơng chậm theo chương trình: tế bào thối hóa bong khỏi màng đáy có xu hướng co cụm lại Với phương pháp đông nhanh: tế bào thối hóa trương to, rời rạc liên kết, OST giãn rộng, xuất khoảng trống rộng vị trí lòng ống tương lai Các dạng tổn thương mức độ nhẹ (1 điểm) đến mức độ nặng (0 điểm) (hình 1, 2, 3) T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2016 2 1 A1 A3 A2 Hình 1: OST chuột chưa trưởng thành trước (A1) sau bảo quản lạnh sâu đạt điểm (H&E x 400): A1 Trước bảo quản; A2 Sau bảo quản đông chậm; A3 Sau bảo quản thuỷ tinh hố; OST; Mơ kẽ 2 1 A3 A2 Hình 2: OST chuột chưa trưởng thành sau bảo quản lạnh sâu đạt điểm (H&E x 400): OST; Mô kẽ 1 A2 A3 Hình 3: OST chuột chưa trưởng thành sau bảo quản lạnh sâu đạt điểm (H&E x 400): OST; Mơ kẽ 39 T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2016 Bng 1: Cht lượng OST mơ tinh hồn chuột trước sau bảo quản lạnh sâu Lô nghiên cứu điểm điểm điểm điểm + điểm p Lô A1 91,3% 6,2% 2,5% 97,5% Lô A2 23,4% 56,5% 20,1% 79,9% p(A1-A2) < 0,05 p(A1-A3) < 0,05 p(A2-A3) < 0,05 Lô A3 2,5% 31,7% 65,8% 34,2% Mơ tinh hồn trước bảo quản (tươi) có tỷ lệ nhỏ số OST bị biến đổi cấu trúc nhiều (loại điểm) Tuy nhiên, sau bảo quản lạnh sâu, tỷ lệ tăng khác biệt so với trước bảo quản nhóm Bảng 2: Tỷ lệ OST loại tế bào có hình thái bình thường mơ tinh hồn chuột trước sau bảo quản lạnh sâu Tỷ lệ OST tế bào có hình thái bình thường Tế bào Sertoli Tinh nguyên bào Tinh bào Tổng số OST khảo sát Lô A1 95,7% 95,4% 97,1% 678 Lô A2 71,1% 63,9% 55,9% 696 Lô A3 25,8% 21,3% 7,6% 445 Lô nghiên cứu p(A2-A1) < 0,05 p p(A3-A1) < 0,05 p(A2-A3) < 0,05 Ở hai lô thực nghiệm, tế bào bị tổn thương nhiều so với không bảo quản Phương pháp đông nhanh cho thấy tế bào bị tổn thương nhiều, tinh nguyên bào bị tổn thương nhiều nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê Bảng 3: So sánh đường kính OST trước sau bảo quản lạnh sâu Lô Tổng số OST Lô A1 678 135,76 ± 22,72 p (A1-A2) < 0,05 Lô A2 696 132,97 ± 18,50 p (A1-A3) < 0,05 Lô A3 445 146,03 ± 21,04 Đường kính OST (µm) ± SD p p (A2-A3) < 0,05 Sau bảo quản lạnh, đường kính OST lơ theo phương pháp đơng chậm giảm nhẹ so với lô chứng; lô đông nhanh, kích thước tăng lên so với lơ chứng, khác biệt có ý nghĩa thống kê * Đặc điểm mơ kẽ: Ở mơ tinh hồn tươi, mơ kẽ nằm xen OST chúng khơng có khoảng trống Trong mơ kẽ có tuyến kẽ, tạo số tế bào kẽ (tế bào Leydig) nằm cạnh mao mạch Sau bảo quản lạnh sâu, số nơi mô kẽ có tượng bị tan rã: OST 40 T¹p chí y - dợc học quân số 6-2016 khụng nằm sát với có cụm tuyến kẽ nằm tách rời khỏi OST (hình 4) Tỷ lệ cụm tuyến khơng bị tổn thương mơ tinh hồn bảo quản phương pháp đơng chậm theo chương trình 70,5%, phương pháp thủy tinh hóa: 28,4% 2 1 A3 A2 Hình 4: Hình ảnh mơ tinh hồn chuột chưa trưởng thành sau bảo quản lạnh sâu lô A2 lô A3 (H&E x 150) OST; Tuyến kẽ Bảng 4: Đặc điểm hình thái tuyến kẽ mơ tinh hồn chuột sau bảo quản lạnh sâu Đặc điểm Không tổn thương Tổn thương Tổng số cụm tuyến Lô A2 70,5% 29,5% 413 Lô A3 28,4% 71,6% 261 Lô nghiên cứu p p(A2-A3) < 0,05 Phương pháp đơng chậm theo chương trình tuyến kẽ bảo vệ tốt mặt hình thái so với phương pháp thủy tinh hóa BÀN LUẬN Sau bảo quản lạnh sâu, hình ảnh tổn thương OST thường thấy là: vỏ xơ màng đáy bong khỏi biểu mô tinh; tế bào tổn thương thối hóa liên kết, nhân tế bào tròn nhỏ, bắt màu đậm so bình thường; biểu mơ hình thành khoảng trống nhỏ tế bào Đây tác động không mong muốn việc bảo quản lạnh Tuy nhiên, nghiên cứu này, sau bảo quản lạnh sử dụng phương pháp đông chậm theo chương trình, phần lớn OST bảo vệ tốt: mơ tinh hồn chuột chưa trưởng thành có tỷ lệ OST bảo vệ tốt (2 điểm điểm) đạt 79,9% Rõ ràng, OST bảo vệ tốt đảm bảo chức sau Nghiên cứu cho thấy mô tinh hồn chuột bảo vệ tốt đơng lạnh chậm theo chương trình Kết phù hợp với nghiên cứu số tác giả khác [1, 3, 5] Nhận định tác động phương pháp thủy tinh hóa lên mơ tinh hồn chuột chưa trưởng thành cho thấy phương pháp ảnh hưởng nặng 41 T¹p chí y - dợc học quân số 6-2016 lờn cấu trúc OST Các tổn thương biểu mô tinh là: tế bào trương to, méo mó, nhân đơng vón, khoảng gian bào giãn rộng, ranh giới tế bào rõ, xuất khoảng trống rộng vị trí lòng ống tương lai Kết quả: tỷ lệ OST bảo vệ tốt 34,2%, kết thấp nhiều so với nghiên cứu Baert (2012) [2] Chúng thấy loại tế bào biểu mô tinh, tinh bào tế bào bị tổn thương nhiều Tinh bào tế bào có kích thước lớn (25 µm), bào tương chứa nhiều bào quan, tích lũy nhiều chất dinh dưỡng giai đoạn giảm phân, tinh bào bị tổn thương nhiều so với tế bào khác tác động trình đơng lạnh sâu Ở mơ tinh hồn chuột chưa trưởng thành, OST liên kết chặt chẽ với Vì vậy, khả thẩm thấu chất bảo vệ vào tế bào biểu mơ tinh khó khăn hơn, ống nằm vị trí trung tâm mảnh mô Đặc biệt, phương pháp đông nhanh, thời gian tiếp xúc mảnh mô với chất bảo vệ ngắn so với với phương pháp đông chậm Lòng OST tinh hồn chuột chưa trưởng thành nghiên cứu chưa xuất Biểu mô tinh tinh hoàn chuột chưa trưởng thành bao gồm tế bào Sertoli, tinh nguyên bào tinh bào Trong đó, tinh bào chiếm số lượng lớn dễ bị tổn thương Do vậy, kết thu thấp bảo quản theo phương pháp đơng nhanh Đường kính OST phương pháp đơng chậm theo chương trình giảm nhẹ so với lơ chứng [7] Đường kính giảm phù hợp 42 với biến đổi hình thái OST, đặc biệt ống tổn thương nặng (0 điểm): nhân tế bào đơng vón, bào tương tế bào ly giải, tế bào co cụm, tách rời khỏi màng đáy; bên cạnh tỷ lệ ống điểm khơng nhiều (20,1%) Vì vậy, đường kính OST giảm hai lơ sau bảo quản đông chậm không nhiều Đối với phương pháp thủy tinh hóa, đường kính OST tăng so với lơ chứng [8] Chúng tơi nhận thấy, đường kính OST tăng phụ thuộc vào tỷ lệ OST bị tổn thương nặng (0 điểm) chiếm số lượng nhiều (65,8%) Cùng với việc bảo tồn chức sinh sản, trì nội tiết mối quan tâm nhà nghiên cứu [3, 5, 7, 9] Trong nghiên cứu này, thực đánh giá chất lượng tuyến kẽ dựa vào đặc điểm hình thái tế bào Leydig, độ tập trung tế bào quanh mạch máu Kết cho thấy, mặt hình thái, sau bảo quản lạnh sâu, tuyến kẽ bảo vệ tốt phương pháp đông chậm Đây nghiên cứu bước đầu bảo quản mơ tinh hồn, nên chúng tơi dừng lại mặt đánh giá hình thái Chúng tơi định nghiên cứu tiếp để đánh giá chức nội tiết tế bào Leydig sau bảo quản KẾT LUẬN - Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy: mô tinh hồn chuột cống trắng chưa trưởng thành bảo quản tốt nitơ lỏng - Tỷ lệ OST bảo vệ tốt phương pháp đông lạnh chậm đơng lạnh nhanh thuỷ tinh hố 79,9% 34,2% Đường kính OST giảm nhẹ phương pháp đơng chậm tăng lên phương pháp T¹p chí y - dợc học quân số 6-2016 thu tinh hóa Tuyến kẽ khơng bị tổn thương sau bảo quản lô thực nghiệm 70,5% 28,4% - Phương pháp đông lạnh chậm theo chương trình có xu hướng tốt bảo quản lạnh sâu mơ tinh hồn TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Thị Thu Hiền Nghiên cứu trữ lạnh tinh trùng từ mào tinh mơ tinh hồn để hỗ trợ sinh sản Luận văn Thạc sĩ Y học Học viện Quân Y Hà Nội 2011 Baert Y, Ellen Goossens, Dorien Van Saen et al Orthotopic grafting of cryopreserved prepubertal testicular tissue: in search of a simple yet effective cryopreservation protocol, Fertility and Sterility 2012, 97 (5), pp.1152-1157 Baert Y, Van Saen D, Haentjens P et al What is the best cryopreservation protocol for human testicular tissue banking? Hum Reprod 2013, 28 (7), pp.1816-1826 Wyns C, Van Langendonckt A, Wese FX et al Long-term spermatogonial survival in cryopreserved and xenografted immature human testicular tissue Hum Reprod 2008, 23 (11), pp.2402-2414 Keros V, Rosenlund B, Hultenby K et al Optimizing cryopreservation of human testicular tissue-comparison of protocols with glycerol, propanediol and dimethyl sulphoxide as cryoprotectants Hum Reprod 2005, 20, pp.1676-1687 Milazzo JP, Vaudreuil L, Cauliez B et al Comparison of conditions for cryopreservation of testicular tissue from immature mice Hum Reprod 2008, 23, pp.17-28 Kvist K, Thorup J, Byskov AG et al Cryopreservation of intact testicular tissue from boys with cryptorchidism Hum Reprod 2006, 21, pp.484-491 Mara C, Magali V, Christiani AA et al Cryopreservation of prepubertal mouse testicular tissue by vitrification Fertility and Sterility 2011, 95 (4), pp.1229-1234 Cengiz Y, Brendan M, Keith J et al Effect of different cryoprotectant agents on spermatogenesis efficiency in cryopreserved and grafted neonatal mouse testicular tissue Cryobiology 2013, 67 (1), pp.70-75 43 ... OST chuột chưa trưởng thành trước (A1) sau bảo quản lạnh sâu đạt điểm (H&E x 400): A1 Trước bảo quản; A2 Sau bảo quản đông chậm; A3 Sau bảo quản thuỷ tinh hố; OST; Mơ kẽ 2 1 A3 A2 Hình 2: OST chuột. .. 2 1 A3 A2 Hình 2: OST chuột chưa trưởng thành sau bảo quản lạnh sâu đạt điểm (H&E x 400): OST; Mô kẽ 1 A2 A3 Hình 3: OST chuột chưa trưởng thành sau bảo quản lạnh sâu đạt điểm (H&E x 400): OST;... tiếp xúc mảnh mô với chất bảo vệ ngắn so với với phương pháp đơng chậm Lòng OST tinh hoàn chuột chưa trưởng thành nghiên cứu chưa xuất Biểu mô tinh tinh hoàn chuột chưa trưởng thành bao gồm tế