Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định sự biệt hóa in vitro các tế bào mầm trong tinh hoàn thành các tế bào tinh trùng trưởng thành. Nghiên cứu thực hiện trên các mẫu mô tinh hoàn chuột trưởng thành được thu nhận để phân lập các tế bào mầm. Các tế bào mầm và các tế bào đã biệt hóa như Sertoli được đồng nuôi cấy trong môi trường GAMETE-100 bổ sung với hormone FSH và testosteron.
BIỆT HÓA IN VITRO CÁC TẾ BÀO MẦM TỪ MẢNH MƠ TINH HỒN CHUỘT Phạm Văn Phúc*, Trương Định*, Huỳnh Thị Lệ Duyên*, Phan Kim Ngọc* TÓMTẮT Mục tiêu: Xác định biệt hóa in vitro tế bào mầm tinh hoàn thành tế bào tinh trùng trưởng thành Phương pháp: Các mẫu mơ tinh hồn chuột trưởng thành thu nhận để phân lập tế bào mầm Các tế bào mầm tế bào biệt hóa Sertoli đồng ni cấy mơi trường GAMETE-100 bổ sung với hormone FSH testosteron Các mẫu nuôi cấy đánh giá sau 24 48 Sự trưởng thành tế bào mầm đánh giá thơng qua hình thành (tiêm mao) Kết quả: Các tế bào mầm tồn tinh hồn thu nhận ni cấy in vitro Các số liệu thu cho thấy với nồng độ FSH 50 IU/ml testosteron µM/ml thích hợp cho việc ni cấy biệt hóa tế bào mầm thành tinh trùng Kết luận: FSH có vai trò quan trọng lên trưởng thành tế bào mầm, testosteron khơng có tác động Tuy nhiên, việc kết hợp FSH testosteron cho kết cao sử dụng FSH hay testosteron ABSTRACT IN VITRO GERM CELLS DIFFERENTIATION OF MOUSE TESTICULAR TISSUES Pham Van Phuc, Truong Dinh, Huynh Thi Le Duyen, Phan Kim Ngoc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 11 - No - 2007: 219 - 223 Objective: To identify in vitro germ cells differentiation of mouse testicular tissues to mature sperms Method: Testis tissues derived from mouse adult testis is used for isolation germ cells Germ cells and some of different cells such as Sertoli are co-cultured in vitro in medium GAMETE-100, plus with FSH and Testosterone After 24 and 48h of culture, progression of spermatogenesis and percentage of matured germ cells are evaluated Maturation of germ cells are evaluated via appearance of tails (flagella) Result: Germ cells of testicular tissues can be is olated and cultured in vitro Data showed that suitable FSH concentration is 50 IU/L and testosterone is µM/L Conclusion: FSH has an important role in maturation of germ cells In contrast with FSH, testosterone does not almost stimulate germ cell's maturation However, combination of FSH and testosterone can resulted in maturation of germ cells better than if using only FSH or testosterone ĐẶTVẤNĐỀ Trong trình phát triển phơi, tế bào mầm hình thành di cư vào quan sinh dục Khác với cá thể cái, toàn tế bào mầm vào trình giảm phân ngừng prophase II; tế bào mầm cá thể đực lại nguyên phân đến tuổi dậy bắt đầu giảm phân Do đó, thể trưởng thành, tinh hoàn tồn lượng lớn tế bào mầm sinh tinh(2) Trong số trường hợp vô sinh người, ngừng phân chia tế bào mầm thể đực khơng kích hoạt thích hợp cho tiếp tục giảm phân bình thường; hậu khơng có tinh trùng trưởng thành hình thành Các nghiên cứu gần cho thấy tế bào mầm thể trưởng thành cá thể đực tiếp tục trình giảm phân tạo tinh trùng trưởng thành in 220 * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP HCM vitro Trong môi trường ni cấy, FSH testosteron chứng minh có vai trò trưởng thành tế bào mầm sinh tinh in vitro(4,5) Với kĩ thuật này, người ta hi vọng vào phương pháp điều trị vô sinh kết hợp với kĩ thuật ICSI (vi tiêm tinh trùng vào bào tương trứng) Theo phương pháp này: mảnh sinh thiết tinh hoàn thu nhận, sau chúng ni cấy biệt hóa invitro thành tinh trùng trưởng thành cuối sử dụng kĩ thuật ICSI để vi tiêm vào trứng(3) Ngồi ý nghĩa điều trị vơ sinh, việc ni cấy biệt hóa in vitro tế bào mầm tinh hồn thành tinh trùng trưởng thành ý nghĩa lớn bảo tồn giống, bảo tồn nguồn gen Trong nghiên cứu này, sử dụng mảnh biểu mô tinh hoàn chuột trưởng thành để thu nhận tế bào cho ni cấy Đây xem mơ hình cho nghiên cứu xa ĐỐITƯỢNGVÀPHƯƠNGPHÁP Thu nhận tinh hoàn Chuột đực trưởng thành bị giết chết kéo dãn khớp cổ Giải phẫu, kéo tuột lớp da đến hết hai tinh hoàn Thu nhận hai tinh hoàn, cho vào dung dịch PBSA Thu nhận tế bào đơn Các mảnh mơ tinh hồn đặt vào mơi trường GAMETE-100 (Vitrolife) Tiến hành ép mảnh mô hai miếng lame Các mảnh mô phân tách phần lực học Sau đó, chuyển tồn mảnh mô sau ép vào dung dịch collagenase IV (1000 U/ml, Sigma), ủ 370C, 15-30 phút Huyền phù tế bào thu nhận li tâm 2500 vòng/phút phút, thu cặn Tái huyền phù cặn môi trường GAMETE-100 làm ấm 300C Ni cấy biệt hóa Nhiều cơng trình nghiên cứu in vitro khảo sát in vivo cho thấy, việc trưởng thành tinh trùng (hay biệt hóa từ tế bào mầm sinh dục) kiểm soát hai hormone FSH (Puregon, Organon) testosteron (Puregon, Organon) Vì nồng độ FSH tác động lên biệt hóa chưa xác định rõ ràng, nên nghiên cứu này, tiến hành khảo sát tác động hormone FSH lên trưởng thành với nồng độ khác nhau: 10 IU/L, 25 IU/L, 50 IU/L, 100 IU/L Trong đó, nồng độ testosteron xác định trong tinh hoàn µM/L(5) Nghiệm thức 1: Xác định nồng độ FSH tối ưu Nghiệm thức tiến hành lô, lơ lặp lại lần Trong đó, lơ lô đối chứng, tế bào nuôi môi trường không bổ sung hormone Các lô 2,3,4,5 tế bào ni mơi trường có bổ sung với hormone FSH với nồng độ 10 IU/L, 25 IU/L, 50 IU/L, 100 IU/L tương ứng với lô (a) mm (b) tế bào thu nhận sau phân cắt với enzyme (X20) Hình (a) Các mảnh biểu mơ tinh hồn, (b) Nhóm 221 Nghiệm thức 2: Xác định tác động FSH testosteron lên trưởng thành tinh trùng Trong nghiệm thức này, tiến hành lô, với lô lô đối chứng (không bồ sung hormone vào môi trường nuôi cấy), lô 2: mơi trường ni có bổ sung với hormone FSH (50 IU/L, nồng độ xác định tối ưu nghiệm thức 1), lơ 3: mơi trường ni có bổ sung hormone testosteron (1 µmol/L) lơ 4: mơi trường ni có bổ sung hai hormone FSH (50 IU/L) testosteron (1 µmol/L) Các lơ thí nghiệm lặp lại lần Các lơ thí nghiệm nghiệm thức nuôi 300C, 5% CO2 Tác động FSH lên trưởng thành tinh trùng nghiệm thức đánh giá sau 24 nuôi cấy Ở nghiệm thức 2, tiến hành đánh giá trưởng thành tinh trùng sau 24 48 Sự trưởng thành tinh trùng đánh giá gián tiếp thông qua xuất đuôi Điều dựa sinh lí bình thường tinh trùng trưởng thành giảm phân để đạt nhiễm sắc thể đơn bội (n) có xuất dài Do vậy, tinh trùng xuất đuôi đánh giá trưởng thành Tỉ lệ tinh trùng trưởng thành sau nuôi môi trường, mốc thời gian ghi nhận cách đếm liên tục đĩa nuôi số lượng tế bào xuất đuôi 100 tế bào đếm Kết hai nghiệm thức xử lí phần mềm tính xác xuất thống kê Statraphic 7.0 KẾTQUẢVÀBÀNLUẬN Tác động FSH lên trưởng thành tế bào mầm Sau 24 nuôi cấy, số lượng tinh trùng bắt đầu xuất đuôi lô đối chứng chiếm 7,33% Ở lơ thí nghiệm có bổ sung 10 IU/L FSH, tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành 10,33% Tuy nhiên, sai khác hai số liệu ý nghĩa thống kê, nghĩa nồng độ 10 IU/L hiệu tác động FSH không rõ ràng hay khơng có tác động lên biệt hóa thành tinh trùng Bắt đầu từ nồng độ FSH 25 IU/L, hiệu tác động ngày rõ rệt với vai trò làm biệt hóa tế bào tiền thân tinh trùng thành tế bào tinh trùng Ở nồng độ FSH 25 IU/L, tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành 20,67%, khác biệt có ý nghĩa thống kê với tỉ lệ phầm trăm tinh trùng trưởng thành nồng độ FSH 10 IU/L Nồng độ FSH mà tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành đạt cao 50 IU/L Ở nồng độ FSH cao 100 IU/L, tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành có giảm sai khác khơng có ý nghĩa thống kê 222 Hình (a) Biểu đồ tác động FSH lên trưởng thành tinh trùng nồng độ khác (b) Tác động FSH testoteron lên trưởng thành tế bào mầm sinh tinh Như vậy, nồng độ FSH tối thiểu gây tác động lên biệt hóa 25 IU/L Nồng độ FSH tối ưu 50 IU/L Bởi nồng độ 100 IU/L tỉ lệ tinh trùng trưởng thành tương đối cao sử dụng nồng độ FSH cao gấp hai nên không lựa chọn Thật vậy, nồng độ FSH cao chứng minh người gây chết trưởng thành khơng bình thường tinh trùng Hình Một số dạng tinh trùng sau ni cấy (a) Tinh trùng với hình thành ngắn, thân chưa định hình, phần đầu chưa rõ rệt, (b) Tinh trùng dị dạng với hai đuôi mọc hai phía, phần thân 223 phần đầu chưa hình thành, (c) Tinh trùng với tương đối dài, đầu tròn thiếu phần thân (d) Tinh trùng trưởng thành với dài, phần thân đầu định hình rõ rệt Sự tác động FSH testosteron Sau 24 giờ, tỉ lệ tinh trùng trưởng thành lô đối chứng 11% (tương đương với tỉ lệ nghiệm thức 1) Ở lô bổ sung Testosteron, tỉ lệ 10,67% Sự sai khác hai lô khơng có ý nghĩa thống kê, nghĩa testosteron khơng tác động lên trưởng thành, biệt hóa tinh trùng Ở lô bổ sung FSH với nồng độ 50 IU/L tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành 34,33% (kết tương tự nghiệm thức 1) So với lô đối chứng lơ bổ sung testosteron cho thấy, nồng độ 50 IU/L, FSH có tác động tốt lên biệt hóa, trưởng thành tế bào gốc tiền thân tinh trùng Ở lô FSH kết hợp với testosteron, tỉ lệ tinh trùng trưởng thành 46,33% Tỉ lệ cao hẳn so với lô khác Như vậy, testosterone khơng có vai trò biệt hóa thành tinh trùng kết hợp với FSH làm gia tăng tỉ lệ tinh trùng trưởng thành Vai trò cụ thể testosterone chưa xác định rõ ràng nghiên cứu này, số nghiên cứu khác người cho thấy testosteron khơng có vai trò biệt hóa thành tinh trùng testosteron có vai trò trì tế bào Sertoli (những tế bào đồng nuôi cấy) giúp Sertoli hỗ trợ tế bào tiền thân biệt hóa thành tế bào tinh trùng trưởng thành(1) Thật vậy, nuôi cấy tiến hành thí nghiệm, mảnh biểu mơ tinh hồn chứa tế bào Leydig, tế bào Sertoli tế bào mầm sinh dục tiến hành nuôi chung (đồng nuôi cấy) Việc nuôi cấy đánh giá cao tế bào hỗ trợ tế bào mầm tinh hồn có vai trò quan trọng biệt hóa thành tinh trùng KẾT LUẬN Các tế bào mầm tồn tinh hồn chuột thu nhận nuôi cấy in vitro Dưới tác nhân testosteron FSH tế bào mầm sinh dục từ tinh hồn biệt hóa thành tinh trùng FSH có vai trò quan trọng kích thích biệt hóa tế bào gốc tiền thân tinh trùng thành tế bào tinh trùng Nồng độ FSH thích hợp cho nuôi cấy 50 IU/L Hormone testosteron tác động trực tiếp lên biệt hóa kết hợp với FSH tăng cường biệt hóa Tuy nhiên, nghiên cứu bước đầu cho thấy khả trưởng thành tế bào mầm sinh tinh in vitro tác dụng FSH testosteron Việc dựa vào hình thái xuất chưa hồn tồn xác để kết luận tinh trùng trưởng thành Hơn nữa, việc hư hại nhiễm sắc thể trưởng thành in vitro chưa đánh giá Do vậy, việc tiếp tục nghiên cứu sâu vấn đề vấn đề cần thiết TÀILIỆUTHAMKHẢO Griswold MD (1993) Action of FSH on mammalian Sertoli cells In: Russel LD, Griswold MD, eds The Sertoli cell Clearwater, FL: Cache River Press; 493–508 Makoto C Nagano (2005) Germ Line Stem Cells, Stem cells in endocrinology Humana Press, Totowa New Jersey Tanaka A, Tanaka I, Nagayoshi M, Awata S, Mawatari Y, Kusunoki H (1997) Comparative study of embryonic development of human oocytes injected with fresh round spermatids and injected with in vitro cultured round spermatids with flagella In: Gomel V, Leung PCK, eds In vitro fertilization and assisted reproduction Bologna, Italy: Monduzzi Editore; 705–710 Tesarik, J Guido, M., Mendoza, C et al Human spermatogenesis in vitro: respects of follicle-stimulating hormone and tesotsteronr on meosis, spermiogenesis, and Sertoli cell apoptosis J Clin, Endocrinol Meta., 83, 2772-2781 224 Tesarik, J., Greco, E., Rienzi L et al (1998) Differentiation of spermatogenic cells during in vitro culture of testicular biopsy samples from patients with obstructive azoospermia: effect of recombinant follicle stimulating hormone Hum Reprod., 13, 2772-2781 225 ... quan trọng biệt hóa thành tinh trùng KẾT LUẬN Các tế bào mầm tồn tinh hồn chuột thu nhận ni cấy in vitro Dưới tác nhân testosteron FSH tế bào mầm sinh dục từ tinh hồn biệt hóa thành tinh trùng... thí nghiệm, mảnh biểu mơ tinh hồn chứa tế bào Leydig, tế bào Sertoli tế bào mầm sinh dục tiến hành nuôi chung (đồng nuôi cấy) Việc nuôi cấy đánh giá cao tế bào hỗ trợ tế bào mầm tinh hồn có vai... khơng có vai trò biệt hóa thành tinh trùng testosteron có vai trò trì tế bào Sertoli (những tế bào đồng nuôi cấy) giúp Sertoli hỗ trợ tế bào tiền thân biệt hóa thành tế bào tinh trùng trưởng