nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hóa in vitro quần thể tế bào gốc nhung hươu sao việt nam (cervus nippon pseudaxis)

Nghiệm thu đề tài Vườn ươm I BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hóa in vitro quần thể tế bào gốc nhung hươu sao Việt Nam (Cervus nippon Pseudaxis) Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Tiến Bằng Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng Kinh phí được duyệt: 80.000.000 Kinh phí đã cấp: 72.000.000 theo TB số : 224 TB-SKHCN ngày 02/ 12 /2010 Mục tiêu: Mục tiêu ngắn hạn: Nuôi cấy và nhân sinh khối in vitro thành công tế bào gốc nhung hươu sao. Mục tiêu dài hạn: Thu nhận những hoạt chất sinh học quý từ tế bào gốc nhung hươu sao nuôi cấy in vitro và ứng dụng để tổng hợp thực phẩm chức năng. Nội dung: (Theo đề cương đã duyệt và hợp đồng đã ký) Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện Nghiên cứu thu nhận và nuôi cấy in vitro tế bào đơn từ nhung hươu sao Nghiên cứu thu nhận và nuôi cấy in vitro tế bào đơn từ nhung hươu sao Phân lập quần thể tế bào gốc ứng viên Phân lập quần thể tế bào gốc ứng viên Khảo sát tính gốc của tế bào gốc ứng viên Khảo sát tính gốc của tế bào gốc ứng viên Nghiệm thu đề tài Vườn ươm II LỜI CẢM ƠN Khi nhìn thấy những tế bào gốc nhung hươu đầu tiên phát triển trong điều kiện in vitro, chúng tôi, nhóm nghiên cứu trẻ phòng thí nghiệm Tế bào gốc, đã vỡ òa sung sướng. Mặc dù đây chỉ là bước đầu tiên trong chương trình nghiên cứu lâu dài và khó khăn, nhưng nó có ý nghĩa rất quan trọng. Để đạt được thành quả ban đầu này nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn tất cả những thầy cô, cơ quan, tổ chức đã tham gia thực hiện cũng như góp ý xây dựng đề tài. Chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:  Sở khoa học thành phố Hồ Chí Minh, chương trình Vườn ươm sáng tạo Khoa học và Công nghệ trẻ đã cấp kinh phí thực hiện đề tài.  Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ trẻ đã đứng ra chủ trì đề tài.  Các thầy cô và cán bộ nghiên cứu Phòng thí nghiệm Tế bào gốc trường Đại học Khoa học Tự nhiên TpHCM.  Trang tại chăn nuôi hươu nai Trường Thịnh, Long Thành, Đồng Nai. Cuối cùng nhóm nghiên cứu xin gửi lời tri ân đến các thành viên hội đồng xét duyệt, phản biện và nghiệm thu đã đóng góp nhiều ý kiến tích cực và giúp đề tài thực hiện thành công. Tp. Hồ Chí Minh, 04/06/2012 Chủ nhiệm đề tài ThS. Nguyễn Tiến Bằng Nghiệm thu đề tài Vườn ươm III LỜI GIỚI THIỆU Sự phát triển hằng năm của nhung hươu là trường hợp tái sinh duy nhất ở động vật hữu nhũ, một loài mà khả năng tái sinh lại các phần bị mất là rất hạn chế. Ở một số loài hươu, tốc độ tái tạo nhung có thể đạt được 2cm/ngày. Do vậy, sự tái sinh của nhung hươu thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà khoa học. Các nhà nghiên cứu cho rằng đây có thể là một hiện tượng tế bào gốc. Các tế bào nhung hươu có thể được thu nhận và nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12, 10% FBS. Sau khoảng 10 ngày nuôi cấy, các tế bào nhung hươu tăng sinh mạnh và chiếm khoảng 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi cấy. Tiếp đó, các tế bào nhung hươu được tiến hành cấy chuyền bằng Trypsin – EDTA 0,25% nhằm cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho sự phát triển của chúng. Các tế bào nhung hươu thu nhận được thể hiện tính đa năng giống tế bào gốc. Trong môi trường có tác nhân biệt hóa thích hợp, các tế bào nhung hươu có khả năng biệt hóa thành tế bào xương, tế bào mỡ… INTRODUCTION The annual regeneration of deer velvets is a unique developmental event in mammals, which as a rule possess only a very limited capacity to regenerate lost appendages. Some deer species, velvet regenerate rate achieves 2 cm/day. Thus, velvet regeneration attract the scientists's attention very much. Researchers said that velvet regeneration is a stem cell – based process. The cells derived from dapple deer velvet have been collected and cultured with DMEM/F12 plus 10% FBS (fetal bovine serum). About 10th day, those cells strongly expand and cover with 70 – 80% Roux’s surface. At that time, the cells derived from dapple deer velvet are subcultured by using trypsin/EDTA 0,25% to provide nutrients and surface for development. The cells derived from dapple deer velvet is multipotial like stem cells. They could be differentiated to osteocytes in DMEM/F12, 10% FBS medium plus dexamethasone, glycerol phosphate, Nghiệm thu đề tài Vườn ươm IV ascorbate, acid ascorbic; to adipocytes in DMEM/F12, 10% FBS plus isobutyl- methylxanthine, dexamethasone, insulin, indomethacin. Nghiệm thu đề tài Vườn ươm V MỤC LỤC BÁO CÁO NGHIỆM THU I Lời cảm ơn II Lời giới thiệu III Mục lục V Danh sách bảng VIII Danh sách hình IX CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1. Nhung hươu và ứng dụng của nó 1 1.1.1. Khái niệm 1 1.1.2. Các giai đoạn phát triển của sừng hươu 1 1.1.3. Thành phần hóa học chính trong nhung hươu 2 1.1.4. Một số tác dụng dược lý của nhung hươu 3 1.1.4.1. Tác dụng đối với bệnh viêm xương khớp 3 1.1.4.2. Tác dụng đối với các bệnh thấp khớp 3 1.1.4.3. Tác dụng kích thích miễn dịch 4 1.1.4.4. Tác dụng làm giảm huyết áp 4 1.1.4.5. Tác dụng chống sốc 4 1.2. Khái quát về tế bào gốc 4 1.3. Tế bào gốc nhung hươu – lược sử nghiên cứu và tiềm năng ứng dụng 5 1.3.1. Thế giới 5 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm VI 1.3.2. Việt Nam 10 1.4. Tính cấp thiết của đề tài 11 1.5. Ý nghĩa và tính mới về khoa học thực tiễn 11 CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13 2.1. Vật liệu nghiên cứu và tiến trình nghiên cứu 13 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 13 2.1.2. Tiến trình nghiên cứu 13 2.2. Dụng cụ và thiết bị 14 2.3. Hóa chất 15 2.4. Các phương pháp thực nghiệm 19 2.4.1. Phương pháp thu nhận mẫu mô nhung hươu 19 2.4.2. Thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 20 2.4.3. Nuôi cấy tế bào đơn 21 2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào và cấy chuyền 22 2.4.4.1. Quy trình cấy chuyền tế bào 22 2.4.4.2. Phương pháp xác định các chỉ số tế bào dựa trên phần mềm xCELLigence (phối hợp thực hiện với đại diện của Công ty Roche ở Việt Nam) 23 2.4.5. Chứng minh các tế bào thu nhận từ mẫu mô nhung hươu biểu hiện đặc điểm của tế bào gốc 23 2.4.5.1. Kiểm chứng khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới 23 2.4.5.2. Kiểm chứng khả năng biệt hóa 24 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Kết quả thu nhận mẫu mô nhung hươu 28 3.2. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 29 3.3. Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào nhung hươu 31 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm VII 3.4. Kết quả cấy chuyền và nuôi cấy tăng sinh tế bào nhung hươu 35 3.5. Kết quả chứng minh tính gốc của các tế bào thu nhận được từ mẫu mô nhung hươu 42 3.5.1. Khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới 42 3.5.2. Khả năng biệt hóa 42 3.5.2.1. Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo xương 42 3.5.2.2. Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo mỡ 45 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 4.1. Kết luận 54 4.2. Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm VIII DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 2.1. Danh mục các dụng cụ sử dụng trong đề tài 14 2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 14 2.3 Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài 15 3.1 Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu tươi 29 3.2 Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu đông lạnh 30 3.3 Số lượng mẫu nuôi sơ cấp 31 3.4 Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào thu nhận từ nhung hươu 34 3.5 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào nhung hươu 39 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm IX DANH MỤC HÌNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1.1. Mặt cắt vùng đỉnh đang tăng trưởng của nhung hươu 6 1.2. Các tế bào STRO – 1+ trong những vùng khác nhau của cuống [25] 9 2.2. Mẫu mô nhung hươu sao 14 2.3. Phần ngọn của nhung hươu 19 3.1. Phần ngọn của nhung hươu đã xử lý 28 3.2. Mẫu mô nhung hươu được cắt thành những mảnh nhỏ 28 3.3. Các mảnh mô nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm 2 29 3.4. Các tế bào đơn thu nhận từ mô nhung hươu (X100 30 3.5. Tế bào nhung hươu sau 24 giờ nuôi cấy (X40) 32 3.6. Tế bào nhung hươu sau 48 giờ nuôi cấy (X40) 32 3.7. Tế bào nhung hươu sau 72 giờ nuôi cấy (X40) 33 3.8. Tế bào nhung hươu sau 4 ngày nuôi cấy (X40) 33 3.9. Tế bào nhung hươu sau 7 ngày nuôi cấy (X40) 34 3.10 Tế bào nhung hươu sau 10 ngày nuôi cấy (X40) 34 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm X 3.11. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 0 giờ (X100) 36 3.12. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 24 giờ (X40) 36 3.13. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền ngày 7 (cấy chuyền lần 1) (X40) 37 3.14. Tế bào nhung hươu qua 2 lần cấy chuyền (X40) 37 3.15. Tế bào nhung hươu qua 3 lần cấy chuyền (X40) 38 3.16. Tế bào nhung hươu qua 4 lần cấy chuyền (X40) 38 3.17. Tế bào nhung hươu qua 5 lần cấy chuyền (X100) 39 3.18. Các tế bào nhung hươu trước khi bắt đầu cảm ứng biệt hóa (X40) 43 3.19. Các tế bào nhung hươu sau 15 ngày nuôi cấy trong môi trường biệt hóa thành tế bào tạo xương (X200) 44 3.20. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy trong môi trường biệt hóa thành tế bào tạo xương (X200) 44 3.21. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy trong môi trường biệt hóa thành tế bào tạo xương dương tính với thuốc nhuộm Alizarin Red S (X40) 45 3.22. Các tế bào nhung hươu tích tụ giọt mỡ trong tế bào chất sau 15 ngày nuôi cấy trong môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế 47 [...]... thu đề tài Vườn ươm bào tạo mỡ (X100) 3.23 Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy trong môi 47 trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X40) 3.24 Các giọt mỡ tích tụ trong tế bào chất của tế bào nhung hươu 48 sau khi nuôi cấy trong môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X200) 3.25 Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy trong môi 48 trường biệt hóa thành tế bào tạo mỡ dương tính... 3.26 Tế bào nhung hươu thu nhận bởi Berg và cs [4] hay bởi Rolf 49 và cs [25] 3.27 Tế bào nhung hươu do đề tài thu nhận (X200 và X40) 49 3.28 Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo xương của 50 đề tài (A) so với tế bào AP (B) của Berg và cs [4] 3.29 Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ của đề 51 tài (A, C) so với tế bào Stro – 1+ (B, D) của Rolf và cs [25] 3.30 Tế bào nhung hươu. .. quan đến sự biệt hóa tế bào Nghiên cứu này cho rằng sự tái sinh sừng hươu là một hiện tượng dựa vào tế bào gốc, và phụ thuộc vào sự hoạt động theo chu kỳ của các tế bào gốc nằm trong màng xương của cuống Cũng trong năm 2007, Berg D.K và cộng sự đã tiến hành nhân bản hươu đỏ từ tế bào gốc nhung hươu và các tế bào con cháu của chúng Dòng tế bào cho được phân lập từ màng xương cuống, các tế bào này (antlerogenic... kết quả biệt hóa sẽ được đánh giá sau 21 ngày nuôi trong môi trường cảm ứng biệt hóa tương ứng Mẫu tế bào nuôi Loại môi trường cũ Rửa tế bào bằng HBSS Bổ sung môi trường biệt hóa, nuôi ở 37 oC, 5% CO2 Nhuộm tế bào và kiểm tra kết quả biệt hóa Hình 2.8 Quy trình biệt hóa tế bào  Biệt hóa thành tế bào tạo xương Sự tiếp xúc một thời gian dài của các tế bào gốc trung mô với một hỗn hợp môi trường nuôi có... loại tế bào trưởng thành nào Tuy nhiên, trên thực tế, đặc tính này chỉ đúng với tế bào gốc toàn năng hoặc vạn năng Các tế bào gốc đa năng hay tế bào tiền thân chỉ có thể giới hạn biệt hóa thành một số loại tế bào trưởng thành nhất định Một số động vật bậc thấp có thể tái sinh một phần cơ thể bị mất thông qua sự khử biệt hóa các tế bào đã chuyên hóa thành các tế bào tiền thân Những tế bào vừa được khử biệt. .. Vườn ươm Đếm số lượng tế bào, đưa về mật độ 2.105 tế bào/ ml Cho dịch huyền phù vào flask T25, nuôi ở 37 oC, 5% CO2 Theo dõi sự phát triển của tế bào, thay môi trường sau mỗi 48 giờ Hình 2.6 Quy trình nuôi cấy tế bào đơn 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào và cấy chuyền 2.4.4.1 Quy trình cấy chuyền tế bào Khi mật độ tế bào đạt 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi cấy, quy trình cấy chuyền (hình 2.7)... Tế bào nhung hươu được nuôi cấy dài hạn để kiểm tra số lần phân bào mà các tế bào này có thể thực hiện được trong suốt thời gian nuôi cấy 2.4.5.2 Kiểm chứng khả năng biệt hóa  Quy trình biệt hóa tế bào: Theo nghiên cứu của Lee O.K và cộng sự (2004), các tế bào gốc trung mô có khả năng biệt hóa thành các dạng tế bào xương, sụn, mỡ… nếu chúng được cảm ứng trong các môi trường nuôi thích hợp (theo quy... DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu và tiến trình nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu mô nhung hươu sao (lộc nhung) thu nhận từ Trại chăn nuôi hươu sao Trường Thịnh, Xã Phước Tân, Huyện Long Thành, Tỉnh Đồng Nai (hình 2.2) Sau đó, mẫu mô được chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để xử lý sơ bộ 2.1.2 Tiến trình nghiên cứu Mô nhung hươu tươi Đông lạnh Giải đông Thu nhận tế bào đơn 1 Thu nhận tế bào. .. của nó vẫn chưa được hiểu rõ Các nghiên cứu về tế bào gốc nhung hươu bắt đầu bằng việc nuôi cấy các tế bào được thu nhận từ vùng mô đang tăng sinh, khảo sát tác động của các nhân tố tăng trưởng lên sự phát triển của các tế bào này trong điều kiện in vitro Bên cạnh đó, các nghiên cứu mô học của nhung hươu được tiến hành để từ đó tìm ra và đánh dấu những vùng chứa các tế bào có vai trò điều hòa quá trình... của các tế bào dương tính với marker tế bào gốc trung mô STRO – 1 trong các vùng khác nhau của sừng tái sinh và nguyên phát cũng như trong cuống của sừng hươu Phân tích FACS chứng minh nuôi cấy tế bào sơ cấp từ màng xương cuống hươu đực thu được quần thể tế bào dương tính với STRO – 1, CD271, CD133 Kết quả nghiên cứu mà nhóm Rolf H.J và cộng sự thu được hoàn toàn phù hợp với giả thuyết sự tái sinh sừng . I BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hóa in vitro quần thể tế bào gốc nhung hươu sao Việt Nam (Cervus nippon Pseudaxis) Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn. ngắn hạn: Nuôi cấy và nhân sinh khối in vitro thành công tế bào gốc nhung hươu sao. Mục tiêu dài hạn: Thu nhận những hoạt chất sinh học quý từ tế bào gốc nhung hươu sao nuôi cấy in vitro và ứng. và hợp đồng đã ký) Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện Nghiên cứu thu nhận và nuôi cấy in vitro tế bào đơn từ nhung hươu sao Nghiên cứu thu nhận và nuôi cấy in vitro tế bào đơn từ nhung