Quy trình biệt hóa tế bào: Theo nghiên cứu của Lee O.K. và cộng sự (2004),
các tế bào gốc trung mô có khả năng biệt hóa thành các dạng tế bào xương, sụn, mỡ… nếu chúng được cảm ứng trong các môi trường nuôi thích hợp (theo quy trình ở hình
2.8). Thông thường, kết quả biệt hóa sẽ được đánh giá sau 21 ngày nuôi trong môi
trường cảm ứng biệt hóa tương ứng.
Mẫu tế bào nuôi
Loại môi trường cũ
Rửa tế bào bằng HBSS
Bổsung môi trường biệt hóa, nuôi ở 37 oC, 5% CO2
Nhuộm tế bàovà kiểm tra kết quả biệt hóa
Hình 2.8. Quy trình biệt hóa tế bào
Biệt hóa thành tế bào tạo xương
Sự tiếp xúc một thời gian dài của các tế bào gốc trung mô với một hỗn hợp môi trường nuôi có bổ sung dexamethasone, L – ascorbic acid 2 – phosphate và β –
25
ngoại bào (theo quy trình ở hình 2.8). Kết quả biệt hóa được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Alizarin Red S (theo quy trình ở hình 2.9).
Nguyên tắc của phương pháp nhuộm Alizarin Red S: Thuốc nhuộm Alizarin
Red S sẽ kết hợp với calcium trong tế bào chất và chất nền ngoại bào do các tế bào tạo xương tiết ra tạo thành các mảng màu đỏ.
Đổ bỏmôi trường nuôi cũ
Cốđịnh mẫu tế bào bằng cồn 70o
Rửa với PBS hoặc nước cất (3 lần)
Bổ sung 1 – 2 giọt Alizarin Red S, ủ 30 phút
Hút bỏ thuốc nhuộm, rửa lại bằng dung dịch PBS
Quan sát tếbào dưới kính hiển vi để đánh giá kết quả
Hình 2.9. Quy trình nhuộm Alizarin Red S (theo hướng dẫn của Sigma)
Biệt hóa thành tế bào tạo mỡ
Các tế bào gốc trung mô có thể được biệt hóa thành tế bào tạo mỡ bằng nhiều
26
các chất như dexamethasone, insulin, indomethacin và IMBX (theo quy trình ở hình
2.8).
Sự biệt hóa được ghi nhận khi thấy có sự xuất hiện các giọt mỡ nhỏbằng cách quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 200 hoặc 400 lần. Ngoài ra, các tế bào mỡ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
còn được xác định dựa vào phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red O (theo quy
trình ở hình 2.10).
Nguyên tắc của phương pháp nhuộm Oil Red O: Oil Red O là thuốc nhuộm
lipid, nó chỉ hòa tan trong lipid, do đó làm cho các giọt mỡ chuyển thành màu đỏ.
Đổ bỏmôi trường cũ
Rửa bằng PBS
Thêm 10% formalin, ủ 5 phút
Hút bỏ formalin, bổ sung một lượng formalin mới
Hút bỏ formalin, rửa lại bằng nước cất hai lần
27
Đổ bỏ isopropanol và sấy khô mẫu
Bổ sung 6 phần Oil Red O/ 4 phần nước cất 2 lần,
ủ 19 phút
Ủ với isopropanol 60% trong 5 phút
Đổ bỏ isopropanol và sấy khô mẫu
Hình 2.10. Quy trình nhuộm Oil Red O (theo hướng dẫn của Sigma)
Rửa lại bằng nước cất
28
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN