Nghiên cứu tạo cây khoai lang kháng bọ hà bằng kỹ thuật chuyển gen nhờ agrobacterium tumefaciens

Nghiên cứu tạo khoai lang kháng bọ hà kỹ thuật chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu khoai lang 1.1.1 Nguồn gốc vị trí phân loại Khoai lang thuộc Solanales, họ Convolvulacae, chi Impomoea, loài Impomoea batatas Khoai lang loài nông nghiệp với rễ củ lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, gọi củ khoai lang Khoai lang có quan hệ họ hàng xa với khoai tây (Solanum tuberosum) quan hệ họ hàng xa với khoai mỡ (một số loài chi Dioscorea) Nhiều nhà khoa học cho khoai lang hóa từ 5000 năm trước có nguồn gốc từ Mỹ La Tinh (Hoàng Thị Sản, 2002; Nguyễn Nghĩa Thìn,Đặng Đình Sy, 1998) Khoai lang du nhập vào Trung Quốc cuối kỷ 16 Do khả thích ứng rộng dễ nhân giống khoai lang mở rộng châu Á, châu Phi, châu Mỹ La Tinh vào kỷ 17 18 Nó biết tới trước thám hiểm người phương tây tới Polynesia, sau phổ biến sang nước Châu Âu như: Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, châu Á Ấn Độ, Trung Quốc, Philippin, Indonesia, Việt Nam Khoai lang lương thực quan trọng người Mayan Trung Mỹ người Peruvian vùng núi Andet (Nam Mỹ) Khoai lang khám phá Christophe Columbus thám hiểm tìm châu Mỹ năm 1492 Khoai lang phổ biến rộng đường (Bùi Huy Đáp, 1984): • Ø Con đường 1: Các nhà buôn Tây Ban Nha đưa khoai lang vào châu Âu Sau truyền tới châu Phi, vào Ấn Độ, phía Tây Ấn (châu Á) • Ø Con đường 2: Người Tây Ban Nha mang từ Trung Mỹ tới Philippines Sau đó, đưa tiếp tục đến Châu Phi Khoai lang đưa vào Trung Quốc từ Philippin xuất Fukien năm 1594 Con đường khác vào Trung Quốc người Tây Ban Nha đưa vào vùng Combatfami năm 1674 Một người Anh đưa khoai lang vào Nhật năm 1615 Khoai lang tiếp tục đưa vào Malaysia nước Nam Á, Đông Nam Á Khoai lang nhập vào Việt Nam theo đường từ Phúc Kiến - Trung Quốc khoảng cuối kỷ 16 (Bùi Huy Đáp, 1984; Đinh Thế Lộc, 1995;1997) Hiện nay, khoai lang phát triển 100 quốc gia nhiệt đới ôn đới ẩm Ở Việt Nam, khoai lang trồng phổ biến, trước chủ yếu vùng đồng đất bãi ven sông, khoai lang trồng nhiều vùng đồi, trung du từ Bắc vào Nam Hình 1.1 Giống khoai lang KB1 (http://www.fcri.com.vn/images/c198/33) 1.1.2 Đặc điểm sinh thái di truyền Khoai lang hai mầm trồng lục bội với số bội thể 2n = 90, loài thân thảo dạng dây leo sống năm, thân mềm bò leo, dài - m, mọc so le hình tim hay xẻ thuỳ chân vịt, hoa có tràng hợp kích thước trung bình Hoa màu tím nhạt hay trắng, mọc thành xim hoa đầu cành hay nách Rễ củ ăn có hình dáng thuôn dài thon, lớp vỏ nhẵn nhụi có màu từ đỏ, tím, nâu hay trắng Lớp cùi thịt có màu từ trắng, vàng, cam hay tím (Hoàng Thị Sản, 2002; Nguyễn Nghĩa Thìn,Đặng Đình Sy, 1998) Khoai lang trồng từ lâu đời nước ta, có phổ thích nghi rộng, tốt trồng đất pha cát, lượng mưa năm khoảng 1000 mm, có khả chịu hạn, chịu đất xấu Khoai lang giao phấn, ngày ngắn, không hoa ngày dài 13 30 phút, hoa vùng có vĩ độ ôn đới 30 độ Bắc hay Nam Ở vùng nhiệt đới, dễ hoa, có hạt, có sức sống, thường trồng đoạn dây gọi hom Khoai lang trồng đặc biệt trồng nơi có điều kiện canh tác khó khăn, dễ trồng, dễ chăm sóc, đầu tư phân bón, thuốc bảo vệ thực vật Nhiệt độ thích hợp trình sinh trưởng phát triển từ 15-30 oC,phát triển tốt nhiệt độ trung bình khoảng 24 oC, độ ẩm thích hợp từ 60-70% Khoai lang có khả chịu đất chua, sinh trưởng bình thường pH = 4,5 - Khoai lang coi trồng thân thiện với môi trường đầu tư thâm canh thấp đặc biệt yếu tố nitơ, có khả sinh trưởng nhanh, che phủ đất, chống xói mòn, khoai lang có khả đặc biệt trồng tán che bóng, xen canh với khác.Tuy vậy, phải dựa vào đặc điểm sinh trưởng phát triển giống khoai lang mà chọn giống phù hợp với điều kiện khí hậu, mùa vụ, vùng để đạt suất cao 1.1.3 Đặc điểm hình thái Khoai lang lương thực ăn củ lấy dây lá, trồng hàng năm Khoai lang loài thân thảo dạng dây leo, có mọc so le hình tim hay xẻ thùy chân vịt, hoa có tràng hợp kích thước trung bình, hoa trắng, vàng hay tím, hình phễu Củ hình thoi rễ phồng lên, chứa tinh bột đường, vỏ củ màu trắng, vàng hay đỏ tím, thịt củ trắng, vàng hay tím nhạt tùy theo giống Hoa khoai lang thuộc loại hoa lưỡng tính Quả khoai lang thuộc loại sóc, có từ 1-4 hạt màu đen, vỏ dày, khó nảy mầm Khoai lang trồng vùng nhiệt đới thường có thân bò, trồng vùng ôn đới thường có dạng bụi 1.1.4 Giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế khoai lang Giá trị dinh dưỡng: Khoai lang chứa nhiều loại chất dinh dưỡng vitamin khác nhau: - 29% tinh bột, 7,5% glucose; tươi củ chứa 1,0 - 2,4% protein, 1,8 - 6,4 % chất béo.Trong tro có Mn, Ca, Cu, vitamin A, B,C, 4,24% tanin, 1,375% pentosan Khi phơi chỗ thoáng mát, củ có inosit, dextrin, axít chlorogenic, phytosterol, carotin, adenin, betain, cholin Dây khoai lang có chứa adenin, betain, cholin Bảng 1.1 Thành phần hàm lượng dinh dưỡng củ khoai lang Hàm lượng Phần trăm mg/100g Protein 1,0-2,4 Chất béo 1,8-6,4 Tinh bột 8,0-29 Glucose 0,5-7,5 Đường khử 0,5-7,5 Tro 0,9-1,4 Caroten mg/100 g Thiamin(B1) 0,1 mg/100 g Vitamin C 25 g/100 g Riboflavin 0,06 mg/100 g Ngoài ra, khoai lang tươi có nhiều vitamin muối khoáng Khi phơi khô rút gần hết nước, giá trị dinh dưỡng khoai lang cao Trong 100g khoai lang khô có 11g nước, 2,2 g protit, 0,5 g lipit, 80g gluxit, 3,6 g xelulaza cung cấp cho thể sống 342 calo (Đinh Thế Lộc, 1995;1997; Nguyễn Công Tạn, 2012) Khoai lang ngày giới quan tâm coi trồng đảm bảo an ninh lương thực có hàm lượng vitamin dinh dưỡng cao Hiện châu Phi, khoai lang sử dụng vũ khí hữu hiệu để chống lại nạn thiếu vitamin A C lan rộng Theo CIP (June, 2000), nạn thiếu vitamin A châu Phi gây mù lòa chí cướp sinh mạng 250.000 - 500.000 trẻ em năm Trên 90% sản phẩm khoai lang sản xuất nước phát triển Khoảng gần nửa sản phẩm khoai lang châu Á sử dụng làm thức ăn gia súc, phần lại sử dụng làm lương thực cho người chế biến Ở nước đông dân cư vùng nửa đồng Tây Phi khoai lang ví “người bảo hộ trẻ em” Lịch sử chứng minh khoai lang trồng cứu đói vào thời kỳ khủng hoảng giới thời kỳ sau Thế chiến thứ 2, sau trận động đất tàn phá năm 1990 Bắc Luzon, bạo loạn nội chiến Rwanda vài năm gần đây… Ngày nay, khoai lang ngày trở nên quan trọng nhu cầu tiêu thụ tinh bột khoai lang thị trường châu Á tăng cao Giá trị kinh tế: Các giống khoai lang giàu tinh bột sử dụng theo hướng sau - Làm nguyên liệu để chế biến sản phẩm công nghiệp: Tinh bột khoai lang chế biến sâu thành sản phẩm tinh bột biến tính, sản phẩm hoá công, sản phẩm lên men thuỷ phân, sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, dệt, giấy, vật liệu xây dựng, cao su nhân tạo - Làm nguyên liệu lý tưởng để sản xuất thức ăn chăn nuôi có giá cạnh tranh cao Với công nghệ mới, khoai lang khô thông qua công nghệ vi sinh để chế biến thức ăn vi sinh giàu đạm, có hàm lượng protit cao tới 40%, tương đương hàm lượng đạm đậu tương Nguyên liệu giàu đạm chủ yếu dựa vào đậu tương bột cá nhập Nếu sử dụng thức ăn vi sinh giàu đạm từ khoai lang để phối chế với nguyên liệu chất bột khác giảm hẳn nhu cầu nhập đậu tương bột cá đắt tiền, mặt hàng mà Việt Nam lợi phát triển Mỹ, Braxin, Achentina Peru (Nguyễn Công Tạn, 2012) - Làm nguyên liệu để sản xuất ethanol sinh học có giá cạnh tranh, thân thiện với môi trường, góp phần phát triển lượng tái tạo thay lượng hóa thạch Cây khoai lang coi vua lượng Hiệu suất sản xuất ethanol sinh học từ khoai lang cao hẳn mía đường, cao lương, ngô, sắn khoai tây Với suất khoai lang có tinh bột đạt 70 tấn/ha/vụ vụ khoai sản xuất 10 ethanol/ha, năm làm - vụ sản xuất 20 tấn- 30 ethanol/ha năm, tạo triển vọng phát triển ethanol sinh học có giá cạnh tranh, không tranh chấp lương thực loài người Với công nghệ sản xuất ethanol sinh học từ khoai lang, thông qua chu trình tuần hoàn khép kín, không thải độc tố, lại sản sinh khí CH4 để phát điện, đem lại lợi ích to lớn kinh tế gắn với bảo vệ môi trường (Bùi Huy Đáp, 1984; Nguyễn Công Tạn, 2012) Với công trên, khoai lang sản phẩm có thị trường tiêu thụ rộng lớn Không nước mà xuất nhiều nước giới Khoai lang trồng hứa hẹn mang lại hiệu kinh tế cao Khoai lang đầu tư ít, bán giá, lợi nhuận đem lại cho nông dân chắn cao hẳn trồng ngắn ngày khác nước ta 1.1.5 Tình hình sản xuất khoai lang giới Việt Nam Bảng 1.2 Diện tích, suất, sản lượng khoai lang năm 2012 (http://gso.gov.vn/default.aspx? tabid=717) Chỉ tiêu Diện tích (ha) Năng suất (hg/ha) Sản lượng (tấn) Thế giới 087 116 127543 103 145 500 Châu Phi 506 508 51332 17 999 686 Châu Mĩ 264 230 122786 244 382 Châu Á 177 239 194139 81 096 554 Châu Âu 4054 126687 51359 Châu Đại Dương 135 084 55782 753 520 Khu vực Hg/ha: hectogam/ha (1hg = 0,1kg = 0,001 tạ) Khoai lang lương thực có địa bàn phân bố rộng, thích ứng với điều kiện nhiều vùng sinh thái khác nhau, phân bố rộng rãi nhiều châu lục giới, đặc biệt vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới ôn đới Hiện khoai lang trồng 100 quốc gia giới châu Á (31 nước), châu Phi (39 nước) châu Mỹ La Tinh (31 nước) Theo thống kê FAO (2012), tổng sản lượng thu hoạch khoai lang tập trung chủ yếu châu Á với xấp xỉ 81,1 triệu tấn/ năm, Trung Quốc nước có tổng sản lượng cao giới với 73,14 triệu suất 21 tấn/ha Trong châu Phi sản lượng 17,99 triệu với suất trung bình tuwogn đối thấp 5,1 tấn/ha, châu Mỹ có sản lượng 3,2 triệu suất 12,28 tấn/ha Diện tích canh tác khoai lang không ngừng tăng năm vừa qua Bảng 1.3 Diện tích sản lượng khoai lang vùng sinh thái nước (http://www.fcri.com.vn/images/c198/33) Chỉ tiêu Năm 2009 Năm 2010 Diện tích (ha) Sản lượng Diện tích Năm 2011 Sản lượng Diện tích Sản lượng (nghìn tấn) (nghìn tấn) (ha) (nghìn tấn) (ha) 1.211,3 150,8 1.318,5 148,5 1.390,6 Đồng sông 22,8 Hồng 195,1 27,0 247,0 26,1 241,9 Trung du miền 38,1 núi phía Bắc 239,1 38,9 256,3 37,7 251,0 Bắc Trung Bộ Duyên hải miền 55,4 Trung 330,7 53,9 340,6 49,6 313,8 Đồng sông 14,2 Cửu Long 279,4 14,9 307,1 18,7 410,5 Vùng Cả nước 146,6 Ở nước ta, khoai lang chiếm vị trí quan trọng sản xuất lương thực, đứng thứ sau lúa ngô Khoai lang lương thực dễ trồng, đầu tư thấp có tiềm năng, suất cao Từ lâu, nhân dân ta có truyền thống sử dụng khoai lang làm lương thực thực phẩm thức ăn gia súc (tươi phơi khô), sử dụng làm rau xanh Hiện nay, lượng khoai lang làm lương thực cho người giảm, ngành chăn nuôi ngày phát triển, nên giống khoai lang có suất củ cao, giống thuộc nhóm có suất thân cao người sản xuất quan tâm Những giống có hàm lượng đường, hàm lượng protein cao làm nguyên liệu cho chế biến (bánh kẹo, chips khoai lang, ) ý Những năm gần đây, việc chuyển đổi cấu trồng nên diện tích khoai lang nhiều vùng bị thu hẹp lại Tuy nhiên, vùng đất nghèo dinh dưỡng, không chủ động tưới nước, khoai lang chiếm diện tích lớn Ở vùng sản xuất lúa khó khăn, vùng đất bạc màu, đất cát ven biểnkhoai lang chiếm vị trí ngang cao sản xuất lúa, đặc biệt khoai lang trồng hiệu mùa màng bị thiệt hại thiên tai, bão lụt góp phần đảm bảo an ninh lương thực (Bùi Huy Đáp, 1984; Nguyễn Công Tạn, 2012) Riêng vùng Bắc Trung Bộ, khoai lang trồng đất cát ven biển trồng thiếu cấu trồng vùng đất bãi, đất phù sa bồi đắp, vùng ven biển khoai lang có tác dụng khai hoang làm thức ăn gia súc quan trọng Trước có năm diện tích khoai lang nước đạt tới 450.000 Diện tích khoai lang Việt Nam dự kiến ổn định khoảng 188,4 nghìn tăng suất sản lượng khoai lang cách chọn tạo phát triển giống khoai lang tốt có suất củ tươi hàm lượng tinh bột cao, xây dựng hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác khoai lang bền vững thích hợp vùng sinh thái, đảm bảo thu nhập cho người dân, hộ nghèo, hộ vùng sâu vùng xa 1.1.6 Nguồn gen giống khoai lang Việt Nam Hầu hết nước trồng nhiều khoai lang giới có sưu tập nguồn gen giống khoai lang Nơi lưu giữ nguồn gen khoai lang lớn toàn cầu Trung tâm Khoai tây Quốc tế (Centro Internacional de la Papa - CIP) với tổng số 7007 mẫu giống khoai lang trì năm 2005 Trong số có 5920 mẫu giống khoai lang trồng (Ipomoea batatas) 1087 mẫu giống khoai lang loài hoang dại (Ipomoea trifida loài Ipomoea khác) Việc trì nguồn gen CIP thực ống nghiệm, đồng ruộng, bảo quản hạt đánh giá theo tiêu chuẩn quốc tế Nguồn gen giống khoai lang Việt Nam chủ yếu thu thập, đánh giá bảo tồn Trung tâm Tài nguyên Thực vật, thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam với 528 mẫu giống tư liệu hoá (trong có 344 mẫu Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc chuyển đến), Viện Cây lương thực Cây thực phẩm (FCRI) có 118 mẫu giống, Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc có 78 mẫu giống, Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh có 30 mẫu giống Từ 1999 - 2006, Trung tâm Khoai tây Quốc tế Hà Nội (CIP-Hanoi) CIP Peru hợp tác hỗ trợ kinh phí vật liệu giống phục vụ cho công tác nghiên cứu, chọn tạo giống phát triển khoai lang Việt nam, quan nghiên cứu Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (VASI cũ, VAAS), Viện Cây lương thực - Cây thực phẩm (FCRI) Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội chọn tạo nhiều giống có triển vọng theo hướng sử dụng: Lai tạo theo hướng hàm lượng chất khô cao; Chọn tạo giống theo hướng suất thân suất củ cao Bảng 1.4 Hiện trạng nguồn gen khoai lang Việt Nam năm 2009 (Hoàng Kim, 2011) Cơ quan, địa điểm Năm Số mẫu ban đầu Số mẫu bảo tồn VASI (Hà Nội) 1993-2004 - 528 FCRI (Hải Dương) 2004 - 118 1993 344 78 1993-2006 12.071 hạt lai 2006-2009 - 1993 HARC (Đồng Nai) UAF(Hố Chí Minh) 30 Các nhà chọn tạo giống chọn nhiều giống có triển vọng như: K1 (Số 59), K2 (Số 8), K4 (V1570), K51, KL5, KL1, KB1, VX-37, HL4, TV1, H12, giống khoai lang cực nhanh, giống khoai lang 143 Hai giống khoai lang TV1 H12 giống Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam chọn lọc có suất chất lượng ăn tươi cao Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn công nhận giống tạm thời năm 2004 Mặc dù vậy, việc sử dụng giống vào sản xuất chưa nhiều, kỹ thuật thâm canh số khâu cần phải hoàn thiện để đảm bảo cho giống phát triển bền vững vụ Đông vụ Hè Thu vùng ven đô, Trung du Duyên hải Bắc Trung Bộ Ở tỉnh phía Nam, giống khoai lang trồng phổ biến HL518 (Nhật đỏ), HL491 (Nhật tím), Murasa kimasari (Nhật tím), Kokey 14 (Nhật vàng), HL497 (Nhật cam), HL4, Hoàng Long, Chiêm Dâu, Trùi Sa, Bí Đ Lạt, Dương Ngọc, Tàu Nghẹn, Trùi Sa (Cần Sa), Khoai Sữa, Khoai Gạo Những năm gần đây, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đánh giá tuyển chọn 24 giống khoai lang khảo nghiệm toàn cầu chương trình hợp tác với CIP khảo sát giống khoai lang nhiều dây lá, suất bột cao cho hướng chế biến cồn chương trình hợp tác với công ty Technova công ty Toyota Nhật Bản (Hoàng Kim, 2008) Những giống khoai lang phẩm chất ngon đánh giá tuyển chọn đề tài “Thu thập, khảo sát, so sánh phục tráng giống khoai lang huyện Xuân Lộc tỉnh Đồng Nai 2008-2010” Đây nội dung hợp tác Sở Khoa học Công nghệ Đồng Nai, Viện Sinh học Nhiệt đới, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Phòng Nông nghiệp Xuân Lộc Kết bước đầu có HL518, HL491, Kokey 14, HL284, HL536 (CIP 083-14), HL574 (Cao sản), HL585, HL597 Kết nghiên cứu khác liên quan đến việc đánh giá tập đoàn giống khoai lang Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Bắc Trung Bộ chủ trì lập danh sách tập đoàn giống khoai lang thuộc: (1.) Nhóm giống suất cao; (2.) Nhóm giống chất lượng cao (3.) Nhóm giống chuyên làm rau xanh Đây tiền đề tốt để phối hợp lựa chọn giống nhóm giống suất nhóm giống chất lượng cao đối tượng thích hợp bọ hà để nghiên cứu chuyển gen kháng bọ hà Khái quát giống khoai lang KB1: Giống khoai lang KB1 chọn lọc từ tổ hợp lai tự nhiên giống mẹ Regal có nguồn gốc từ Mỹ từ năm 1993 Viện Cây lương thực Giống công nhận giống quốc gia theo Quyết định số 5310 QĐ/BNN-KHCN ngày 29 tháng 11 năm 2002 Giống KB1 có đặc điểm sau: - Giống khoai lang KB1 có dạng thân nửa đứng hình tim màu xanh nhạt, non màu tím - Giống khoai lang KB1 có củ to đồng đều, màu vỏ vàng nhạt, màu ruột củ trắng ngà - Năng suất củ đạt 15 - 30 tấn/ ha, cao Hoàng long từ 20 - 40% Chất lượng củ giống khoai lang KB1 tương đương Hoàng long A B C D Hình 1.2 Một số giống khoai lang Việt Nam: A) KB1; B) Chiêm Dâu; C)KL5; D) K51 Hình 1.3 Hình thái củ giống khoai lang KB1 Hoàng Long (http://www.fcri.com.vn/images/c198/33) 1.2 Phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Trong thập kỉ qua nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh mẽ nhiều quốc gia giới (cả nước phát triển phát triển) Đây công cụ cần thiết nhiều lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng ngành sinh học 1.2.1.Tính toàn tế bào thực vật (totipotency) Năm 1838, Schleiden Schwann đưa học thuyết tế bào Hai khía cạnh quan trọng học thuyết tế bào: 1) Ngoài tính đa dạng cao thể sống, sinh vật gồm tế bào 2) tế bào tương tự cấu trúc chức Năm 1902, Haberlandt - nhà thực vật học người Đức người đề xướng học thuyết tính toàn tế bào Tính toàn thực vật: Mỗi tế bào thể sinh vật mang toàn thông tin di truyền thể có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Tính toàn TBTV: khả của tế bào biệt hoá (trừ số tế bào biệt hoá sâu ống mạch, mao dẫn) có khả thể toàn thông tin di truyền phát triển thành hoàn chỉnh điều kiện thuận lợi giống chu trình phát triển phôi Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro hình thành từ vài thập kỷ trước mà sở giả thuyết nhà thực vật học người Đức Haberland (1902): Tất tế bào thực vật có tính toàn (totipotency), nghĩa tế bào mang toàn lượng thông tin di truyền thể Theo Haberland tế bào thực vật có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Ông người đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn tế bào Ông tiến hành thí nghiệm với tế bào mô mềm, tế bào biểu bì, tiếc thất bại chúng phân chia Năm 1922, Kotte Robbins lặp lại thí nghiệm Haberland thành công nuôi đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ ngô, đậu Hà lan tạo hệ rễ nhỏ có rễ phụ 12 ngày môi trường lỏng có chứa đường glucozơ, muối khoáng Ông chứng minh hiệu dịch chiết nấm men cho sinh trưởng cần thiết vitamin 1.2.2 Các giai đoạn phát triển phương pháp nuôi cấy mô tế bào a) Pha phát triển sinh lí Năm 1934, White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua thời gian dài môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường glucose nước chiết nấm men Gautheret thành công nuôi cấy mô tượng tầng tìm môi trường thích hợp - Khám phá vai trò thúc đẩy hàng loạt vitamin nhóm B ( B1- Thiamin HCl; B6- Pirydoxin HCl, axit nicotinic – B3) - Went Thimann tìm chất KTST IAA Sau đó, Miller Skoog nuôi cấy mô lõi thuốc xác định vai trò kinetin kích thích phát triển mô - 1939, Gautheret Nobercourt trì sinh trưởng mô sẹo cà rốt thời gian dài Năm 1941, Van Overbeck chứng minh tác dụng tốt nước dừa nuôi cấy họ cà Năm 1952, Steward Milles xác định tầm quan trọng nước dừa nuôi cấy mô sẹo phát sinh phôi cà rốt Cũng khoảng thời gian (1950), nhiều chất KTST nhóm auxin nghiên cứu tổng hợp thành công: 2,4D, NAA Năm 1954, Skoog phát kinetin- có chế phẩm thuỷ phân ticnh dịch cá có tác dụng kích thích phân bào Việc phát chất KTST với loại vitamin nước dừa nhứng bước tiến có ý nghĩa giai đoạn phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1957, Skoog Miller chứng minh biệt hoá rễ, chồi nuôi cấy mô tuỷ thuốc phụ thuộc vào nồng độ tương đối auxin/cytokinin Thành công có ý nghĩa vô quan trọng dẫn đến nhiều phát quan trọng tiền đề cho giai đoạn phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong giai đoạn từ năm 1960 trở lại đây, với việc nuôi cấy mô tế bào đơn, tế bào trần (protoplast), kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn phát triển mạnh - 1960, Morel nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phong lan tạo protocorm, protocorm điều kiện định phát triển thành lan hoàn chỉnh bệnh - 1960, Cooking thu tế bào trần dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật xử lí enzyme xenllulaza - 1966, Guha cs đa tạo đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cà độc dược (Datura inoxia) 1967, Borgin Nitsch thành công thuốc Việc tạo đơn bội thành công nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn hạt phấn đóng góp lớn cho nghiên cứu di truyền lai tạo giống Từ 1970 trở đi, nhà khoa học ý vào triển vọng kỹ thuật nuôi cấy protoplast Takebe cs (1971) tạo hoàn chỉnh từ protoplast b) Giai đoạn phát triển di truyền Melcher cs lai tạo thành công protoplast cà chua protoplast khoai tây, mở triển vọng lai xa thực vật Ngoài ra, điều kiện định, protoplast có khả hấp thu phân tử lơn, quan tử từ bên ngoài, chúng đối tượng lí tưởng cho nghiên cứu di truyền thực vật c) Giai đoạn phát triển chuyển gen Năm 1985, Horsch cs chuyển gen vào thực vật Agrobacterium tumerfaciens tạo chuyển gen Năm 1986, lần pháp Mĩ thuốc chuyển gen khángthuốc diệt cỏ đử trồng thử nghiệm đồng ruộng Diện tích trồng chuyển gen không ngừng tăng lên toàn cầu Năm 1996, diện tích trồng chuyển gen toàn cầu 1,7 triệu ha, đến năm 1997 số 11 triệu Năm 2001 số lên đến 44 triệu năm 2004 diện tích trồng chuyển gen toàn cầu lên đến 81 triệu Đến năm 2010, số lên đến 148 triệu (James, 2010) 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.3.1.Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy Nghiên cứu môi trường nuôi cấy giữ vị trí quan trọng lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào Cơ sở cho việc xây dựng môi trường nuôi cấy việc xem xét thành phần cần cho sinh trưởng phát triển Đã có nhiều loại môi trường nghiên cứu phù hợp cho việc nuôi cấy loài, phận tùy theo mục đích nuôi cấy Cho đến có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng xây dựng thử nghiệm có kết Hầu hết loại môi trường bao gồm thành phần sau: • Thành phần khoáng Các nguyên tố khoáng dùng môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô – tế bào thực vật chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng: nhóm đa lượng nhóm vi lượng - Nhóm đa lượng: gồm nguyên tố Nitơ, lưu huỳnh, photpho, magiê, canxi Chúng đặc biệt cần thiết trình sinh trưởng trao đổi chất tế bào - Nhóm vi lượng gồm nguyên tố sắt, mangan, bo, molypden… nhóm nguyên tố sử dụng với nồng độ nhỏ lại thiếu phát triển mô – tế bào (Lê Trần Bình et al., 1997) • Nguồn cacbon A) KB1; B) Chiêm Dâu; C)KL5; D) K51 Hình 1.3 Hình thái củ giống khoai lang KB1 Hoàng Long (http://www.fcri.com.vn/images/c198/33) 1.2 Phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Trong thập kỉ qua nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh mẽ nhiều quốc gia giới (cả nước phát triển phát triển) Đây công cụ cần thiết nhiều lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng ngành sinh học 1.2.1.Tính toàn tế bào thực vật (totipotency) Năm 1838, Schleiden Schwann đưa học thuyết tế bào Hai khía cạnh quan trọng học thuyết tế bào: 1) Ngoài tính đa dạng cao thể sống, sinh vật gồm tế bào 2) tế bào tương tự cấu trúc chức Năm 1902, Haberlandt - nhà thực vật học người Đức người đề xướng học thuyết tính toàn tế bào Tính toàn thực vật: Mỗi tế bào thể sinh vật mang toàn thông tin di truyền thể có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Tính toàn TBTV: khả của tế bào biệt hoá (trừ số tế bào biệt hoá sâu ống mạch, mao dẫn) có khả thể toàn thông tin di truyền phát triển thành hoàn chỉnh điều kiện thuận lợi giống chu trình phát triển phôi Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro hình thành từ vài thập kỷ trước mà sở giả thuyết nhà thực vật học người Đức Haberland (1902): Tất tế bào thực vật có tính toàn (totipotency), nghĩa tế bào mang toàn lượng thông tin di truyền thể Theo Haberland tế bào thực vật có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Ông người đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn tế bào Ông tiến hành thí nghiệm với tế bào mô mềm, tế bào biểu bì, tiếc thất bại chúng phân chia Năm 1922, Kotte Robbins lặp lại thí nghiệm Haberland thành công nuôi đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ ngô, đậu Hà lan tạo hệ rễ nhỏ có rễ phụ 12 ngày môi trường lỏng có chứa đường glucozơ, muối khoáng Ông chứng minh hiệu dịch chiết nấm men cho sinh trưởng cần thiết vitamin 1.2.2 Các giai đoạn phát triển phương pháp nuôi cấy mô tế bào a) Pha phát triển sinh lí Năm 1934, White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua thời gian dài môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường glucose nước chiết nấm men Gautheret thành công nuôi cấy mô tượng tầng tìm môi trường thích hợp - Khám phá vai trò thúc đẩy hàng loạt vitamin nhóm B ( B1- Thiamin HCl; B6- Pirydoxin HCl, axit nicotinic – B3) - Went Thimann tìm chất KTST IAA Sau đó, Miller Skoog nuôi cấy mô lõi thuốc xác định vai trò kinetin kích thích phát triển mô - 1939, Gautheret Nobercourt trì sinh trưởng mô sẹo cà rốt thời gian dài Năm 1941, Van Overbeck chứng minh tác dụng tốt nước dừa nuôi cấy họ cà Năm 1952, Steward Milles xác định tầm quan trọng nước dừa nuôi cấy mô sẹo phát sinh phôi cà rốt Cũng khoảng thời gian (1950), nhiều chất KTST nhóm auxin nghiên cứu tổng hợp thành công: 2,4D, NAA Năm 1954, Skoog phát kinetin- có chế phẩm thuỷ phân ticnh dịch cá có tác dụng kích thích phân bào Việc phát chất KTST với loại vitamin nước dừa nhứng bước tiến có ý nghĩa giai đoạn phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1957, Skoog Miller chứng minh biệt hoá rễ, chồi nuôi cấy mô tuỷ thuốc phụ thuộc vào nồng độ tương đối auxin/cytokinin Thành công có ý nghĩa vô quan trọng dẫn đến nhiều phát quan trọng tiền đề cho giai đoạn phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong giai đoạn từ năm 1960 trở lại đây, với việc nuôi cấy mô tế bào đơn, tế bào trần (protoplast), kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn phát triển mạnh - 1960, Morel nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phong lan tạo protocorm, protocorm điều kiện định phát triển thành lan hoàn chỉnh bệnh - 1960, Cooking thu tế bào trần dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật xử lí enzyme xenllulaza - 1966, Guha cs đa tạo đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cà độc dược (Datura inoxia) 1967, Borgin Nitsch thành công thuốc Việc tạo đơn bội thành công nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn hạt phấn đóng góp lớn cho nghiên cứu di truyền lai tạo giống Từ 1970 trở đi, nhà khoa học ý vào triển vọng kỹ thuật nuôi cấy protoplast Takebe cs (1971) tạo hoàn chỉnh từ protoplast b) Giai đoạn phát triển di truyền Melcher cs lai tạo thành công protoplast cà chua protoplast khoai tây, mở triển vọng lai xa thực vật Ngoài ra, điều kiện định, protoplast có khả hấp thu phân tử lơn, quan tử từ bên ngoài, chúng đối tượng lí tưởng cho nghiên cứu di truyền thực vật c) Giai đoạn phát triển chuyển gen Năm 1985, Horsch cs chuyển gen vào thực vật Agrobacterium tumerfaciens tạo chuyển gen Năm 1986, lần pháp Mĩ thuốc chuyển gen khángthuốc diệt cỏ đử trồng thử nghiệm đồng ruộng Diện tích trồng chuyển gen không ngừng tăng lên toàn cầu Năm 1996, diện tích trồng chuyển gen toàn cầu 1,7 triệu ha, đến năm 1997 số 11 triệu Năm 2001 số lên đến 44 triệu năm 2004 diện tích trồng chuyển gen toàn cầu lên đến 81 triệu Đến năm 2010, số lên đến 148 triệu (James, 2010) 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.3.1.Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy Nghiên cứu môi trường nuôi cấy giữ vị trí quan trọng lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào Cơ sở cho việc xây dựng môi trường nuôi cấy việc xem xét thành phần cần cho sinh trưởng phát triển Đã có nhiều loại môi trường nghiên cứu phù hợp cho việc nuôi cấy loài, phận tùy theo mục đích nuôi cấy Cho đến có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng xây dựng thử nghiệm có kết Hầu hết loại môi trường bao gồm thành phần sau: • Thành phần khoáng Các nguyên tố khoáng dùng môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô – tế bào thực vật chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng: nhóm đa lượng nhóm vi lượng - Nhóm đa lượng: gồm nguyên tố Nitơ, lưu huỳnh, photpho, magiê, canxi Chúng đặc biệt cần thiết trình sinh trưởng trao đổi chất tế bào - Nhóm vi lượng gồm nguyên tố sắt, mangan, bo, molypden… nhóm nguyên tố sử dụng với nồng độ nhỏ lại thiếu phát triển mô – tế bào (Lê Trần Bình et al., 1997) • Nguồn cacbon Phần lớn mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống theo phương thức dị dưỡng việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu điều bắt buộc Nguồn cacbon thông dụng sucrose Nồng độ thích hợp 2-3% song phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi Ngoài sử dụng số nguồn cacbon khác glucose, maltose, fructose… Các loại rượu glycerin tế bào sử dụng Manitol sorbitol sử dụng nuôi cấy huyền phù nuôi cấy protoplast với chức chất ổn định áp suất thẩm thấu (Lê Trần Bình et al., 1997) • Vitamin Mặc dù tất loại mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả tự tổng hợp hầu hết loại vitamin, thường không đủ lương, phải bổ sung thêm từ bên vào, đặc biệt vitamin thuộc nhóm B như: B1, B3, B5, B6, meso-inosit… cần thiết cho phản ứng sinh hóa • Ø Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Trong môi trường nuôi cấy mô – tế bào thực vật thành phần phụ gia quan trọng định kết nuôi cấy chất điều khiển sinh trưởng, thuộc nhóm sau: - Auxin (Lê Trần Bình et al., 1997; Nguyễn Đức Thành, 2000) Có loại auxin thường sử dụng là: Indole acetic acid (IAA), Naphthylacetic acid (NAA), 2,4Dichlorphenoxyacetic acid (2,4-D), Indol butyric acid (IBA) Chúng chủ yếu có tác dụng kích thích sinh trưởng tế bào làm phân bào - Cytokinin Là nhóm phytohormone dẫn xuất adenin Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, trì trẻ hóa quan, làm giảm tượng ưu ngọn, kích thích phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy Các loại cytokinin thường dùng môi trường nuôi cấy kinetin, 6-Benzylaminopurin (BAP) Ngoài có Zeatin sử dụng nuôi cấy giá thành đắt (Lê Trần Bình et al., 1997; Nguyễn Đức Thành, 2000) - Gibberellic acid Tới phát 60 loại thuộc nhóm gibberellic acid Loại thông dụng nuôi cấy mô GA3 Trong thể thực vật, gibberellin đóng vai trò quan trọng nhiều trình sinh lý như: Sinh lí ngủ nghỉ hạt chồi, phát triển hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài thực vật - Abscisic acid Abscisic acid (ABA) thuộc nhóm chất ức chế sinh trưởng ABA có tác dụng tăng cường khả chống chịu tế bào thực vật điều kiện ngoại cảnh bất lợi, ABA đưa vào môi trường tái sinh mang lại hiệu định (Dương Tấn Nhựt, 2011; Vũ Văn Vụ, 2001) • Các hỗn hợp chất tự nhiên Sự bổ sung thêm số hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên như: nước dừa, dịch chiết mầm lúa mì, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein…vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sinh trưởng phát triển mô nuôi cấy • Chất độn- thạch (Agar) Agar thành phần định trạng thái vật lí môi trường Hàm lượng agar dùng nuôi cấy dao động 0,6 – 1,0 % theo khối lượng Tuy nhiên tùy thuộc vào đối tượng nuôi cấy mà sử dụng cho phù hợp (Lê Trần Bình et al., 1997; Lê Trần Bình,Quyền Đình Thi, 2009) • Nước Nước thành phần quan trọng môi trường nuôi cấy Nước pha môi trường nuôi cấy thường loại nước cất lần (Lê Trần Bình,Quyền Đình Thi, 2009) • Độ pH môi trường Độ pH môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới trình thu nhận chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Độ pH môi trường thường điều chỉnh từ 5,5 – 6,0 trước khử trùng Nhìn chung độ pH cao 6,0 làm môi trường bị cứng thấp 5,0 agar khó đông (Lê Trần Bình et al., 1997; Nguyễn Đức Thành, 2000; Vũ Văn Vụ, 2001) 1.2.3.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy • Nhiệt độ Yêu cầu nhiệt độ cho sinh trưởng phát triển loài không Tuy nhiên thực tế phòng thí nghiệm nhiệt độ thường trì khoảng từ 25 – 28 0C (Vũ Văn Vụ, 2001) • Ánh sáng Ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì thành phần quang phổ ánh sáng Cường độ ánh sáng dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô từ 1000-2500 lux Với cường độ ánh sáng lớn sinh trưởng chồi chậm lại thúc đẩy trình tạo rễ Sự thu nhận ánh sáng chồi in vitro phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng chất lượng bình nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 2001) 1.3 Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens Chuyển gen thông qua Agrobacterium phương pháp chuyển gen gián tiếp hữu hiệu dùng để chuyển gen thực vật Phương pháp dùng Ti - plasmid Agrobacterium tumefaciens làm vectơ đưa ADN vào tế bào Đây phương pháp chuyển gen tỏ có hiệu hẳn phương pháp chuyển gen trực tiếp gián tiếp khác dễ sử dụng, tốn kém, hiệu chuyển gen cao mà số lượng copy vào hệ gen ít, thường có tạo thuận lợi cho việc phân tích chuyển gen không gây tổn thương tế bào(Anwar et al., 2011; Trần Quốc Dung et al., 2006) Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium có hiệu số loài tất thực vật biến nạp đường Ðặc biệt, lớp mầm bao gồm ngũ cốc giới lúa, lúa mì ngô không biến nạp dễ dàng nhờ A.tumefaciens.Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium thường dùng cho loại hai mầm Agrobacterium mẫn cảm với loại (Lê Trần Bình et al., 1997; Nguyễn Đức Thành, 2003) 1.3.1.Cơ sơ khoa học phương pháp chuyển gen Agrobacterium tumefaciens Chủng A tumefaciens sử dụng phổ biến nghiên cứu chuyển gen thực vật Theo chế tự nhiên, loài có khả xâm nhiễm qua vết thương hầu hết loài thực vật hai mầm số loài thực vật mầm, kết gây khối u hay hình thành lông tơ rễ Về sau, người ta xác định tế bào dạng hoang dại A tumefaciens có chứa loại plasmid đặc biệt gọi Ti - plasmid (Tumor - inducing plasmid) chứa đoạn DNA (Transferred DNA) chuyển sang tế bào chủ theo chế tự nhiên Do đó, Agrobacterium hệ thống chuyển gen tự nhiên (Lê Trần Bình 2008; Trần Quốc Dung et al., 2006) Các Ti plasmid Agrobacterium phân tử ADN sợi kép, mạch vòng có kích thước khoảng 200 kb gồm bốn vùng A, B, C, D Vùng A hay gọi T- ADN (transferred ADN) có kích thước từ 10 kb đến 20 kb, chuyển sang tế bào thực vật Nó có chứa hai hệ gen: (1) Hệ gen gây khối u onc (oncogenic), chứa ba gen chịu trách nhiệm tổng hợp phytohoocmon auxin (IaaM, IaaH) cytokinin (iptz), cảm ứng phân chia tế bào liên tục tạo mô sẹo (khối u) tế bào bị nhiễm ảnh hưởng sang tế bào lân cận; (2) Hệ gen mã hoá cho enzyme điều khiển sinh tổng hợp axit amin gọi opine Hai loại enzyme nghiên cứu kĩ octopine synthase nopaline synthase (Lê Trần Bình et al., 1997; Nguyễn Đức Thành, 2003) Vùng D vùng độc (virulence region) chứa gen vir, giữ vai trò quan trọng việc chuyển T ADN vào hệ gen tế bào thực vật Nó lớn khoảng 40 kb bao gồm operon (vir A, vir B, vir C, vir D, vir E, vir G) Các gen vir Agrobacterium khởi động nhờ chất hoá học tế bào thực vật bị thương tổn tiết Hoạt động vùng vir đóng vai trò lớn việc chuyển T- ADN sang tế bào thực vật Sau hoạt hoá gen vir, nhân tố T-ADN cắt khỏi plasmid LB RB yếu tố cần thiết định hướng cho chuyển ADN liên quan đến cắt T- ADN khỏi plasmid Các nghiên cứu cho thấy cắt bỏ 25 bp bên trái vùng lặp lại ảnh hưởng đến khẳ gây u cắt bỏ vùng bên hình thành khối u bị ảnh hưởng Khi đoạn cắt hạn chế chứa vùng biên phải đoạn 25 bp lặp lại gắn lại vào vùng biên phải hình thành khối u khôi phục Ngoài đoạn 25 bp gắn ngược so với chiều tự nhiên Ti plasmid hiệu chuyển nạp bị giảm nhiều Các kết qủa cho thấy T- ADN chuyển theo chiều từ phải sang trái xác định chiều dài vùng lặp lại Để chuyển nạp gen ngoại lai vào tế bào thực vật Agrobacterium tumerfaciens cần phải có hệ thống vectơ hữu hiệu Hiện có hai hệ thống vectơ phát triển hệ thống vectơ liên hợp (co-integration) hệ thống vectơ nhị thể (binary) Về nguyên tắc người ta loại bỏ vùng T- ADN gây khối u thay vào gen trội thị chọn lọc - thường gen kháng kháng sinh gen kháng chất diệt cỏ, cuối gắn đoạn gen cần biến nạp với đoạn điều khiển phù hợp (promoter) Những phát có ý nghĩa quan trọng cho đời phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn A tumefaciens (Nguyễn Đức Thành, 2003; Ziemienowicz, 2001) Hình 1.4 Phương pháp chuyển gen thông qua A Tumerfaciens 1.3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình chuyển gen nhờ Agrobacterium Hệ thống nuôi cấy Xây dựng hệ thống nuôi cấy tái sinh hoàn chỉnh tiền đề quan trọng cho thí nghiệm chuyển gen Đối với loài thực vật, thiết phải nghiên cứu tối ưu kỹ thuật nuôi cấy thích hợp Sau hệ thống nuôi cấy sử dụng (Lê Trần Bình et al., 1997; Nguyễn Đức Thành, 2000) : Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo khối tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc di truyền thấp, chưa phân hóa, phân chia cách hỗn loạn có tính biến động di truyền cao Mô sẹo thu nuôi cấy in vitro từ phần non quan thực vật thân, rễ, lá, hoa.trong môi trường chứa chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin điều kiện nuôi cấy thích hợp Mô sẹo trì liên tục môi trường nuôi cấy cách cấy chuyển định kì Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù kĩ thuật nuôi cấy tế bào đơn cụm nhỏ tế bào môi trường lỏng Các tế bào tạo từ mô sẹo có nguồn gốc từ thân, rễ, lá, hoa, phôi Tuy nhiên trở ngại lớn phương pháp cần thời gian nuôi cấy dài ảnh hưởng trực tiếp tới khả tái sinh Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn lớp vỏ bao bọc lại khối nguyên sinh chất bao bọc màng nguyên sinh gọi tế bào trần Các tế bào trần sau nuôi cấy môi trường thích hợp tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối mô sẹo hình thành hoàn chỉnh Ứng dụng có ý nghĩa phương pháp tạo soma, tạo lai tế bào chất thông qua dung hợp protoplast ứng dụng để biến nạp gen Các yếu tố ảnh hưởng khác Phổ vật chủ Agrobacterium xác định rộng song hiệu biến nạp gen lại không giống chủ khác Ở hai mầm có tần suất chuyển nạp gen cao nhiều so với mầm (Lê Trần Bình et al., 1997; Nguyễn Đức Thành, 2003) Hiệu biến nạp gen thông qua Agrobacterium thực vật phụ thuộc vào số yếu tố tiền xử lý mô thực vật, nguồn vật liệu gây nhiễm, nồng độ vi khuẩn, thời gian nuôi nhiễm đặc biệt khả tái sinh thực vật sau biến nạp Vì vậy, thí nghiệm chuyển gen, việc tìm vật liệu thích hợp nghiên cứu xây dựng hệ thống nuôi cấy tối ưu để nâng cao hệ số tái sinh lên cao Qua nghiên cứu xây dựng hệ thống nuôi cấy tối ưu tìm nguyên liệu thích hợp Prakash Varadarajan phát mô sẹo từ mảnh cuống vât liệu phù hợp để chuyển gen thông qua Agrobacterium so với loại mô khác thân, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ (Prakash,Varadarajan, 1992) 1.4 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô chuyển gen khoai lang 1.4.1.Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô tái sinh khoai lang Nhiều nghiên cứu cho thấy khoai lang đối tượng khó xây dựng hệ thống tái sinh in vitro chuyển gen Trong nhiều năm qua có nhiều nghiên cứu giới tập trung vào việc tìm môi trường nuôi cấy phương thức tái sinh phù hợp giống khoai lang khác Theo kết nghiên cứu công bố, môi trường nuôi cấy mô khoai lang sử dụng phổ biến môi trường MS (Murashige,Skoog, 1962), có bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng khác 2,4-D, kinetin, BAP Một số tác giả sử dụng công thức môi trường nuôi cấy mô khoai lang gồm giai đoạn: Giai đoạn đầu nuôi cấy bổ sung auxin, giai đoạn bổ sung cytokinin zeatin TDZ cho hiệu tái sinh tốt (Dessai et al., 1995; Gosukonda et al., 1995) Theo Dessai đồng tác giả (1995), mảnh khoai lang cấy môi trường bổ sung 2,4-D 0,2 mg/l ngày sau chuyển sang môi trường bổ sung riboside zeatin 0,2 mg/l cho hiệu tái sinh tốt kiểu gen PI 318846 – (Dessai et al., 1995) Gosukoda đồng tác giả (1995) thu tỉ lệ tái sinh chồi đạt 78,25% vòng 28 ngày môi trường bổ sung thidiazuron 0,2 mg/l Sử dụng riboside zeatin, kinetin cho kết tần số tái sinh thấp kiểu gen nghiên cứu Mẫu cấy từ cho tần số tái sinh cao so với mẫu lấy từ phần khác chồi Mảnh mô cho tần số tái sinh thấp so với cuống Các khoai lang tái sinh cách sử dụng thidiazuron lớn mạnh tạo rễ dễ dàng chuyển nhà kính (Gosukonda et al., 1995) Phương thức tái sinh in vitro thông qua phát sinh quan từ mảnh (Dessai et al., 1995; El Abidine Triqui et al., 2008; Gosukonda et al., 1995) cuống lá, đốt thân (Belarmino et al., 1994; Gosukonda et al., 1995), thông qua đa chồi từ mô sẹo (Anwar et al., 2011), phát sinh phôi soma từ mảnh lá, cuống (Zheng et al., 1996), từ tế bào nuôi cấy huyền phù gen (Xing et al., 2008 ; Yang et al., 2011; Yu et al., 2007) phát triển ứng dụng tạo khoai lang chuyển García nghiên cứu ảnh hưởng 151 tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến hiệu tái sinh chuyển gen giống khoai lang Jewel bao gồm IAA ( - 2,0 mg/l), NAA (0,1 - 2,0 mg/l), zeatin riboside (0,11-1,0 mg/l), kinetin (0,1- 2,0 mg/l), BAP (0,25 - 3,0 mg), paclobutranol từ 0,1- 2,0 mg/l (García et al., 2000) Cây khoai lang Jewel chuyển gen ổn định thu sau đến 10 tuần sau nhiễm với A tumefaciens EHA105 tái sinh quan từ mô sẹo cuống Tần số chuyển gen thu môi trường tái sinh bổ sung 4FA (flourophenoxylacetic acid) 20%, môi trường tái sinh bổ sung zeatin 10%, môi trường bổ sung IAA 4% Điều cho thấy, bổ sung tỷ lệ auxin/cytokinin phù hợp cải thiện tái sinh mô sẹo chuyển gen (Luo et al., 2006) Theo Gonzalez đồng tác giả (2008), môi trường phù hợp cho tái sinh khoai lang Jewel CE MSA 78354 chuyển gen nhờ A tumefaciens môi trường MS có bổ sung IAA 0,5 mg/l sau bốn tuần nuôi cấy (RF = 2,02), môi trường phù hợp cho tái sinh giống khoai lang CEMSA78354 MS bổ sung paclobutazol 1,0 mg/l NAA (RF = 0,98) (Gonzalez et al., 2008) 1.4.2.Tình hình nghiên cứu chuyển gen khoai lang Những kết nghiên cứu tối ưu quy trình nuôi cấy mô khoai lang tiền đề để ứng dụng công nghệ chuyển gen vào khoai lang.Trong vài năm gần đây, nhà khoa học giới có nhiều nỗ lực để tối ưu hóa quy trình tái sinh tạo khoai lang chuyển gen Nhiều phương pháp chuyển gen nghiên cứu sử dụng khoai lang phương pháp chuyển gen nhờ xung điện (Dhir et al., 1998; Lawton et al., 2000; Mitchell et al., 1998a; Okada et al., 2001), dùng súng bắn gen (Prakash,Varadarajan, 1992; Yi et al., 2007), chuyển gen nhờ vi khuẩn A rhizogenes (Otani et al., 1993) , Tuy nhiên, phương pháp xem không hiệu xuất thường xuyên biến dị, chuyển gen mà không tái sinh, suất hiệu thấp phụ thuộc kiểu gen (Lowe et al., 1994) Chuyển gen thông qua A tumefaciens sử dụng nhiều loài thực vật tính hiệu quả, đơn giản ổn định (Hansen et al., 1997; Joshi,Joshi, 1991; Yu et al., 2007) Chuyển gen khoai lang sử dụng A tumefaciens thực từ nhiều loại mô cấy khác (Cipriani et al., 1999; Gama et al., 1996; Kimura et al., 2001; Luo et al., 2006; Mitchell et al., 1998b; Mora´n et al., 1998; Newell et al., 1995; Otani et al., 1998; Otani et al., 2001,;2003; Shimada et al., 2006; Song et al., 2004; Wakita et al., 2001; Xing et al., 2008 ; Yu et al., 2007) Tuy nhiên, hầu hết kết thu tần số chuyển gen thấp phụ thuộc nhiều vào kiểu gen thành công vài giống định Đã có nhiều nghiên cứu giới tiến hành nghiên cứu chuyển gen vào khoai lang với nhiều nhóm gen khác nhau, tập trung chủ yếu vào hướng tạo dòng khoai lang chuyển gen kháng sâu côn trùng (Mora´n et al., 1998; Newell et al., 1995), tạo khoai lang kháng thuốc diệt cỏ (Anwar et al., 2011; Choi et al., 2007; Maria et al., 2009; Yi et al., 2007; Zang et al., 2009) kháng virus (Okada et al., 2001), dòng khoai lang cải thiện chất lượng dinh dưỡng (López et al 1996; Wakita et al 2001 ), tăng hàm lượng tinh bột (Shimada et al., 2006), chuyển gen làm tăng khả chống chịu stress phi sinh học (Lim et al., 2007) Yi đồng tác giả (2007) tạo khoai lang mang gen bar kháng thuốc diệt cỏ phương pháp bắn gen vào callus phát sinh phôi bắt nguồn từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Yi et al., 2007) Zang đồng tác giả (2009) tạo khoai lang chuyển gen bar nhờ chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105 thông qua nuôi cấy huyền phù phát sinh phôi Khi phân tích có mặt gen GUS thực phản ứng PCR thu tần số chuyển gen cao 86,5 % chuyển gen, số copy từ đến (Zang et al., 2009) Tuy nhiên, tác giả chưa đánh giá tính kháng thuốc diệt cỏ dòng chuyển gen Yu đồng tác giả (2007) chuyển gen giống khoai lang Ipomoea batatas L cv Lizixiang chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105 tiến hành nuôi cấy huyền phù Kết thu 90,37 % chuyển gen, số copy T-ADN từ đến 4, 100% chuyển gen sống sót trồng nhà kính đưa đồng ruộng, không quan sát thấy có biến dị hình thái ex vitro (Yu et al., 2007) Ở Việt Nam, năm gần có số viện nghiên cứu đầu ngành Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam thực đề tài, dự án nghiên cứu đối tượng khoai lang thu số kết bước đầu Viện Công nghệ Sinh học thực số đề tài như: Phân lập gen tạo khoai lang chuyển gen kháng bọ hà (Hợp tác ISAAA, từ 1997 đến nay) Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống kháng sâu bệnh có chất lượng cao khoai lang (2003)”, đề tài nhánh đề tài KC-04-22: “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống kháng sâu bệnh có chất lượng cao số có củ” Viện Di truyền Nông nghiệp chủ trì Một số kết bật đề tài phân lập thiết kế gen diệt bọ hà khoai lang, chuyển gen đánh giá chuyển gen phòng thí nghiệm nhà lưới, hoàn thiện quy trình tái sinh chuyển gen áp dụng thử nghiệm Những kết phục vụ tốt cho nghiên cứu chuyển gen thực vật nói chung đặc biệt chuyển gen khoai lang Việc ứng dụng kỹ thuậtnuôi cấy mô tế bào thực vật vào nghiên cứu tạo giống bệnh tạo giống khoai lang chuyển gen tạo triển vọng việc tăng suất diện tích khoai lang Việt Nam Đã có số nghiên cứu tái sinh in vitro chuyển gen số giống khoai lang Việt Nam (Phạm Bích Ngọc et al., 2002) kết thu hạn chế, đặc biệt chưa tập trung hoàn thiện hệ thống tái sinh giống khoai lang địa phương có suất chất lượng tốt 1.5 Phương pháp sàng lọc đánh giá chuyển gen 1.5.1 Sàng lọc chuyển gen chất chọn lọc Sàng lọc sau chuyển gen chất chọn lọc đặc hiệu xem bước đặc biệt quan trọng để xác định tế bào mang gen chuyển đồng thời giúp làm giảm công sức cho phân tích Muốn cần thiết phải lập môi trường chọn lọc thích hợp nhằm loại bớt tế bào không mang gen chuyển, đồng thời giữ lại hầu hết tế bào có mang gen chuyển [15] Để chọn lọc tế bào mang gen biến nạp, vector biến nạp thường phải chứa gen chọn lọc như: nptII – kháng kanamycine, hyg – kháng hygroycine, str/spc – kháng streptomycine spectinomycine, bar – kháng thuốc trừ cỏ PPT (phosphinothricin)…Các loại vector ứng dụng mang lại thành công việc chọn lọc tế bào mang gen chuyển nhiều đối tượng trồng vải, hông, thuốc lá, lúa…[3], [13], [21], [26] Hiện nay, với mục tiêu an toàn sinh học, an toàn thực phẩm thân thiện với môi trường, người ta đưa vào vector chuyển gen gen thị chọn lọc độc pmi mã hóa cho enzyme phosphomanso isomerase, hệ thống chọn lọc sử dụng đường mannose Hệ thống chọn lọc mang lại thành công đối tượng táo, cam quýt, lúa …[28], [30], [37], [50] Tuy nhiên đến đối tượng thông chưa có kết công bố Để sử dụng chất chọn lọc kháng sinh, thuốc diệt cỏ hay đường hệ thống chọn lọc tế bào chuyển gen cần xác định ngưỡng nồng độ chọn lọc thích hợp với loại tế bào, mô hay loài Các thí nghiệm cần tiến hành trước thực chuyển gen vào đối tượng trồng Theo Brukhin cộng [33], để công tác chọn lọc có hiệu đồng thời không tiêu diệt tế bào mang gen chuyển môi trường chọn lọc cần thiết lập ngưỡng nồng độ thấp loại bỏ khoảng 90% cá thể không mang gen chuyển 1.5.2 Phân tích chuyển gen gus nhuộm hoá mô tế bào Hệ thống dung hợp gen gus (Escherichia coli - β - D - glucuronidase gene) khám phá Jefferson [49] Nó xem công cụ hữu hiệu việc đánh giá hoạt động gen chuyển gen ứng dụng rộng rãi lĩnh vực biến nạp gen thực vật [15] Gen gus (uidA) gen thị lý tưởng với đặc điểm sau: Sản phẩm độc không độc với tế bào vật chủ, enzyme thị có tính ổn định cao, phương pháp phân tích sản phẩm gen đơn giản, thuận tiện, rẻ tiền, nhạy đặc thù, có khả kết hợp với polypeptide bên mà giữ hoạt tính enzyme Cơ chế biểu gen gus: gen gus mã hóa cho enzyme β-glucuronidase Enzyme hydrolase xúc tác cho phân giải chất X-Gluc (5-bromo-4- chloro-3-indolyl glucuronide), sản phẩm phân giải có màu xanh đặc trưng dễ nhận biết bền vững Trong tự nhiên β - glucuronidase không tồn thực vật, gen gus gen thị hữu hiệu kỹ thuật chuyển gen thực vật [50] Để thuận lợi cho việc sử dụng gen thị gus thực vật, người ta tiến hành thiết kế vùng cấu trúc intron (vùng không phiên mã) có chứa uidA Do vậy, bước biểu gen gus tạm thời mô thực vật tránh tượng dương tính giả Khi vi khuẩn Agrobacterium, gen gus nằm vùng intron vector chuyển gen nên không phiên mã, dịch mã để tạo sản phẩm enzyme phản ứng tạo màu đặc trưng nhuộm chất X-Gluc Chỉ chuyển vào tế bào thực vật, thông qua máy di tuyền tế bào thực vật gen gus phiên mã, dịch mã để tạo sản phẩm tham gia vào phân giải chất tạo phản ứng màu đặc trưng.Hệ thống dung hợp gen gus (Escherichia coli - β - D - glucuronidase gene) khám phá Jefferson [49] Nó xem công cụ hữu hiệu việc đánh giá hoạt động gen chuyển gen ứng dụng rộng rãi lĩnh vực biến nạp gen thực vật [15] Gen gus (uidA) gen thị lý tưởng với đặc điểm sau: Sản phẩm độc không độc với tế bào vật chủ, enzyme thị có tính ổn định cao, phương pháp phân tích sản phẩm gen đơn giản, thuận tiện, rẻ tiền, nhạy đặc thù, có khả kết hợp với polypeptide bên mà giữ hoạt tính enzyme Cơ chế biểu gen gus: gen gus mã hóa cho enzyme β-glucuronidase Enzyme hydrolase xúc tác cho phân giải chất X-Gluc (5-bromo-4- chloro-3-indolyl glucuronide), sản phẩm phân giải có màu xanh đặc trưng dễ nhận biết bền vững Trong tự nhiên β - glucuronidase không tồn thực vật, gen gus gen thị hữu hiệu kỹ thuật chuyển gen thực vật [50] Để thuận lợi cho việc sử dụng gen thị gus thực vật, người ta tiến hành thiết kế vùng cấu trúc intron (vùng không phiên mã) có chứa uidA Do vậy, bước biểu gen gus tạm thời mô thực vật tránh tượng dương tính giả Khi vi khuẩn Agrobacterium, gen gus nằm vùng intron vector chuyển gen nên không phiên mã, dịch mã để tạo sản phẩm enzyme phản ứng tạo màu đặc trưng nhuộm chất X-Gluc Chỉ chuyển vào tế bào thực vật, thông qua máy di tuyền tế bào thực vật gen gus phiên mã, dịch mã để tạo sản phẩm tham gia vào phân giải chất tạo phản ứng màu đặc trưng Tính cấp thiết Khoai lang [Ipomoea batatas (L) Lam ] thuộc họ Convolvulaceae, chi Ipomoea lương thực quan trọng đứng thứ bảy giới sau lúa mì, lúa, ngô, lúa mạch, khoai tây sắn Khoai lang nguồn thực phẩm có giá trị, giàu vitamin, khoáng chất chất xơ, thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu thô ngành công nghiệp (CIP, 2008) Mặc dù có nhiều lợi ích sản xuất khoai lang nhiều vùng giới bị hạn chếvì sâu hại, dịch bệnh cỏ dại Do đó, việc tạo giống khoai lang chuyển gen với tính trạng kháng sâu bệnh, côn trùng, thuốc diệt cỏ cho phép sản xuất khoai lang tăng lên Ở nước ta, khoai lang trồng chiếm vị trí quan trọng sản xuất lương thực, đứng thứ sau lúa ngô Năng suất khoai lang bình quân nước ta 8,25 tấn/ha, thấp nhiều so với suất bình quân quốc gia châu Mỹ số nước châu Á Năng suất thấp nguyên nhân giống khoai lang địa phương thoái hóa, việc canh tác khoai lang chưa thực quy trình kỹ thuật nguyên nhân chủ yếu tổn thất sâu bệnh, đặc biệt bọ hà hại khoai Bọ hà (Sweet potato weevil) có tên khoa học Cylas formicarius ssp sâu bệnh gây hại khoai lang nghiêm trọng giới Việt Nam Cho đến có nhiều biện pháp để trị bọ hà khoai lang như: Các nghiên cứu sử dụng biện pháp trừ sâu hóa học; Biện pháp sử dụng chất dẫn dụ sinh học; Hoặc sử dụng kết hợp biện pháp khác để phòng chống bọ hà … thu số kết tốt gặp phải số vấn đề an toàn sinh học, tốn nhiều thời gian, công sức phổ biến đến người nông dân đặc biệt đáp ứng cho nhu cầu sản xuất lớn vùng chuyên canh Vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật để tạo khoai lang kháng bọ hà cần thiết giải triệt để hạn chế phương pháp Tuy nhiên, để phát triển kỹ thuật chuyển gen vào khoai lang cần thiết phải xây dựng hệ thống nuôi cấy mô hiệu phải thiết lập quy trình chuyển gen hoàn chỉnh cho giống khoai lang nghiên cứu Nhiều nghiên cứu cho thấy khoai lang đối tượng khó xây dựng hệ thống tái sinh in vitro chuyển gen Trong nhiều năm quađã có nhiều nghiên cứu giới tập trung vào việc tìm môi trường nuôi cấy phương thức tái sinh phù hợp giống khoai lang khác Phương thức tái sinh in vitro thông qua phát sinh quan từ rễ, đốt thân (Dessai et al., 1995; Gosukonda et al., 1995; Zheng et al., 1996), thông qua đa chồi từ mô sẹo (Anwar et al., 2011), phát sinh phôi soma từ tế bào nuôi cấy huyền phù phát triển ứng dụng tạo khoai lang chuyển gen (Luo et al., 2006; Xing et al., 2008 ; Yang et al., 2011; Yu et al., 2007) Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vào nghiên cứu tạo giống bệnh tạo giống khoai lang chuyển gen tạo triển vọng việc tăng suất diện tích khoai lang Việt Nam Đã có số nghiên cứu tái sinh in vitro chuyển gen số giống khoai lang Việt Nam kết thu hạn chế (Phạm Bích Ngọc et al., 2002), đặc biệt chưa tập trung hoàn thiện hệ thống tái sinh giống khoai lang địa phương có suất chất lượng tốt Xuất phát từ lý tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu tạo khoai lang kháng bọ hà kỹ thuật chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens” nhằm xây dựng hệ thống tái sinh chuyển gen khoai lang góp phần phục vụ hướng nghiên cứu tạo khoai lang chuyển gen kháng bọ hà Đề tài thực trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mục tiêu - Xây dựng hệ thống nuôi cấy mô tái sinh in vitro thích hợp cho giống khoai lang nghiên cứu - Xây dựng quy trình chuyển gen khoai lang thông qua chuyển gen GUS sử dụng phương pháp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Nội dung 1) Nghiên cứu khả tái sinh trực tiếp 2) Nghiên cứu khả tái sinh thông qua đa chồi từ mô sẹo 3) Xây dựng quy trình chuyển gen thông qua chuyển gen GUS phương pháp thông qua Agrobacterium tumefaciens Tải file Nghiên cứu tạo khoai lang kháng bọ hà kỹ thuật chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens PP nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nuôi mô tế bào thực vật • Ø Phương pháp tạo đa chồi trực tiếp: -Sửdụng nguyên liệu khác cuống lá, mảnh lá, lát cắt thân nuôi cấy môi trường khác để tái sinh chồi Chồi hình thành trực tiếp từ nguyên liệu nuôi cấy • ØPhương pháp tái sinh đa chồi từ mô sẹo - Phương pháp nuôi cấy mô sẹo: phần non khoai lang in vitro mảnh lá, cuống lá, đỉnh nuôi cấy môi trường bổ sung loại auxin khác với nồng độ khác để cảm ứng mô sẹo - Phương pháp tái sinh qua mô sẹo: Mô sẹo nuôi cấy môi trường khác để cảm ứng tái sinh chồi • Ø Phương pháp nhân nhanh chồi: Chồi sau tái sinh in vitro đưa vào nuôi cấy môi trường phù hợp để tái sinhđa chồi nhằm mục đích tăng hệ số nhân chồi 2.3.2 Phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens - Nuôi dịch huyền phù vi khuẩn A tumefaciens: Cấy trải A tumefaciens C58 cất giữ glycerol lên đĩa môi trường LB đặc bổ sung kanamycin 50 mg/l, rifamycin 50 mg/l, chloramphenicol 50 mg/l, nuôi 28 oC 48 - 96 Sau lấy khuẩn lạc vi khuẩn nuôi ml môi trường LB lỏng (bổ sung kháng sinh phù hợp) 28 oC, lắc tốc độ 220 vòng/phút 16-18 Dịch vi khuẩn nuôi hoạt hóa môi trường LB lỏng kháng sinh 28 oC, lắc 220 vòng/phút từ - 5giờ OD 600= 0,8 -1,0 Dịch huyền phù vi khuẩn ly tâm với tốc độ 4500 vòng/ phút, oC 10 phút để thu cặn tế bào hòa tan môi trường 1/2 MS pha loãng OD 600 phù hợp - Phân tích biểu tạm thời gen gus:Theo phương pháp Jefferson đồng tác giả (Jefferson et al., 1987): Mẫu biến nạp sau thời gian đồng nuôi cấy thu ngẫu nhiên đĩa 10 – 20 mẫu, đem nhuộm với dung dịch X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide), để 8-12 tối nhiệt độ 37 oC Sau rửa cồn 70% ba lần quan sát kính hiển vi Những vùng biểu gen gus có màu xanh chàm hay xanh lam (gọi mẫu dương tính ) Hiệu chuyển gen tính tỉ lệ phần trăm mẫu biểu dương tính nhuộm gus • Ø Quy trình chuyển gen: + Cắt nguyên liệu thành mẫu có kích thước khoảng 0,3 cm(đối với đỉnh sinh trưởng), 0,3 x 0,3 cm (đối với mảnh lá) + Nguyên liệu cắt nhỏ nhiễm với dịch huyền phù vi khuẩn A tumefaciens chuẩn bị khoảng thời gian 20 - 30 phút + Mẫu nhiễm khuẩn cấy lên môi trường đồng nuôi cấy khoảng - ngày để tối + Rửa khuẩn chuyển mẫu lên môi trường chọn lọc mô sẹo + Các mô sẹo sống sót môi trường chọn lọc, cấy chuyển lên môi trường tái sinh môi trường MS bổ sung chất điều hoà sinh trưởng phù hợp để tái sinh chồi + Chồi tái sinh chọn lọc môi trường rễ MS bổ sung 100 mg/l kanamycin 2.3.3.Môi trường điều kiện nuôi cấy • Ø Môi trường nuôi cấy Môi trường tạo mô sẹo môi trường CP bổ sung 20 g/l sucrose, g/l agar Môi trường tạo phôi môi trường EP bổ sung 2% sucrose, 2,5 g/l gelrite, 50 mg/l vitamin C Môi trường nhân chồi tái sinh môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar Ngoài ra, môi trường bổ sung thêm chất kích thích sinh trưởng khác Giá trị pH môi trường nuôi cấy 5,8 Môi trường khử trùng 117 0C, khoảng thời gian từ 15- 25 phút • Ø Điều kiện nuôi cấy: - Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25- 280C - Ánh sáng: Sử dụng hệ thống giàn đèn cung cấp ánh sáng huỳnh quang với cường độ ánh sáng từ 2000 - 3000 lux Thời gian chiếu sáng 12- 14 h/ngày Hiệu KTXH Kết nghiên cứu thu đề tài có ý nghĩa khoa học thực tiễn, cụ thể là: - Kết nghiên cứu xây dựng hoàn thiện hệ thống nuôi cấy mô tế bào tái sinh giống khoai lang KB1 thông qua tái sinh chồi trực tiếp tái sinh chồi từ mô sẹo sở cho nghiên cứu tái sinh giống khoai lang địa phương khác Việt Nam, đồng thời tài liệu tham khảo chuyên ngành công nghệ tế bào thực vật bổ ích cho sinh viên, giáo viên trường cao đẳng, đại học quan tâm nghiên cứu lĩnh vực - Kết xây dựng hoàn thiện quy trình chuyển gen khoai lang giống KB1 sở để xây dựng quy trình chuyển gen giống khoai lang khác tiền đề tốt cho nghiên cứu chuyển gen Bt vào khoai lang để tạo khoai lang kháng bọ hà Việt Nam Đây hướng nghiên cứu có tính ứng dụng thực tiễn cao Hiệu đạt đề tài - Về giáo dục, đào tạo: Báo cáo tổng kết đề tài lưu giữ Phòng Công nghệ thông tin thư viện - trường Đại học Khoa học Trung tâm học liệu - Đại học Thái Nguyên tài liệu tham khảo học tập tốt cho sinh viên, giáo viên chuyên ngành Di truyền Công nghệ tế bào, Sinh lí thực vật + Đề tài phần kết quan trọng luận án tiến sĩ chủ nhiệm đề tài + Đề tài đóng góp 04 báo vào hệ thống khoa học quốc gia 01 báo cáo hội nghị quốc gia công nghệ sinh học + Đề tài góp phần đào tạo 03 cử nhân khoa học sinh học công nghệ sinh học 02 đề tài NCKH sinh viên - Về kinh tế - xã hội: Các quy trình tái sinh chuyển gen xây dựng ứng dụng vào nghiên cứu để tạo giống khoai lang kháng bọ hà góp phần vào chương trình chọn tạo giống khoai lang Việt Nam ĐV sử dụng - Khoa Khoa học sống, Trường Đại học Khoa học - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam