Nghiên cứu tạo cây khoai lang sạch virus

Cây khoai lang (Ipomea batatas L.) là cây lương thực lấy củ chiếm vị trí quan trọng trên thế giới. Hiện nay, nhu cầu khoai lang của người tiêu dùng và các nhà máy chế biến đang tăng. Tuy nhiên, năng suất khoai lang vẫn chưa cao, một trong những nguyên nhân là giống bị bệnh do nhiễm virus. Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi đã tiến hành tạo cây khoai lang in vitro sạch virus SPFMV bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh. Khử trùng mẫu là khâu đầu tiên. Các chồi được khử trùng ở ba nồng độ Javel khác nhau (5%, 10% và 15%) và hai mốc thời gian (5 và 10 phút). Để tái sinh chồi, MPSĐ được tách và cấy trên môi trường MS có bổ sung đường sucrose 30 gl, nồng độ TDZ ở các mức khác nhau (0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 mgl). Trong thí nghiệm tạo rễ, đối thân cây khoai lang (trọng lượng tươi trung bình 2 g) được cấy trên môi trường MS ½ có bổ sung đường sucrose 20 gl với ba nồng độ NAA khác nhau (0,1; 0,5 và 1 mgl). Để tăng khả năng sạch virus, cây khoai lang in vitro được xử lý nhiệt ở nhiệt độ 400Cngày (16 giờ chiếu sáng) và 380C đêm (8 giờ chiếu sáng) trong thời gian 3 tuần. Khâu cuối cùng là kiểm tra virus SPFMV bằng phương pháp TASELISA. Kết quả cho thấy các MPSĐ vô trùng tốt nhất ở nồng độ 10 % Javel trong 5 phút. Môi trường MS bổ sung nồng độ TDZ 0,1 mgl thích hợp để tái sinh chồi. Rễ cây khoai lang in vitro phát triển khỏe mạnh khi nuôi cấy trên môi trường MS ½ bổ sung NAA nồng độ 1 mgl. Kết quả test TAS ELISA có 50% mẫu ngoài ruộng dương tính và 100% mẫu cây khoai lang in vitro âm tính với virus SPFMV. Contact: nguyenvankhoa.xp@gmail.com

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CÂY KHOAI LANG (Ipomoea batatas L.) HL518 IN VITRO SẠCH VIRUS ĐỐM GỢN SÓNG ( SPFMV - Sweet potato Feathery Mottle Virus) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN VĂN KHOA Niên khóa : 2006 - 2010 Tháng 9/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CÂY KHOAI LANG (Ipomoea batatas L.) HL518 IN VITRO SẠCH VIRUS ĐỐM GỢN SÓNG ( SPFMV - Sweet potato Feathery Mottle Virus) Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực TS TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN VĂN KHOA KS TRỊNH VIỆT NGA Tháng 9/2010 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện suốt thời gian học tập - Các thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học thầy cô truyền đạt kiến thức suốt bốn năm học - Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực tập - PGS.TS Trịnh Xuân Vũ cố vấn động viên nhiều thời gian thực đề tài - TS Trần Thị Dung KS Trịnh Việt Nga tận tình hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian thực đề tài - TS Bùi Minh Trí, chị Võ Thị Thúy Huệ, anh Hồ Viết Thế nhiệt tình giúp hoàn thành đề tài - Chị Đồng Thị Thu Thảo bạn Nguyễn Minh Tân - Các bạn lớp DH06SH động viên, giúp đỡ trình học tập - Gia đình ông Trần Văn Đề giúp ổn định chỗ suốt bốn năm học Và cuối cùng, xin thành kính ghi ơn cha mẹ người thân gia đình tạo điều kiện niềm tin vững cho hôm Tp Hồ Chí Minh, ngày 13 tháng 09 năm 2010 Nguyễn Văn Khoa i TÓM TẮT Cây khoai lang (Ipomea batatas L.) lương thực lấy củ chiếm vị trí quan trọng giới Hiện nay, nhu cầu khoai lang người tiêu dùng nhà máy chế biến tăng Tuy nhiên, suất khoai lang chưa cao, nguyên nhân giống bị bệnh nhiễm virus Để giải vấn đề này, tiến hành tạo khoai lang in vitro virus SPFMV phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh Khử trùng mẫu khâu Các chồi khử trùng ba nồng độ Javel khác (5%, 10% 15%) hai mốc thời gian (5 10 phút) Để tái sinh chồi, MPSĐ tách cấy môi trường MS có bổ sung đường sucrose 30 g/l, nồng độ TDZ mức khác (0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 0,5 mg/l) Trong thí nghiệm tạo rễ, đối thân khoai lang (trọng lượng tươi trung bình g) cấy môi trường MS ½ có bổ sung đường sucrose 20 g/l với ba nồng độ NAA khác (0,1; 0,5 mg/l) Để tăng khả virus, khoai lang in vitro xử lý nhiệt nhiệt độ 400C/ngày (16 chiếu sáng) 380C/ đêm (8 chiếu sáng) thời gian tuần Khâu cuối kiểm tra virus SPFMV phương pháp TAS-ELISA Kết cho thấy MPSĐ vô trùng tốt nồng độ 10 % Javel phút Môi trường MS bổ sung nồng độ TDZ 0,1 mg/l thích hợp để tái sinh chồi Rễ khoai lang in vitro phát triển khỏe mạnh nuôi cấy môi trường MS ½ bổ sung NAA nồng độ mg/l Kết test TAS- ELISA có 50% mẫu ruộng dương tính 100% mẫu khoai lang in vitro âm tính với virus SPFMV Từ khóa: khoai lang, nuôi cấy MPSĐ, TDZ, NAA, xử lý nhiệt, TAS-ELISA, virus ii SUMMARY The thesis title: “Study of in vitro propagation of free SPMV (Sweet Potato Feathery Mottle Virus) HL518 (red Japan) sweet potato plants” Sweet potato is one of main tuber crops grown around the world Nowadays, the demand for use of sweet potato for both table food and food processing industry is keeping on increasing Growing sweet potato, therefore, can help earning better income for farmers As a matter of fact, it is difficult to select and maintain a good and free virus plant/variety In an effort to find a solution for free virus plants, we have conducted a research to produce virus-free sweet potato plants by meristem culture and thermorapy Firstly, sterilization is an important step Shoots were disinfected in the three different levels of Javel concentration; (5%; 10% and 15%) in two different time lenght (5 and 10 minutes) To help shoots regeneration, meristems had been cut and cultured on basal MS medium supplemented with sucrose 30 g/l and TDZ various concentrations (0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 and 0,5 mg/l) In the experiment of root developing, stems with leaf (2 g of fresh weight) had cultured on MS ½ medium supplemented with sucrose 20 g/l and NAA various concentrations (0,1; 0,5; and 1,0 mg/l) To increase effective for eliminating viruses, sweet potato had thermorapy treated by chamber of plants at 400C for three weeks Finally, TAS-ELISA test was carried out to check the result of SPFMV elimination Results, the optimal sterilized treament for shoots was with 10% Javel on minutes The best shoot regeneration on basal MS medium supplemented with TDZ 0,1 mg/l Roots were good heathy MS 1/2 a medium supplemented with NAA 1mg/l TAS- ELISA results showed that three out of six (50%) of field samples positive and all in vitro samples (100%) negative with SPFMV Keywords: sweetpotato, meristem culture, thermorapy, TDZ, NAA, TAS-ELISA, free-virus iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách từ viết tắt viii Danh sách bảng ix Danh sách hình x Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Nội dung thực Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu khái quát khoai lang 2.1.1 Nguồn gốc khoai lang 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm thực vật, sinh trưởng phát triển khoai lang 2.1.3.1 Đặc điểm thực vật 2.1.3.2 Đặc điểm sinh trưởng phát triển 2.2 Nguồn gen giống khoai lang giới Việt Nam 2.3 Các giống khoai lang trồng Việt Nam 2.3.1 Các giống khoai lang phổ biến Việt Nam 2.3.2 Giới thiệu số giống khoai lang tốt 2.4 Tình hình sản xuất tiêu thụ khoai lang 2.4.1 Trên giới 2.4.2 Việt Nam 10 2.5 Các loại virus gây hại môi giới truyền bệnh virus khoai lang 11 2.5.1 Các loại virus 11 iv 2.5.1.1 Hình thái virus 11 2.5.1.2 Cấu tạo 12 2.5.1.3 Phương thức lây truyền 12 2.5.2 Các loại virus gây hại khoai lang 12 2.5.2.1 Virus đốm gợn sóng khoai lang (SPFMV) 12 2.5.2.2 Virus làm hõm khoai lang (SPSVV) 13 2.5.2.3 Bệnh virus khoai lang (SPVD) 13 2.5.2.4 Virus hoa nhẹ khoai lang (SPMMV) 13 2.6 Kỹ thuật nhân giống in vitro 15 2.6.1 Giới thiệu 15 2.6.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro 15 2.7 Vai trò chất điều hòa tăng trưởng nuôi cấy mô 17 2.7.1 Auxin 17 2.7.2 Cytokinin 18 2.7.3 Gibberelline 20 2.8 Các phương pháp làm virus 21 2.8.1 Khái niệm 21 2.8.2 Các phương pháp tạo virus 21 2.8.2.1 Xử lý nhiệt 21 2.8.2.2 Nuôi cấy mô phân sinh 22 2.8.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh (MPSĐ) kết hợp với xử lý nhiệt 27 2.8.2.4 Tạo chồi bất định kết hợp nuôi cấy MPSĐ 27 2.8.2.5 Vi ghép 27 2.9 Giới thiệu phương pháp phát chuẩn đoán virus 28 2.9.1 Phương pháp chuẩn đoán thị 28 2.9.2 Phương pháp chuẩn đoán miễn dịch hấp thụ gắn kết enzyme (ELISA) 28 2.9.3 Phương pháp TBIA (Tissue Blot Immumoassay) 29 2.9.4 Phương pháp chuẩn đoán sinh học phân tử 30 2.9.4.1 Phương pháp PCR RT-PCR 30 v 2.9.4.2 Phương pháp đa hình đoạn dài giới hạn 30 2.9.4.3 Probe đánh dấu 30 2.9.4.4 Phương pháp hiển vi quang học hiển vi điện tử 30 2.10 Kết nghiên cứu nuôi cấy MPSĐ khoai lang nước 31 2.10.1 Kết nước 31 2.10.2 Kết nước 31 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 33 3.1.1 Thời gian 33 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 33 3.2 Vật liệu 33 3.2.1 Mẫu nuôi cấy 33 3.2.2 Môi trường nuôi cấy 33 3.2.3 Hóa chất 33 3.2.4 Trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm 33 3.3 Phương pháp nghiên cứu 35 3.3.1 Nội dung 1: Tạo khoai lang in vitro virus 35 3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ thời gian khử trùng chồi 35 3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng TDZ 37 3.3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA 38 3.3.2 Nội dung 2: Xử lý nhiệt kiểm tra virus SPFMV khoai lang 39 3.3.2.1 Nội dung 2a: Xử lý nhiệt 39 3.3.2.2 Nội dung 2b: Kiểm tra virus SPFMV khoai lang 40 3.3.3 Xử lý số liệu 42 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Kết 44 4.1.1 Nội dung 1: Tạo khoai lang in vitro virus 44 4.1.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ thời gian khử trùng chồi 44 4.1.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng TDZ 45 vi 4.1.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA 46 4.1.2 Nội dung 2: Xử lý nhiệt kiểm tra virus SPFMV khoai lang 48 4.1.2.1 Nội dung 2a: Xử lý nhiệt 48 4.1.2.2 Nội dung 2b: Kiểm tra virus SPFMV khoai lang 49 4.2 Thảo luận 50 4.2.1 Nội dung 1: Tạo khoai lang in vitro virus 50 4.2.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ thời gian khử trùng chồi 50 4.2.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng TDZ 50 4.2.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA 53 4.2.2 Nội dung 2b: Kiểm tra virus SPFMV khoai lang 53 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA Benzyl Adenine cDNA Complementary Deoxynucleic Acid Ctv Cộng tác viên CIP International Center Potato DAS Double Antibody Sandwich DNA Deoxy Nucleic Acid ĐST Đỉnh Sinh Trưởng ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay GA3 Gibberellic Acid IBA -Indole Butyric Acid IPO Instute of Phytopathological Research MS Murashige Skoog MPSĐ Mô Phân Sinh Đỉnh NAA -Naphtalen Acetic Acid PCR Polymerase Chain Reaction RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribose nucleic acid RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction SPFMV Sweetpotato Feathery Mottle Virus SPSVV Sweetpotato Streak Veine Virus SPVD Sweetpotato Virus Diasease SPMMV Sweetpotato Mild Mottle Virus TAS-ELISA Triple Antibody Sandwich ELISA TBIA Tissue Blot Immunoassay TDZ Thidiazuron TMV Tobacco Mosaic Virus 2,4-D Dichlorophenory Acetic Acid viii (1) (2) NT 0,3 NT 0,4 NT 0,5 (3) 1 1 1 (4) 1 1 (5) 1 2 (6) 2 2 (7) 3 2 Bảng 2: Số liệu lần lặp lại dùng cho thí nghiệm 2, nội dung Nghiệm thức R0 R1 R2 R3 NAA (mg/l) 0,1 0,5 Số rễ trung bình Tuần Tuần 2,3 3,7 2,3 4,7 2,7 3,7 3,3 4,7 2,3 3,7 2,7 4,7 5,7 8,7 5,7 10,3 4,0 7,7 10,3 13,0 8,0 10,7 14,7 14,7 Chiều dài rễ trung bình Tuần Tuần 3,6 7,9 1,9 5,2 2,3 7,0 2,4 7,1 2,3 6,7 2,5 6,3 4,1 18,2 4,0 18,7 1,4 14,2 2,2 10,7 2,8 9,9 2,4 10,0 (8) 3 2 PHỤ LỤC TÀI LIỆU BỔ SUNG SỬ DỤNG TAS-ELISA KIT DÙNG ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS SPFMV TRÊN KHOAI LANG Giới thiệu Việc phát virus thực vật phương pháp huyết dựa khả phản ứng đặc hiệu in vitro kháng thể (antibody) với kháng nguyên (antigen) virus virus Phương pháp xét nghiệm miễn dịch hấp thụ gắn kết enzyme (enzyme-linked immunusorbent assay - ELISA) theo kiểu ELISA sandwich ba kháng thể (Triple antibody sandwich ELISA - TAS-ELISA) kỹ thuật huyết nhậy cảm Kỹ thuật sử dụng kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies) IgG gắn lên bề mặt giá thể polyvinyl pH 9,6 Các kháng nguyên virus hay virus( antigen A) có mẫu cây, trước tiên bị bắt (capture) kháng thể đặc hiệt IgG kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody-Mab) từ chuột để phát kháng nguyên (A) Một kháng thể khác có liên kết với enzyme (E) sử dụng để phát kháng thể đơn dòng Enzyme gắn kết với kháng thể trường hợp alkaline phosphatase phát thông qua phản ứng chất tạo màu vàng kết dựa vào cường độ màu ELISA kit hãng DSMZ (Đức) sản xuất dùng để phát virus đốm gợn sóng khoai lang (SPFMV) Chuẩn bị chất đệm (buffer) Chất đệm phủ áo giếng ( coating buffer) Thành phần: 0,59 g sodium carbonate (Na2CO3) 0,293 g sodium bicarbonate (NaHCO3) 0,2 g sodium azide (NaN3) Làm tan viên coating 90 ml nước, điều chỉnh pH đến 9,6 HCl xong tăng lượng dung dịch thành 1lit PBS (pH 7,4) phosphate bufferd saline Thành phần g sodium chloride (NaCl) 0,2 g monobasic potassium phosphate (KH2PO4) 1,15 g dibasic sodium chloride (KCl) 0,2 g sodium azide (NaN3) Hòa tan gói PBS 900ml nước, điều chỉnh pH đến 7,4 NaOH hay HCl, xong tăng lượng dung dịch 1l PBS-Tween (chất đệm rửa PBS-T) 1000ml PBS + 0,5ml Tween (20 giọt  0,5ml) Đệm ly trích (sample extraction buffer) (pH 7,4) PBS-T + 2% PVP (Serva PVP-15 polyvinyl pyrrolidone) Để thực 100 test dùng 100ml dung dịch PBS-T + 2g PVP Đệm conjugate buffer ( đệm tiếp hợp) PBS-T + 2% PVP + 0,2% egg albumin (Sigma A-5253) Đệm chất (substrate buffer) Hòa tan viên Tris bufferes Saline tablet 15ml nước cất ***Các buffer bảo quản nhiệt độ 40C thời gian tháng Làm ấm nhiệt độ phòng trước dùng Chuẩn bị dịch mẫu Thu thập ấn định mẫu túi plastic ( việc thực 2-3 ngày trước bảo quản mẫu nhiệt độ 40C) Đối với ruộng dùng để xét nghiệm, chọn có triệu chứng thu thập phần – ngọn, thân gốc Trước xét nghiệm cần rửa Thêm lần dung dịch chất đệm ly trích ( so với khối lượng mẫu) vào cối để nghiền mẫu Nghiền mẫu dịch mẫu có biểu đồng Chú ý lần nghiền mẫu, cối chày phải rửa khử trùng cồn Chắt dung dịch vào eppendorf ly tâm 3000 vòng phút PHỤ LỤC 1.TỶ LỆ MẪU SỐNG ANOVA Table for Mau song by Nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 9062.5 1812.5 4.35 0.0172 Within groups 5000.0 12 416.667 Total (Corr.) 14062.5 17 Table of Means for Mau song by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -NT 83.3333 11.7851 65.1765 101.49 NT 83.3333 11.7851 65.1765 101.49 NT 3 100.0 11.7851 81.8432 118.157 NT 75.0 11.7851 56.8432 93.1568 NT 50.0 11.7851 31.8432 68.1568 NT 33.3333 11.7851 15.1765 51.4901 -Total 18 70.8333 Multiple Range Tests for Mau song by Nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -NT 33.3333 X NT 50.0 XX NT 75.0 XX NT 83.3333 XX NT 83.3333 XX NT 3 100.0 X -Contrast Difference +/- Limits -NT - NT 0.0 36.3136 NT - NT -16.6667 36.3136 NT - NT 8.33333 36.3136 NT - NT 33.3333 36.3136 NT - NT *50.0 36.3136 NT - NT -16.6667 36.3136 NT - NT 8.33333 36.3136 NT - NT 33.3333 36.3136 NT - NT *50.0 36.3136 NT - NT 25.0 36.3136 NT - NT *50.0 36.3136 NT - NT *66.6667 36.3136 NT - NT 25.0 36.3136 NT - NT *41.6667 36.3136 NT - NT 16.6667 36.3136 -* denotes a statistically significant difference SỐ CHỒI TRUNG BÌNH 2.1 Số chồi trung bình tuần ANOVA Table for Tuan by Nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.31944 0.188492 0.95 0.4734 Within groups 12.6667 64 0.197917 Total (Corr.) 13.9861 71 Table of Means for Tuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -NT 0.0 0.148293 -0.20948 0.20948 NT 0.222222 0.148293 0.0127423 0.431702 NT 0.333333 0.148293 0.123853 0.542813 NT 0.444444 0.148293 0.234964 0.653924 NT 0.444444 0.148293 0.234964 0.653924 NT 0.222222 0.148293 0.0127423 0.431702 NT 0.222222 0.148293 0.0127423 0.431702 NT 0.222222 0.148293 0.0127423 0.431702 -Total 72 0.263889 Multiple Range Tests for Tuan by Nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -NT 0.0 X NT 0.222222 XX NT 0.222222 XX NT 0.222222 XX NT 0.222222 XX NT 0.333333 XX NT 0.444444 X NT 0.444444 X -Contrast Difference +/- Limits -NT - NT -0.222222 0.41896 NT - NT -0.333333 0.41896 NT - NT *-0.444444 0.41896 NT - NT *-0.444444 0.41896 NT - NT -0.222222 0.41896 NT - NT -0.222222 0.41896 NT - NT -0.222222 0.41896 NT - NT -0.111111 0.41896 NT - NT -0.222222 0.41896 NT - NT -0.222222 0.41896 NT - NT 0.0 0.41896 NT - NT 0.0 0.41896 NT - NT 0.0 0.41896 NT - NT -0.111111 0.41896 NT - NT -0.111111 0.41896 NT - NT 0.111111 0.41896 NT - NT 0.111111 0.41896 NT - NT 0.111111 0.41896 NT - NT 0.0 0.41896 NT - NT 0.222222 0.41896 NT - NT 0.222222 0.41896 NT - NT 0.222222 0.41896 NT - NT 0.222222 0.41896 NT - NT 0.222222 0.41896 NT - NT 0.222222 0.41896 NT - NT 0.0 0.41896 NT - NT 0.0 0.41896 NT - NT 0.0 0.41896 -* denotes a statistically significant difference 2.2 Số chồi trung bình tuần ANOVA Table for Tuan by Nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.61111 0.373016 1.71 0.1236 Within groups 14.0 64 0.21875 Total (Corr.) 16.6111 71 Table of Means for Tuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -NT 0.0 0.155902 -0.220229 0.220229 NT 0.333333 0.155902 0.113104 0.553563 NT 0.555556 0.155902 0.335326 0.775785 NT 0.555556 0.155902 0.335326 0.775785 NT 0.555556 0.155902 0.335326 0.775785 NT 0.444444 0.155902 0.224215 0.664674 NT 0.222222 0.155902 0.00199279 0.442452 NT 0.222222 0.155902 0.00199279 0.442452 -Total 72 0.361111 Multiple Range Tests for Tuan by Nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -NT 0.0 X NT 0.222222 XX NT 0.222222 XX NT 0.333333 XX NT 0.444444 X NT 0.555556 X NT 0.555556 X NT 0.555556 X -Contrast Difference +/- Limits -NT - NT -0.333333 0.440459 NT - NT *-0.555556 0.440459 NT - NT *-0.555556 0.440459 NT - NT *-0.555556 0.440459 NT - NT *-0.444444 0.440459 NT - NT -0.222222 0.440459 NT - NT -0.222222 0.440459 NT - NT -0.222222 0.440459 NT - NT -0.222222 0.440459 NT - NT -0.222222 0.440459 NT - NT -0.111111 0.440459 NT - NT 0.111111 0.440459 NT - NT 0.111111 0.440459 NT - NT 0.0 0.440459 NT - NT 0.0 0.440459 NT - NT 0.111111 0.440459 NT - NT 0.333333 0.440459 NT - NT 0.333333 0.440459 NT - NT 0.0 0.440459 NT - NT 0.111111 0.440459 NT - NT 0.333333 0.440459 NT - NT 0.333333 0.440459 NT - NT 0.111111 0.440459 NT - NT 0.333333 0.440459 NT - NT 0.333333 0.440459 NT - NT 0.222222 0.440459 NT - NT 0.222222 0.440459 NT - NT 0.0 0.440459 -* denotes a statistically significant difference.2.3 Số chồi trung bình 2.3 Số chồi trung bình tuần ANOVA Table for Tuan by Nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 10.0972 1.44246 3.61 0.0024 Within groups 25.5556 64 0.399306 Total (Corr.) 35.6528 71 Table of Means for Tuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -NT 0.0 0.210635 -0.297546 0.297546 NT 0.444444 0.210635 0.146899 0.74199 NT 0.666667 0.210635 0.369121 0.964213 NT 1.33333 0.210635 1.03579 1.63088 NT 0.888889 0.210635 0.591343 1.18643 NT 0.444444 0.210635 0.146899 0.74199 NT 0.444444 0.210635 0.146899 0.74199 NT 0.333333 0.210635 0.0357874 0.630879 -Total 72 0.569444 Multiple Range Tests for Tuan by Nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -NT 0.0 X NT 0.333333 XX NT 0.444444 XX NT 0.444444 XX NT 0.444444 XX NT 0.666667 X NT 0.888889 XX NT 1.33333 X -Contrast Difference +/- Limits -NT - NT -0.444444 0.595092 NT - NT *-0.666667 0.595092 NT - NT *-1.33333 0.595092 NT - NT *-0.888889 0.595092 NT - NT -0.444444 0.595092 NT - NT -0.444444 0.595092 NT - NT -0.333333 0.595092 NT - NT -0.222222 0.595092 NT - NT *-0.888889 0.595092 NT - NT -0.444444 0.595092 NT - NT 0.0 0.595092 NT - NT 0.0 0.595092 NT - NT 0.111111 0.595092 NT - NT *-0.666667 0.595092 NT - NT -0.222222 0.595092 NT - NT 0.222222 0.595092 NT - NT 0.222222 0.595092 NT - NT 0.333333 0.595092 NT - NT 0.444444 0.595092 NT - NT *0.888889 0.595092 NT - NT *0.888889 0.595092 NT - NT *1.0 0.595092 NT - NT 0.444444 0.595092 NT - NT 0.444444 0.595092 tuần NT - NT 0.555556 0.595092 NT - NT 0.0 0.595092 NT - NT 0.111111 0.595092 NT - NT 0.111111 0.595092 -* denotes a statistically significant difference 2.4.Số chồi trung bình tuần ANOVA Table for Tuan by Nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 9.77778 1.39683 3.53 0.0029 Within groups 25.3333 64 0.395833 Total (Corr.) 35.1111 71 Table of Means for Tuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -NT 0.0 0.209718 -0.296249 0.296249 NT 0.444444 0.209718 0.148195 0.740694 NT 0.666667 0.209718 0.370417 0.962916 NT 1.33333 0.209718 1.03708 1.62958 NT 0.888889 0.209718 0.592639 1.18514 NT 0.555556 0.209718 0.259306 0.851805 NT 0.666667 0.209718 0.370417 0.962916 NT 0.333333 0.209718 0.0370839 0.629583 -Total 72 0.611111 Multiple Range Tests for Tuan by Nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -NT 0.0 X NT 0.333333 XX NT 0.444444 XX NT 0.555556 XX NT 0.666667 X NT 0.666667 X NT 0.888889 XX NT 1.33333 X -Contrast Difference +/- Limits -NT - NT -0.444444 0.592499 NT - NT *-0.666667 0.592499 NT - NT *-1.33333 0.592499 NT - NT *-0.888889 0.592499 NT - NT -0.555556 0.592499 NT - NT *-0.666667 0.592499 NT - NT -0.333333 0.592499 NT - NT -0.222222 0.592499 NT - NT *-0.888889 0.592499 NT - NT -0.444444 0.592499 NT - NT -0.111111 0.592499 NT - NT -0.222222 0.592499 NT - NT 0.111111 0.592499 NT - NT *-0.666667 0.592499 NT - NT -0.222222 0.592499 NT - NT 0.111111 0.592499 NT - NT 0.0 0.592499 NT - NT 0.333333 0.592499 NT - NT 0.444444 0.592499 NT - NT *0.777778 0.592499 NT - NT *0.666667 0.592499 NT - NT *1.0 0.592499 NT - NT 0.333333 0.592499 NT - NT 0.222222 0.592499 NT - NT 0.555556 0.592499 NT - NT -0.111111 0.592499 NT - NT 0.222222 0.592499 NT - NT 0.333333 0.592499 -* denotes a statistically significant difference 2.5 Số trung bình tuần ANOVA Table for Tuan by Nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 8.66667 1.2381 2.85 0.0118 Within groups 27.7778 64 0.434028 Total (Corr.) 36.4444 71 Table of Means for Tuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -NT 0.0 0.219603 -0.310213 0.310213 NT 0.666667 0.219603 0.356454 0.97688 NT 0.666667 0.219603 0.356454 0.97688 NT 1.33333 0.219603 1.02312 1.64355 NT 0.888889 0.219603 0.578676 1.1991 NT 0.888889 0.219603 0.578676 1.1991 NT 0.666667 0.219603 0.356454 0.97688 NT 0.666667 0.219603 0.356454 0.97688 -Total 72 0.722222 Multiple Range Tests for Tuan by Nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -NT 0.0 X NT 0.666667 X NT 0.666667 X NT 0.666667 X NT 0.666667 X NT 0.888889 XX NT 0.888889 XX NT 1.33333 X -Contrast Difference +/- Limits -NT - NT *-0.666667 0.620426 NT - NT *-0.666667 0.620426 NT - NT *-1.33333 0.620426 NT - NT *-0.888889 0.620426 NT - NT *-0.888889 0.620426 NT - NT *-0.666667 0.620426 NT - NT *-0.666667 0.620426 NT - NT 0.0 0.620426 NT - NT *-0.666667 0.620426 NT - NT -0.222222 0.620426 NT - NT -0.222222 0.620426 NT - NT 0.0 0.620426 NT - NT 0.0 0.620426 NT - NT *-0.666667 0.620426 NT - NT -0.222222 0.620426 NT - NT -0.222222 0.620426 NT - NT 0.0 0.620426 NT - NT 0.0 0.620426 NT - NT 0.444444 0.620426 NT - NT 0.444444 0.620426 NT - NT *0.666667 0.620426 NT - NT *0.666667 0.620426 NT - NT 0.0 0.620426 NT - NT 0.222222 0.620426 NT - NT 0.222222 0.620426 NT - NT 0.222222 0.620426 NT - NT 0.222222 0.620426 NT - NT 0.0 0.620426 -* denotes a statistically significant difference 2.6 Số chồi trung bình tuần ANOVA Table for Tuan by Nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 11.2778 1.61111 3.29 0.0047 Within groups 31.3333 64 0.489583 Total (Corr.) 42.6111 71 Table of Means for Tuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -NT 0.0 0.233234 -0.329469 0.329469 NT 0.666667 0.233234 0.337198 0.996136 NT 0.777778 0.233234 0.448309 1.10725 NT 1.33333 0.233234 1.00386 1.6628 NT 1.0 0.233234 0.670531 1.32947 NT 0.888889 0.233234 0.55942 1.21836 NT 0.888889 0.233234 0.55942 1.21836 NT 1.33333 0.233234 1.00386 1.6628 -Total 72 0.861111 Multiple Range Tests for Tuan by Nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -NT 0.0 X NT 0.666667 X NT 0.777778 XX NT 0.888889 XX NT 0.888889 XX NT 1.0 XX NT 1.33333 X NT 1.33333 X -Contrast Difference +/- Limits -NT - NT *-0.666667 0.658938 NT - NT *-0.777778 0.658938 NT - NT *-1.33333 0.658938 NT - NT *-1.0 0.658938 NT - NT *-0.888889 0.658938 NT - NT *-0.888889 0.658938 NT - NT *-1.33333 0.658938 NT - NT -0.111111 0.658938 NT - NT *-0.666667 0.658938 NT - NT -0.333333 0.658938 NT - NT -0.222222 0.658938 NT - NT -0.222222 0.658938 NT - NT *-0.666667 0.658938 NT - NT -0.555556 0.658938 NT - NT -0.222222 0.658938 NT - NT -0.111111 0.658938 NT - NT -0.111111 0.658938 NT - NT -0.555556 0.658938 NT - NT 0.333333 0.658938 NT - NT 0.444444 0.658938 NT - NT 0.444444 0.658938 NT - NT 0.0 0.658938 NT - NT 0.111111 0.658938 NT - NT 0.111111 0.658938 NT - NT -0.333333 0.658938 NT - NT 0.0 0.658938 NT - NT -0.444444 0.658938 NT - NT -0.444444 0.658938 -* denotes a statistically significant difference THÍ NGHIỆM TẠO RỄ 3.1 SỐ RỄ Ở TUẦN ANOVA Table for So re_tuan by Nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 423.333 141.111 11.44 0.0000 Within groups 394.667 32 12.3333 Total (Corr.) 818.0 35 Table of Means for So re_tuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -R 2.44444 1.17063 0.758351 4.13054 R 2.77778 1.17063 1.09168 4.46387 R 5.11111 1.17063 3.42502 6.7972 R 11.0 1.17063 9.31391 12.6861 -Total 36 5.33333 Multiple Range Tests for So re_tuan by Nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -R 2.44444 X R 2.77778 X R 5.11111 X R 11.0 X -Contrast Difference +/- Limits -R - R -0.333333 3.37219 R - R -2.66667 3.37219 R - R *-8.55556 3.37219 R - R -2.33333 3.37219 R - R *-8.22222 3.37219 R - R *-5.88889 3.37219 -* denotes a statistically significant difference 3.2 số rễ tuần ANOVA Table for So re _tuan by Nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 458.083 152.694 13.54 0.0000 Within groups 360.889 32 11.2778 Total (Corr.) 818.972 35 Table of Means for So re _tuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -R 4.0 1.11941 2.38767 5.61233 R 4.33333 1.11941 2.72101 5.94566 R 8.88889 1.11941 7.27656 10.5012 R 12.6667 1.11941 11.0543 14.279 -Total 36 7.47222 Multiple Range Tests for So re _tuan by Nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -R 4.0 X R 4.33333 X R 8.88889 X R 12.6667 X -Contrast Difference +/- Limits -R - R -0.333333 3.22465 R - R *-4.88889 3.22465 R - R *-8.66667 3.22465 R - R *-4.55556 3.22465 R - R *-8.33333 3.22465 R - R *-3.77778 3.22465 -* denotes a statistically significant difference 3.3 Chiều dài tuần ANOVA Table for C.daire_tuan by Nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3.17639 1.0588 0.84 0.4840 Within groups 40.52 32 1.26625 Total (Corr.) 43.6964 35 Table of Means for C.daire_tuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -R 2.62222 0.375093 2.08196 3.16248 R 2.41111 0.375093 1.87085 2.95137 R 3.16667 0.375093 2.62641 3.70692 R 2.47778 0.375093 1.93752 3.01804 -Total 36 2.66944 Multiple Range Tests for C.daire_tuan by Nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -R 2.41111 X R 2.47778 X R 2.62222 X R 3.16667 X -Contrast Difference +/- Limits -R - R 0.211111 1.08052 R - R -0.544444 1.08052 R - R 0.144444 1.08052 R - R -0.755556 1.08052 R - R -0.0666667 1.08052 R - R 0.688889 1.08052 -* denotes a statistically significant difference 3.3 Chiều dài rễ tuần ANOVA Table for C.daire_tuan by Nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 635.881 211.96 46.68 0.0000 Within groups 145.289 32 4.54028 Total (Corr.) 781.17 35 Table of Means for C.daire_tuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -R 6.7 0.710264 5.67698 7.72302 R 6.71111 0.710264 5.68809 7.73413 R 17.0 0.710264 15.977 18.023 R 10.2 0.710264 9.17698 11.223 -Total 36 10.1528 Multiple Range Tests for C.daire_tuan by Nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -R 6.7 X R 6.71111 X R 10.2 X R 17.0 X -Contrast Difference +/- Limits -R - R -0.0111111 2.04603 R - R *-10.3 2.04603 R - R *-3.5 2.04603 R - R *-10.2889 2.04603 R - R *-3.48889 2.04603 R - R *6.8 2.04603 -* denotes a statistically significant difference [...]... Sinh học Nhiệt đới, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu tạo cây khoai lang (Ipomoea batatas L.) HL518 in vitro sạch virus đốm gợn sóng SPFMV (Sweet Potato Feathery Mottle Virus) ” 1.2 Mục đích đề tài Ứng dụng nuôi cấy MPSĐ kết hợp xử lý nhiệt để tạo cây khoai lang sạch bệnh virus SPFMV 1.3 Nội dung thực hiện Nội dung 1: Tạo cây khoai lang in vitro sạch virus Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ và thời gian... vấn đề Trong các loại cây lương thực có củ, khoai lang chiếm vị trí quan trọng Trên thế giới khoai lang là 1 trong 5 cây có củ quan trọng (sắn, khoai lang, khoai mỡ, khoai sọ, khoai tây) Hiện nay, khoai lang được rất nhiều người ưa chuộng Giá trị dinh dưỡng khoai lang cũng khá rõ, thành phần dinh dưỡng chính là đường bột, protein, các vitamin và chất khoáng Tính tiện lợi của khoai lang thể hiện là có... virus gây hại và môi giới truyền bệnh virus trên khoai lang 2.5.1 Sơ lƣợc về virus 2.5.1.1 Hình thái virus Virus thực vật có hình thái và kích thước rất đa dạng Virus có thể có dạng hình gậy (virus khảm thuốc lá - TMV, virus khảm sọc lá lúa mạch…), hình cầu (virus 11 khảm dưa chuột, virus khảm súp lơ), hình khối đa diện, hình sợi (virus X khoai tây, Closterovirus) 2.5.1.2 Cấu tạo Thông thường mỗi virus. .. hơn Ở nước ta, khoai lang là 1 trong 4 loại cây trồng chính sau lúa, ngô, sắn Những năm gần đây, khoai lang đã trở thành cây trồng làm giàu cho nhiều người, giá bán 1kg khoai lang cao hơn 1kg lúa Tuy nhiên năng suất khoai lang vẫn còn thấp do giống bị thoái hóa, tạp lẫn, sâu bệnh, virus gây hại Tổn thất do virus gây hại khoai lang thường rất lớn, nhưng chưa có loại thuốc nào trị được Các virus gây bệnh... nhân giống ban đầu không sạch virus Trên thực tế, diện tích cây trồng bị nhiễm virus ngày càng lan rộng vì nguồn giống ban đầu chưa đảm bảo sạch virus nói riêng và các mầm bệnh khác nói chung; từ đó, các loại môi giới tiếp tục truyền virus sang cây khỏe giúp virus thực hiện quá trình xâm nhiễm, gây bệnh 2.5.2 Các virus gây hại trên khoai lang Trong tất các thể gây bệnh khoai lang, virus dường như gây ra... Nguồn gen giống khoai lang trên thế giới và Việt Nam Nguồn gen giống khoai lang lớn nhất toàn cầu có ở Trung tâm Khoai tây Quốc tế (Centro Internacional de la Papa – CIP) với 7007 mẫu giống, gồm 5920 mẫu giống khoai lang trồng Ipomoea batatas và 1087 mẫu giống khoai lang hoang dại Ipomoea trifida và các loài Ipomoea khác Khoai lang Mỹ nổi tiếng về chất lượng cao, phổ biến là các giống khoai lang ruột củ... MPSĐ kết hợp với xử lý nhiệt có hiệu quả làm sạch virus đối với nhiều loại cây 1 như khoai tây, khoai lang, sắn, tỏi, cây ăn quả có múi, chuối, nho, mơ, mận, cây hoa như cúc, cẩm chướng…đã và đang được sử dụng có hiệu quả Để năng suất cũng như diện tích khoai lang Nhật ngày một tăng, nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ cao thì việc cần phải làm là tạo giống sạch virus Được sự chấp nhận của Bộ môn Công Nghệ... 48 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Khoai lang HL 518 4 Hình 2.2 Cây khoai lang và các bộ phận 4 Hình 2.3 Vùng phân bố và vị trí kinh tế của cây khoai lang 10 Hình 2.4 Các dạng biểu hiện bệnh virus trên lá khoai lang 14 Hình 2.5 Vị trí mô phân sinh đỉnh 22 Hình 2.6 Cấu tạo các lớp MPSĐ 23 Hình 2.7 Cấu tạo mô học của MPSĐ 23 Hình 2.8 Qui... thiệu khái quát về cây khoai lang 2.1.1 Nguồn gốc cây khoai lang Khoai lang có nguồn gốc ở Nam Mỹ khoảng 5.000 năm trước Công Nguyên Dấu tích củ khô tồn tại lâu nhất được khám phá tại Caves của Chilca Canyon thuộc Peru (Engel, 1970) Người ta cũng tìm thấy sự hiện diện của khoai lang đầu tiên tại vùng Mayan của Trung Mỹ Astin (1977) đã giả thuyết có hai trung tâm phát sinh nguồn gốc khoai lang tại Guatamala... và có hương vị thơm Khoai lang Nhật cũng nổi tiếng về chất lượng cao Khoai lang Trung Quốc cho năng suất cao, chịu lạnh nhưng chất lượng không ngon so với khoai lang Nhật, Mỹ khi trồng ở Việt Nam Nhược điểm của 6 khoai lang Mỹ khi trồng ở Việt Nam là độ bột, vị thơm, chất lượng và thị hiếu không bằng khoai lang Nhật, thời gian sinh trưởng dài (trên 115 ngày) Nguồn gen giống khoai lang Việt Nam chủ yếu