Nghiên cứu tạo cây khoai lang kháng bọ hà bằng kỹ thuật chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

http://kienthucsinhhoc.com/tap-chi-sinh-hoc/Cong-nghe-Sinh-hoc/Nghien-cuu- su-tai-sinh-In-Vitro-mot-so-giong-khoai-lang-Viet-Nam-136/ Tên đề tài: Nghiên cứu tạo cây khoai lang kháng bọ hà bằng kỹ thuật chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens: Vũ Thị Lan: Đại học Thái Nguyên Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong và ngoài nước. 1. Ngoài nước Khoai lang là đối tượng rất khó xây dựng hệ thống nuôi cấy, tái sinh cây in vitro và chuyển gen. Trong nhiều năm qua, đã có nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tìm ra môi trường nuôi cấy cũng như phương thức tái sinh phù hợp ở các giống khoai lang khác nhau, đặc biệt là các giống khoai lang có năng suất cao và chất lượng tốt. Theo nhiều kết quả nghiên cứu, môi trường nuôi cấy mô khoai lang sử dụng phổ biến là môi trường Murashige và Skoog (1965) và được bổ sung tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau. Một số tác giả đã sử dụng công thức mô trường nuôi cấy mô khoai lang gồm hai giai đoạn. Giai đoạn đầu nuôi cấy bổ sung auxin, giai đoạn thứ hai bổ sung cytokinin là zeatin hoặc TDZ cho hiệu quả tái sinh tốt. Theo Dessaiet al, các mảnh lá của củ khoai lang [ipomoea batatas L.(Lam)] được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4D 0,2mg/l trong 3 ngày và sau đó chuyển sang môi trường bổ sung riboside zeatin 0,2mg/l cho hiệu quả tái sinh tốt ở kiểu gen PI 318846-3 (Dessaiet al., 1995). Gosukondaet al. thu được tỷ lệ tái sinh chồi đạt 78,2% trong vòng 28 ngày trên môi trường giai đoạn hai bổ sung thidiazuron 0,2mg/l (Gosukondaet al., 1995). Sự tái sinh cây khoai lang trong nuôi cấy mô và chuyển gen đã thu được từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau. Nguồn nguyên liệu đem nuôi cấy có thể là lá, cuống lá, đoạn thân, mô phân sinh và phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển của chúng. Phương thức phát sinh cây của cây khoai lang in vitro rất đa dạng: cây có thể tái sinh từ protoplast (Moránet al.,1998), thông qua sự phát sinh cơ quan, từ rễ, lá và đốt thân (Luoet al., 2006). Ngoài ra, sự tạo chồi có thể được cảm ứng trực tiếp từ rễ bất định hoặc từ chồi (Zanget al., 2009). Sự phát sinh phôi sôma từ các mảnh cắt như đỉnh chồi, đỉnh sinh trưởng, lá, cuống lá, thân, và rễ (Newelet al.,1995; Yiet al., 2007), từ nuôi cấy huyền phù tế bào (Yuet al., 2007; Zanget al., 2009). Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở khoai lang Việc chèn một gen đơn lẻ vào khoai lang bằng phương pháp truyền thống rất phức tạp vì trạng thái lục bội tự nhiên của nó. Vì vậy, chuyển gen vào khoai lang thông qua vi khuẩn A.tumefaciens là cách thức ưu việt nhất để tránh phải thực hiện việc lai chéo hay lai ngược tốn rất nhiều thời gian và công sức. Trong một vài năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nỗ lực để tối ưu hóa quy trình tái sinh và tạo cây khoai lang chuyển gen. Nhiều nghiên cứu chuyển gen vào cây khoai lang như nghiên cứu chuyển gen nhờ xung điện vào protoplast, chuyển gen nhờ vi khuẩn A. rhizogenes (Otani et al.,1993), súng bắn gen (Yi et al., 2007), và nghiên cứu chuyển gen nhờ A. tumefaciens được xem là phù hợp nhất và được sử dụng rộng rãi để chuyển gen vào khoai lang (Newel et al., 1995; Morán et al., 1998, Otaniet al., 1998; Song et al., 2004; Otani et al., 2001; Luo et al., 2006; Yu et al., 2007; Zang et al., 2009). Tuy nhiên, hầu hết các kết quả thu được tần số chuyển gen còn thấp và phụ thuộc nhiều vào kiểu gen và chỉ thành công trên một vài giống nhất định. Chuyển gen vào khoai lang tập trung chủ yếu vào hướng tạo cây khoai lang chuyển gen kháng sâu và côn trùng (Newel et al.,1995; Morán et al., 1998), kháng thuốc diệt cỏ (Yi et al., 2000; Zang et al., 2009 ) và kháng virus (Okada et al., 2001), chuyển gen làm tăng hàm lượng tinh bột. Newel et al.(1995) đã xây dựng được một quy trình chuyển gen vào giống Jewel sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ A. tumefaciens. Morán et al. (1998) cũng đã thu được một số dòng Jewel chuyển gen CryIIIA bằng phương pháp chuyển gen nhờ A. tumefaciens. Okada et al. (2001) đã tạo được cây khoai lang chuyển gen kháng virus SPFMV bằng phương pháp chuyển gen mã hóa protein vỏ virus bằng phương pháp xung điện. Nhóm tác giả đã thu được 3 dòng cây chuyển gen và phân tích sự phiên mã, dịch mã của gen bằng các phương pháp Nothern và Western và cũng đã phân tính tính kháng virus của các dòng khoai lang chuyển gen. Yi et al. (2007) đã tạo được cây khoai lang mang gen bar kháng thuốc diệt cỏ bằng phương pháp bắn gen vào callus phát sinh phôi bắt nguồn từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Zang et al. (2009) cũng đã tạo được cây khoai lang chuyển gen bar nhờ chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 thông qua nuôi cấy huyền phù phát sinh phôi. Khi phân tích sự có mặt của gen GUS và thực hiện phản ứng PCR thu được tần số chuyển gen cao 86,5 % cây chuyển gen, số bản copy là từ 1 đến 3. Tuy nhiên, ở đây các tác giả chưa đánh giá được tính kháng thuốc diệt cỏ của các dòng cây chuyển gen. 1. Dessai AP; Gosukonda RM; Blay E; Dumenyo CK; Medina-Bolivar F; Prakash CS,(1995) Plant regeneration of sweet potato (Ipomoea batatas L.) from leaf explants in vitro using a two-stage protocol. Scientia Horticulturae, Vol. 62: 217-224. 2. González RG, Sánchez DS, Campos JM,Vázquez EP, Guerra ZZ, Quesada AL,Valdivia RM, González MG (1999) Plant regeneration from leaf and stem explants from two sweet potato (Ipomoea batatas L. Lam.) Cultivars. Biotecnologia Aplicada; Vol. 16 (1): 11 - 14 . 3. Garía R, Somontes D, Zaldúa Z, Mena J, López A, Morán R, Arencibia AD, Quiroz K Caligari PDS (2008) Efficient regeneration and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of recalcitrant sweet potato (Ipomoea batatas (L.) cultivars. Asia Pacific Joural of Molecular Biotechnology, Vol. 16(2): 25-33. 4. Luo HR, Santa maria M, Benavides J, Zhang DP, Zhang YZ, Ghislain M (2004) Rappid genetic transformation of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam) via organogenesis. African Journal of Biotechnology, Vol. 5 (20): 1851- 1857. 5. Newel CA, Lowe JM, Merryweather A, Rooke LM, Hamilton WDO (1995) Transformation of sweet potato ( Ipomoea batatas (L.) La bacterium tumefaciens and regeneration of plants express cow pea trypsin m) with Agro inhibitor and snowdrop. Plant Science, Vol.107:215-227. 6. Gosukonda RM, Prakash CS, Porobodessai A, Blay E, Peterson (1995) Thidiazuron - induced adventitious shoot regeneration of sweet potato (Ipomoea batatas. In vitro Cell Dev Biol 31: 65-71. 7. Yu B, Zhai H, Wang Y, Zang N, Wang Y, Liu Q (2007) Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation ussing embyogenic suspension culture in sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam). Plant Cell Tiss Organ Cult, Vol. 90: 265- 273. 8. Yi G, Shin YM, Choe G, Shin B, Kim YS, Kim KM (2007) Production of herbicide- resistant sweet potato plants transformed with the bar gene. Biotechnol Lett, Vol. 29: 669- 675. 1. Zang N, Zhai H, Gao S, Chen W, He S, Liu Q (2009) Efficient production of transgenic plants using the bar gene for herbicide resistance in sweetpotato. Scientia Horticulturae, Vol.122: 649-653. 2. Trong nước Ở Việt Nam, trong những năm gần đây cũng đã có một số Viện nghiên cứu đầu ngành như Viện Công nghệ sinh học-Viện KH & CN Việt Nam, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam thực hiện các đề tài, dự án nghiên cứu trên đối tượng khoai lang và cũng đã thu được một số kết quả bước đầu (Viện Công nghệ sinh học, 2011). Viện Công nghệ sinh học đã thực hiện một số đề tài như: Phân lập gen và tạo cây khoai lang chuyển gen kháng bọ hà (Hợp tác ISAAA, từ 1997 đến nay). Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống kháng sâu bệnh và có chất lượng cao ở cây khoai lang (2003)”, đề tài nhánh trong đề tài KC-04-22: “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống kháng sâu bệnh và có chất lượng cao ở một số cây có củ” do Viện Di truyền nông nghiệp chủ trì. Một số kết quả nổi bật của đề tài là đã phân lập và thiết kế gen diệt bọ hà ở khoai lang, đã chuyển gen và đánh giá cây chuyển gen ở phòng thí nghiệm và nhà lưới, hoàn thiện quy trình tái sinh cây chuyển gen và áp dụng thử nghiệm. Đề tài “Xây dựng và hoàn thiện các qui trình chuyển gen cho các đối tương thực vật và tạo cây trồng chuyển gen” đã xây dựng được quy trình chuyển gen vào một số cây trồng như lúa, thuốc lá, bông, đu đủ, khoai lang, cà chua, cây xoan, đậu tương, cây cam sành, quýt đường canh. Đề tài “Phân lập các gen có giá trị kinh tế của cây trồng nông lâm nghiệp Việt Nam”. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân lập các promoter đặc hiệu thực vật, các gen liên quan đến tính kháng côn trùng, thiết kế vector chuyển gen thực vật. Những kết quả này phục vụ tốt cho các nghiên cứu về chuyển gen thực vật nói chung và đặc biệt là chuyển gen ở khoai lang. Viện Di truyền nông nghiệp đã chuyển gen kháng nấm, gen kháng bọ hà, và gen kháng virus vào khoai lang. Đã thu được 10 dòng trong đó có 2 dòng mang gen Cry1Cm, 13 dòng trong đó có 2 dòng mang gen VIP, 01 dòng khoai lang chuyển gen CP kháng virus. Các dòng khoai lang này hiện đang được trồng thử tại Trạm chuyển giao công nghệ Văn Giang, Hưng Yên. Hiện nay, Viện Công nghệ sinh học đang tiến hành đề tài “Nghiên cứu tạo giống khoai lang kháng bọ hà bằng công nghệ gen” do GS.TS. Lê Trần Bình làm chủ nhiệm đề tài. Đây là đề tài có tính ứng dụng cao, các kết quả nghiên cứu thu được sẽ góp phần vào việc phát triển cây khoai lang kháng bọ hà của Việt Nam. 1. Lê Trần Bình (2008) Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam. NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội. 2. Hoàng Kim (2011) Giống khoai lang ở Việt Nam, truy nhập từ địa chỉ http://foodcrops.blogspot.com/. 3. Đinh Thế Lộc (1995) Cây khoai lang. NXB Nông nghiệp. 4. Viện Công nghệ sinh học (2011) truy nhập từ địa chỉ: 5. http://www.ibt.ac.vn/index.php? option=com_content&task=view&id=392&Itemid=580 10.3. Danh mục các công trình đã công bố thuộc lĩnh vực của đề tài của chủ nhiệm và những thành viên tham gia nghiên cứu a) Công trình của chủ nhiệm đề tài: 1. Vũ Thị Lan, Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, “Ảnh hưởng của tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng và nước dừa đến sinh khối mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí KH&CN- ĐHTN, Tập 82, số 06, 2011, trang 65-69 2. Vũ Thị Lan, Phạm Thị Oanh, “Nhân giống dứa Cayen (Ananas comous L.) bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng”, Tạp chí KH&CN- ĐHTN, tập 67 số 05 - 2010, trang 118-122. 3. Vũ Thị Lan, Nguyễn Thị Quỳnh Trang, Nguyễn Thanh Mai, “Nuôi cấy mô sẹo để tái sinh cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí KH&CN- ĐHTN, tập 53 số 5-2009, trang 96-101. 4. Vũ Thị Lan, Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, “Ảnh hưởng của tổ hợp các chất điều tiết sinh trưởng và casein đến sinh khối mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí công nghệ sinh học, tập 6, số 1, năm 2008, trang 97-106. 5. Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thị Lan, Nguyễn Thành Luân “Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và giá thể đến sinh trưởng của cây lan Dendrobium hybrid in vitro”. Tạp chí KH&CN- ĐHTN, tập 2, số 3, 2007, trang 105- 109. 6. Vi Thị Đoan Chính, Nguyễn Thị Ngọc Liên, Trịnh Ngọc Hoàng, Trịnh Đình Khá, Vũ Thị Lan, “Nghiên cứu sự phân bố của xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập ở đất Thái Nguyên”, Báo cáo hội nghị khoa học sinh học toàn quốc, 2007, trang 433- 436. 7. Quách Thị Liên, Vũ Thị Lan, Lê Thị Vân Anh, Nguyễn Đức Thành, “Nuôi cấy mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí công nghệ sinh học, tập 3, số 3, năm 2005, trang 353- 362 . b) Công trình của những người tham gia đề tài: 1. Vũ Thanh sắc, Nghiên cứu nhân giống in vitro cây ban Âu (Hypericum perforatum L.), Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2009 2. Nguyễn Thanh Nhàn, Phạm Thị Minh Đức, Lê Thu Ngọc, Lê Văn Trường, Đỗ Thị Huyền, Trần Ngọc Tân, Phạm Thùy Linh, Trương Nam Hải (2010), Thiết kế plasmid tái tổ hợp từ vector biểu hiện pAC7 mang gen entP dung hợp với các phân đoạn baamylF1 và baamylF2 để tổng hợp enterocin P trong Bacillus subtilis 168, Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(1): 13-20. 3. Nguyễn Thanh Nhàn, Lê Thu Ngọc, Đỗ Thị Huyền, Trần Ngọc Tân, Phạm Thùy Linh, Lê Văn Trường, Trương Nam Hải (2009), “Tách dòng và biểu hiện gen Enterocin P ở dạng dung hợp với CBD-SSP Intein trong Escherichia coli ER2566”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(2), tr. 27-33. 4. Phạm Thùy Linh, Lê Thu Ngọc, Trần Ngọc Tân, Nguyễn Thanh Nhàn, Đỗ Thị Huyền, Lê Văn Trường, Trương Nam Hải (2009), “Biểu hiện gen mã hóa cho Enterocin P của vi khuẩn Enterococcus faecium trong nấm men Pichia pastoris GS115”, Hội nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen và Quản lý an toàn sinh học 2009, tr.145-149. Tính cấp thiết Ở nước ta, khoai lang là cây trồng chiếm một vị trí quan trọng trong sản xuất lương thực, đứng thứ 3 sau lúa và ngô. Tổng diện tích trồng khoai lang cả nước là 181.690 ha (TCTK, 2006). Năng suất khoai lang bình quân ở nước ta là 7,8 tấn/ha, thấp hơn nhiều so với năng suất bình quân của các quốc gia ở châu Mỹ và một số nước châu Á (Fao, 2007). Năng suất thấp ngoài các nguyên nhân về giống khoai lang địa phương đã thoái hóa, việc canh tác khoai lang chưa thực hiện đúng quy trình kỹ thuật . thì nguyên nhân chủ yếu là do tổn thất vì sâu bệnh, đặc biệt là do bọ hà hại khoai. Ở Việt Nam, thiệt hại do bọ hà khoai lang gây ra ở các vùng chuyên canh hoặc trên đất khô hạn có thể lên đến 30 - 50%, thậm chí có thể lên đến 60%. Thiệt hại chủ yếu xảy ra do sâu non bọ hà đục ăn thịt củ và thải phân ngay trong đường đục làm cho củ khoai xuất hiện những vết thâm, mùi hắc và vị đắng khi ăn. Hiện nay, đã có nhiều biện pháp để trị bọ hà khoai lang như sử dụng các biện pháp trừ sâu hóa học; Biện pháp sử dụng chất dẫn dụ sinh học; Hoặc sử dụng kết hợp các biện pháp khác nhau để phòng chống bọ hà … đã thu được một số kết quả tốt nhưng đang gặp phải một số vấn đề như an toàn sinh học, còn tốn quá nhiều thời gian, công sức và không thể phổ biến đến từng người nông dân và đặc biệt là không thể đáp ứng cho nhu cầu sản xuất lớn của các vùng chuyên canh. Vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật để tạo cây khoai lang mang gen Bt kháng bọ hà là rất cần thiết và sẽ giải quyết triệt để các hạn chế của các phương pháp trên. Tuy nhiên, khoai lang là đối tượng rất khó xây dựng hệ thống nuôi cấy, tái sinh cây in vitro và chuyển gen. Chính vì vậy, trong nhiều năm qua trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tìm ra môi trường nuôi cấy cũng như phương thức tái sinh phù hợp ở các giống khoai lang khác nhau, đặc biệt là các giống khoai lang có năng suất cao và chất lượng tốt. Đối với cây khoai lang ở Việt Nam, hiện đang có các nghiên cứu sâu để chọn tạo ra các giống (1)có năng suất cao; (2.) Chất lượng cao và (3.) khoai lang rau. Vì thế, đề tài “Nghiên cứu xây dựng qui trình nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen ở cây khoai lang thông qua vi khuẩn Agrobacterium“sẽ đóng góp vào việc hoàn thiện quy trình nuôi cây mô tế bào và chuyển gen phục vụ cho chuyển gen Bt để tạo cây khoai lang kháng tốt với bọ hà và đóng góp vào chương trình tạo giống khoai lang ở Việt Nam. Mục tiêu - Xác định được một số điều kiện nuôi cấy, tái sinh cây in vitro thích hợp cho giống khoai lang nghiên cứu. - Lựa chọn được phương thức tái sinh cây hiệu quả nhằm xây dựng được quy trình tái sinh cây khoai lang phục vụ cho chuyển gen. - Xây dựng quy trình chuyển gen vào khoai lang bằng chuyển gen GUS thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Nội dung 1) Nghiên cứu khả năng tái sinh thông qua đa chồi - Xác định loại mẫu cấy phù hợp - Xác định thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy thích hợp cho cảm ứng tạo đa chồi - Xác định thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy để nhân nhanh chồi - Xác định thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy phù hợp cho tạo cây hoàn chỉnh 2) Nghiên cứu khả năng tái sinh thông qua phôi sôma - Xác định loại mẫu cấy phù hợp cho tạo mô sẹo - Xác định thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy thích hợp cho cảm ứng tạo mô sẹo - Xác định thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy thích hợp cho tạo phôi từ mô sẹo - Xác định thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy để nhân nhanh chồi - Xác định thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy phù hợp cho tạo cây hoàn chỉnh 3) Nghiên cứu chuyển gen GUS vào giống khoai lang thông qua Agrobacterium đã xây dựng được quy trình tái sinh - Xác đinh điều kiện xử lí và thời gian tiền nuôi cấy của vật liệu sử dụng cho chuyển gen - Xác định nồng độ vi khuẩn gây nhiễm, thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy phù hợp cho hiệu quả chuyển gen cao - Xác đinh ngưỡng chọn lọc tối ưu để sàng lọc chồi/cây chuyển gen 4)Đánh giá hiệu quả của quy trình chuyển gen vào khoai lang PP nghiên cứu a)Phương pháp nuôi cây mô tế bào: - Phương pháp khử trùng mẫu - Phương pháp tạo mô sẹo - Phương pháp tái sinh thông qua tạo đa chồi - Phương pháp tái sinh thông qua phôi soma b) Phương pháp chuyển gen thông qua A. tumerfaciens - Agrobacterium mang vectơ chuyển gen có gen chỉ thị GUS được nhiễm vào mảnh cấy (mảnh lá, cuống lá). Tiếp tục nuôi cộng sinh vật liệu chuyển gen với Agrobacterium trong 2-3 ngày. Sau đó, tiến hành chọn lọc cây chuyển gen trên môi trường có chứa kháng sinh - Phương pháp nhuộm GUS (Theo phương pháp nhuộm tế bào học của Jefferson & CS,1986) - Chọn lọc cây chuyển gen trên môi trường chứa chất kháng sinh Kiểm tra sự có mặt của gen GUS bằng kỹ thuật PCR Hiệu quả KTXH ĐV sử dụng PHẦN I: MỞ ĐẦU . 1 1. Lý do chọn đề tài . 1 2. Mục đích và mục tiêu . 3 3. Đối tượng nghiên cứu . 3 4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài . 3 PHẦN II: NỘI DUNG 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4 1. Đặc điểm chung của cây khoai môn sọ(Colocasia esculenta (L.) Schott) 4 1.1. Phân loại cây khoai môn sọ 4 1.2. Nguồn gốc và phân bố . 5 1.3. Đặc điểm hình thái 6 1.4. Sinh trưởng và phát triển 7 1.5. Điều kiện sinh thái 8 1.6. Thành phần dinh dưỡng, giá trị kinh tế và sử dụng 9 1.7. Kĩ thuật trồng và chăm sóc . 9 2. Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật trong công tác giống cây trồng 11 2.1. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.1.1. Định nghĩa 11 2.1.2. Khả năng sử dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào công tác giống cây trồng 12 2.1.3. Cơ sở sinh học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 12 2.1.3.1.Tính toàn năng của tế bào . 12 2.1.3.2. Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào . 13 2.2. Nhân giống vô tính in vitro . 16 2.2.1. Ý nghĩa . 16 2.2.2. Quy trình nhân giống vô tính in vitro 17 2.2.3. Các phương thức nhân giống in vitro 19 2.3. Môi trường nuôi cấy . 20 2.3.1.Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy 20 2.3.2 Chuẩn bị môi trường 24 3. Tình hình nghiên cứu qui trình nhân giống vô tính khoai môn sọ (Colocasia esculenta) bằng tạo củ in vitro trên thế giới và ở Việt Nam . 26 3.1. Tình hình nghiên cứu tạo củ in vitro ở khoai môn sọ trên thế giới 26 Trong đề tài này đã nghiên cứu được những vấn đề sau: . 26 3.1.1. Giới thiệu 26 3.1.2. Phương pháp 27 3.1.3 Phương pháp thu củ và thống kê 28 3.1.4. Bảo quản và trồng củ . 28 3.1.5. Kết quả . 29 3.1.5.1. Ảnh hưởng của môi trường tạo củ lên sự hình thành củ trong ống nghiệm . 29 3.1.5.2. Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy lên sự hình thành củ . 30 3.1.5.3. Sự phát triển của củ trong ống nghiệm . 30 3.1.5.4. Bảo quản và trồng ra vườn . 31 3.2. Tình hình nghiên cứu tạo củ in vitro khoai môn sọ ở Việt Nam . 31 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 1. Vật liệu nghiên cứu . 33 2. Phương pháp nghiên cứu 34 2.1. Thí nghiệm xác định công thức khử trùng thích hợp cho mẫu nuôi cấy . 34 2.2. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp của mẫu cấy. 36 2.3. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân nhanh chồi. . 37 2.4. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự ra rễ . 37 2.5. Thí nghiệm xác định môi trường thích hợp cho tạo củ in vitro 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 1. Kết quả nghiên cứu xác định công thức khử trùng thích hợp 40 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp của mẫu cấy 43 3. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân nhanh chồi 47 4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự ra rễ của cây in vitro 50 5. Kết quả nghiên cứu môi trường tạo củ in vitro thích hợp 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 61 PHỤ LỤC . 63 Tìm hướng ra cho khoai lang nhật. Tìm hướng ra cho giống khoai lang Nhật (Mard-22/9/2011): Qua một thời gian đưa vào trồng thử nghiệm giống khoai lang Nhật Bản tại huyện Xuân Lộc, Đồng Nai cho thấy đây là giống cây trồng có hiệu quả kinh tế, cho năng suất cao, ổn định và phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng tại địa phương. Tuy nhiên, hiện tại nông dân chỉ tiêu thụ sản phẩm trong nội địa và chưa mạnh dạn mở rộng diện tích vì chưa tìm được đầu ra. * Khoai lang Nhật – cây trồng kinh tế cao Đầu năm 2008, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam do Kỹ sư Trịnh Việt Nga làm chủ nhiệm đưa các giống khoai lang Nhật chất lượng cao vào trồng tại 3 xã Xuân Hòa, Xuân Tâm, Xuân Trường (huyện Xuân Lộc, Đồng Nai). Khoai được trồng trên diện tích ban đầu là 70 ha bằng các kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp xử lý nhiệt để tạo ra cây khoai lang sạch bệnh, bảo tồn nguồn gen khoai lang tốt bằng nuôi cấy mô, từ đó nhân giống khoai lang ra đồng ruộng nhằm nâng cao thu nhập cho người nông dâ n. C ác chuyên gia của Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam cho rằng, việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào khoai lang sẽ góp phần quản lý tốt nguồn gen, cung ứng trong một thời gian xác định theo hợp đồng số lượng cây đúng giống, đồng đều và sạch bệnh để trồng trên quy mô công nghiệp làm nguồn nguyên liệu chế biến phục vụ tiêu thụ nội địa và xuất khẩu thay vì dùng phương pháp cũ là đi thu mua cây giống trong dân. Theo báo cáo của Phòng Nông nghiệp và Phát triển nông thôn huyện Xuân Lộc: s au gần 3 năm thực hiện, các giống khoai lang Nhật theo Dự án “Áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật để sản xuất khoai lang Nhật tại huyện Xuân Lộc, tỉnh Đồng Nai”, được Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam tuyển chọn đều sinh trưởng, phát triển và cho năng suất ổn định qua nhiều vụ. Riêng vụ Đông Xuân 2010 – 2011, do thời tiết có nhiều bất thường, trời mưa làm ngập úng ở giai đoạn mới xuống giống, tuy nhiên cây khoai lang Nhật vẫn phát triển tốt, đặc biệt là giống khoai lang nuôi cấy mô tỷ lệ sống 97%, năng suất của loại 1 đạt từ 50 – 57,8%, so với trồng mì và bắp thì nông dân lãi 3 - 3,5 triệu/vụ/1000 m2. Những nông dân tham gia trồng khoai lang Nhật thí điểm cho biết: trồng khoai lang không tốn . và tạo cây khoai lang chuyển gen. Nhiều nghiên cứu chuyển gen vào cây khoai lang như nghiên cứu chuyển gen nhờ xung điện vào protoplast, chuyển gen nhờ vi. học đã thực hiện một số đề tài như: Phân lập gen và tạo cây khoai lang chuyển gen kháng bọ hà (Hợp tác ISAAA, từ 1997 đến nay). Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng