Nghiên cứu phân lập gene syrb 2 ừ chủng vi khuẩn pseudomonas syringae pv syringae sinh tổng hợp syringomycin cao

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - ĐINH THỊ HUỆ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GENE SYRB2 TỪ CHỦNG VI KHUẨN PSEUDOMONAS SYRINGAE PV SYRINGAE SINH TỔNG HỢP SYRINGOMYCIN CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Thái Nguyên - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - ĐINH THỊ HUỆ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GENE SYRB2 TỪ CHỦNG VI KHUẨN PSEUDOMONAS SYRINGAE PV SYRINGAE SINH TỔNG HỢP SYRINGOMYCIN CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn : TS Đồng Văn Quyền ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH- CNTP, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - 2015 i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp nhận quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ tận tình thầy bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn: Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Đồng Văn Quyền Phó viện trưởng Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện khoa học Việt Nam, ThS Bùi Đình Lãm giảng viên Khoa Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, anh Nguyễn Hải Triều, chị Mai Thùy Linh cán phịng Vi sinh phân tử, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện khoa học Việt Nam người tận tình bảo, trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực để tài q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện khoa học Việt Nam, cán bộ, anh chị làm việc Bộ môn Vi sinh vật học Phân tử giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè ln động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Đinh Thị Huệ ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Độc tố thực vật sản xuất vi khuẩn Pseudomonas spp Bảng 3.1 Thành phần mơi trường LB (cho lít mơi trường) 23 Bảng 3.2 Thành phần môi trường King’s B nuôi cấy vi khuẩn Pseudomonas syringae pv syringae 23 Bảng 3.3 Thành phần dung dịch dùng tách chiết DNA plasmid 24 Bảng 3.4 Thành phần dung dịch dùng điện di DNA 24 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR gene SyrB2 27 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng 29 Bảng 3.7: Các thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn 31 Bảng 3.8: Các thành phần hỗn hợp chất phản ứng A 32 Bảng 3.9: Các thành phần hỗn hợp chất phản ứng B 33 Bảng 3.10: Thành phần chất tham gia phản ứng real-time PCR 34 Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng real-time PCR 35 Bảng 4.1: Kết đo nồng độ DNA tổng số từ chủng P.syringae kiểu dại đột biến 38 Bảng 4.2: Kết xác định tỉ lệ A260/A280 nồng độ ARN(ng/μl) chủng P.syringae pv syringae kiểu dại kiểu đột biến 38 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Pseudomonas kính hiển vi điện tử [16] Hình 2.2 Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp đĩa thạch (A) hình thái tế bào (B) [1] Hình 2.3 Cấu trúc Syringomycin E [29] Hình 2.4: Cơ chế sinh tổng hợp peptide nonribosomal [10] Hình 2.5 Hoạt động SyrB2 sinh tổng hợp syringomycin 15 Hình 2.6 Vector tách dịng pGEM-T Easy 20 Hình 4.1: DNA tổng số chủng Pseudomonas syringae pv syringae 37 Hình 4.2: Điện di sản phẩm PCR gen SyrB2 chủng PS kiểu dại đột biến 39 Hình 4.3: Đĩa petri chứa khuẩn lạc sau biến nạp 40 Hình 4.4: Kết tách chiết DNA plasmid từ khuẩn lạc xanh trắng 41 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Amp Ampicillin Bp Base pair – cặp base nito PDA Potato Dextro Agar BLAST Basic Local Aligenment Search Tool DNA Deoxyribonucleic axit dNTP Deoxynucleotide Triphotphate E coli Escherichia coli Et al; cs Cộng IPTG Isopropyl Thiogalactoside Kb Kilo base –kilo base nito LB Lauria Broth SDS Sodium Dodecyl Sulfate PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp SR-E Syringomycin E TAE Tris- acetate- EDTA TE Tris- EDTA X –gal 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside v MỤC LỤC Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan vi khuẩn Pseudomonas syringae pv syringae 2.1.1 Đặc điểm Pseudomonas syringae pv syringae 2.1.2 Khả gây bệnh chung P syringae 2.1.3 Khả sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm 2.2 Khái quát Syringomycin E 2.2.1 Đặc điểm cấu trúc, thành phần SyrE 2.2.2 Cơ chế diệt vi sinh vật Syringomycin E 10 2.2.3 Phổ hoạt động Syringomycin E 11 2.3 Tình hình nghiên cứu Syringomycin E ngồi nước 12 2.3.1 Tình hình nghiên cứu Syringomycin E giới 12 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Syringomycin E Việt Nam 14 2.4 Chức protein SyrB2 15 2.5 Phương pháp PCR, realtime PCR 16 2.5.1 Phương pháp PCR 16 2.5.2 Real-time PCR 18 2.6 Vector tách dòng pGEM-T Easy 19 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị máy móc 22 3.1.1 Chủng vi khuẩn 22 vi 3.1.2 Thiết bị, máy móc 22 3.1.3 Hóa chất sinh phẩm 22 3.1.4 Môi trường dung dịch 23 3.2 Địa điểm thời gian thực tập 25 3.3 Nội dung nghiên cứu 25 3.4 Phương pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi khuẩn 25 3.4.2 Phương pháp PCR 26 3.4.3 Phương pháp điện di DNA gel agarose 27 3.4.4 Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy 28 3.4.5 Biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α 29 3.4.6.Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 30 3.4.7 Cắt kiểm tra pGEM-T Easy -SyrB2 với EcoRI 31 3.4.8 Kỹ thuật tách ARN từ vi khuẩn 31 3.4.9 Phương pháp chuyển cDNA mồi ngẫu nhiên 32 3.4.10 Kỹ thuật Real-time PCR 33 3.4.11 Tinh sản phẩm PCR 35 3.4.12 Giải trình tự gene 36 Phần 4: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƢỢC VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Tách chiết DNA, RNA tổng số vi khuẩn Pseudomonas syrringae PS120 37 4.2 Tạo dòng gen SyrB2 38 4.2.1 Khuếch đại gen SyrB2 chủng vi khuẩn P syringae PS 120 cặp mồi đặc hiệu 38 4.2.2 Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy 39 4.2.3 Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E coli 40 4.2.4 Kiểm tra kết tạo dòng 41 4.3 Kết giải trình tự phân tích gen Syrb2 43 vii 4.3.1 Kết giải trình tự gen 43 4.3.2 So sánh trình tự gen SyrB2 kiểu dại, kiểu đột biến trình tự SyrB2 chuẩn NCBI 44 4.3.3 So sánh trình tự gen SyrB2 chủng kiểu dại chủng đột biến 44 4.4 Kiểm tra biểu tương đối gen SyrB2 mức độ gen kỹ thuật Real time PCR 44 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hằng năm giới, bệnh gây tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp Chúng phá hủy 537,3 triệu loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp giới Trong loại bệnh bệnh nấm gây chiếm khoảng 83%, bệnh nấm Fusarium Rhizocronia gây với tỷ lệ lớn Chúng gây bệnh nhiều loại rau lương thực lạc, cà chua, khoai tây, cà phê,tiêu Biện pháp phòng trừ bệnh hại trồng phổ biến sử dụng loại thuốc hóa học Mặc dù có ưu điểm phổ tác dụng rộng, hiệu tác dụng nhanh, thuốc hóa học ngày bộc lộ rõ nhược điểm hiệu phòng trừ thấp loại nấm bệnh đất, nhanh bị ức chế nấm bệnh sau thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Hơn nữa, ngày gia tăng bệnh nhiễm nấm, loại thuốc kháng nấm có sẵn, loài nấm ngày kháng với thuốc chống nấm có sẵn, dẫn đến việc mở rộng việc tìm kiếm chế phẩm sinh học chống nấm Chủng Pseudomonas syringae pv syringae sản xuất lipodepsinonapeptides với hoạt tính kháng nấm Nghiên cứu ống nghiệm chế kháng nấm hoạt động diệt nấm ba lipodepsinonapeptides (syringomycin E, syringotoxin B, syringostatin A) cho thấy, ba hợp chất có khả chống nấm phổ rộng có hoạt tính diệt hầu hết loài nấm thử nghiệm Syringomycin E (C53 H85CLN14O17) hợp chất quan trọng nghiên cứu Syringomycin B2 enzyme quan trọng liên quan chặt chẽ trình tiết Syringomycin E, hoạt chất có phổ kháng khuẩn nấm rộng sản sinh Pseudomonas syringae pv.Syringae 43 4.3 Kết giải trình tự phân tích gen Syrb2 4.3.1 Kết giải trình tự gen Sản phẩm PCR gắn plasmid tái tổ hợp gửi giải trình tự hãng Macrogene (Hàn Quốc) Chúng thu trình tự gen SyrB2 kiểu dại kiểu đột biến: - Trình tự gen SyrB2 chủng kiểu dại TCATGAGCAAAAAATTCGCTTTAACTGCGGAACAGCGTGCCTCGTTCGAGAAAAACGGCTTTATCGGTCCGTT TGACGCCTATTCGCCAGAAGAAATGAAGGAAACCTGGAAGCGCACCCGTCTGCGCCTGCTCGACCGTAGCGCC GCCGCCTATCAGGACCTGGACGCCATTTCCGGGGGTACCAACATCGCCAACTATGACCGCCATCTGGACGATG ACTTTCTGGCCAGCCACATCTGTCGCCCGGAAATCTGCGATCGCGTCGAAAGTATCCTCGGCCCTAATGTGCT GTGCTGGCGCACCGAGTTCTTTCCCAAGTATCCGGGCGATGAAGGCACCGACTGGCATCAGGCCGATACGTTC GCCAATGCCTCCGGCAAGCCGCAGATCATCTGGCCGGAAAACGAAGAGTTCGGCGGCACCATCACCGTCTGGA CGGCGTTCACCGACGCCAACATTGCCAATGGCTGCCTGCAGTTCATTCCTGGCACCCAGAACAGGCGGATGGC GCACGGCCAAAGTCCTGGCCGACCACATCTCCCGTAGCCTTGTTCAAGCCCATTGACCGAAAAGGAAAAGCGC ATGAACTACGACGAAACCAAGCGCATGAGCTATGAGCCCGACGCCAACAACTCGGTGGTCAAGGACGGCGTGC GTCGCGGTTTCTTCGGTTACGACTATCGCCAGTTGCAGATCGATGAGAACTGGAAGCCCGACGAGGCCTCTGC TGTGCCCATGCAGATGAAAGCCGGGCAGTTCATCATTTTCTGGTCGACCCTGATGCATGCGTCCTATCCGCAC AGCGGCGAATCACAGGAGATGCGCATGGGCTTTGCGTCACGCTACGTACCGTCGTTCGTGCACATCTATCCGG ATTCGGACCACATCGAAGAGTACGGCGGCCGCATCAGCCTGGAGAAATACGGTGCGGTGCAGGTGATCGGTGA CGAAACACCGGAATACAACCGCCTTGTGACTCACACCACACGCGGCAAGAAATTCGAAGCGGTCTGACCCACA TACGTCAGACGACAGTAGCCTCGCGCAATGGGCCTGTTGCGCGAGGCTACTGTCGTCTGACGTATGTGGGTCA GACCGCTTCGAATTTCTTGCCGCGTGTGGTGTGAGTCACAAGGCGGTTGTATTCCGGTGTTTCGTCACCGATC ACCTGCACCGCACCGTATTTCTCCAGGCTGATGCGGCCGCCGTACTCTTCGATGTGGTCCGAATCCGGATAGA TGTGCACGAACGACGGTACGTAGCGTGACGCAAAGCCCATGCGCATCTCCTGTGATTCGCCGCTGTGCGGATA GGACGCATGCATCAG - Trình tự gen SyrB2 chủng đột biến TGGCGGATGGCGCACGGCCAAAGTCCTGGCCGACCACATCTCCCGTAGCCTTGTTCAAGCCCATTGACCGAAA AGGAAAAGCTCATGAGCAAAAAATTCGCTTTAACTGCGGAACAGCGTGCCTCGTTCGAGAAAAACGGCTTTAT CGGTCCGTTTGACGCCTATTCGCCAGAAGAAATGAAGGAAACCTGGAAGCGCACCCGTCTGCGCCTGCTCGAC CGTAGCGCCGCCGCCTATCAGGACCTGGACGCCATTTCCGGGGGTACCAACATCGCCAACTATGACCGCCATC TGGACGATGACTTTCTGGCCAGCCACATCTGTCGCCCGGAAATCTGCGATCGCGTCGAAAGTATCCTCGGCCC TAATGTGCTGTGCTGGCGCACCGAGTTCTTTCCCAAGTATCCGGGCGATGAAGGCACCGACTGGCATCAGGCC GATACGTTCGCCAATGCCTCCGGCAAGCCGCAGATCATCTGGCCGGAAAACGAAGAGTTCGGCGGCACCATCA CCGTCTGGACGGCGTTCACCGACGCCAACATTGCCAATGGCTGCCTGCAGTTCATTCCTGGCACCCAGAACAG CATGAACTACGACGAAACCAAGCGCATGAGCTATGAGCCCGACGCCAACAACTCGGTGGTCAAGGACGGCGTG CGTCGCGGTTTCTTCGGTTACGACTATCGCCAGTTGCAGATCGATGAGAACTGGAAGCCCGACGAGGCCTCTG CTGTGCCCATGCAGATGAAAGCCGGGCAGTTCATCATTTTCTGGTCGACCCTGATGCATGCGTCCTATCCGCA CAGCGGCGAATCACAGGAGATGCGCATGGGCTTTGCGTCACGCTACGTACCGTCGTTCGTGCACATCTATCCG GATTCGGACCACATCGAAGAGTACGGCGGCCGCATCAGCCTGGAGAAATACGGTGCGGTGCAGGTGATCGGTG ACGAAACACCGGAATACAACCGCCTTGTGACTCACACCACACGCGGCAAGAAATTCGAAGCGGTCTGACCCAC ATACGTCAGACGACAGTAGATTGCGCGAGGCTACTGTCGTCTGACGTATGTGGGTCAGACCGCTTCGAATTTC TTGCCGCGTGTGGTGTGAGTCACAAGGCGGTTGTATTCCGGTGTTTCGTCACCGATCACCTGCACCGCACCGT ATTTCTCCAGGCTGATGCGGCCGCCGTACTCTTCGATGTGGTCCGAATCCGGATAGATGTGCACGAACGACGG TACGTAGCGTGACGCAAAGCCCATGCGCATCTCCTGTGATTCGCCGCTGTGCGGATAGGACGCATGCATCAGG GTCGACCA 44 4.3.2 So sánh trình tự gen SyrB2 kiểu dại, kiểu đột biến trình tự SyrB2 chuẩn NCBI Kết giải trình tự xử lý phần mềm Bioedit đem so sánh trình tự gen SyrB2 chủng dại đột biến với ngân hàng liệu NCBI Chúng thu mức độ tương đồng 96% hai chủng (phụ lục 2) Kết cho thấy có khác biệt gen SyrB2 chủng P.syringae kiểu dại kiểu đột biến phân lập Việt Nam chủng giới tương đối lớn Điều việc sống mơi trường điều kiện địa lý khác dẫn tới chủng phải có biến đổi bên vật chất di truyền để thích ứng với thay đổi điều kiện sống 4.3.3 So sánh trình tự gen SyrB2 chủng kiểu dại chủng đột biến Việc sử dụng ánh sáng tử ngoại gây đột biến gây đứt gãy bên nhiễm sắc thể vi khuẩn, điều tạo đột biến trình tự gen SyrB2 Sử dụng công cụ BLAST nucleotid NCBI, chúng tơi tiến hành so sánh trình tự nucleotid SyrB2 chủng P.syringae kiểu dại kiểu đột biến Kết so sánh cho thấy khơng có biến đổi xảy (phụ lục 3) 4.4 Kiểm tra biểu tƣơng đối gen SyrB2 mức độ gen kỹ thuật Real time PCR SR-E loại kháng sinh thực vật có phổ hoạt động rộng nhiều loài nấm Việc nghiên cứu đưa SR-E vào thực tiễn sản xuất việc làm cần thiết Bên cạnh việc nâng cao suất sinh tổng hợp SRE yêu cầu cấp thiết Bằng việc gây tạo đột biến cán Viện công nghệ sau thu hoạch tạo chủng P.syringae sản xuất SR-E cao so với chủng kiểu dại Nghiên cứu tìm chế liên quan sinh tổng hợp SR-E giúp cho việc điều khiển trình đáp ứng yêu cầu thực tiễn Mô ̣t vài nghiên cứu trước đó đã chỉ rằ ng SyrB có liên quan đến trình sinh tở ng hơ ̣p SR -E Câu hỏi đặt liệu quá trình tăng sinh tổ ng hơ ̣p SR -E 45 có liên quan đến tăng biểu SyrB hay không Để kiểm chứng tiến hành phản ứng real-time PCR phân tích biểu SyrB2 hai trạng thái trước sau gây đột biến Xác định biểu tương đối SyrB2 kỹ thuật realtime PCR Chu kỹ ngưỡng hay Ct( threshold cycle) chu kỳ nhiệt mà thời điểm thiết bị realtime ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang Bằng việc sử dụng phần mềm chuyên dụng, sau chạy phản ứng realtime PCR chúng tơi tính giá trị chu kỳ ngưỡng gen SyrB2 kiểu đột biến kiểu dại Áp dụng công thức Livak cho định lượng tương đối biểu gen sau: Ct( SyrB2-W)=20,29 Ct ( SyrB2-M)=20,55 Ct( Ref-M)=19,72 Ct(Ref-W)= 19,25 Trong Ref-W gen tham chiếu trạng thái trước chiếu tia UV gây đột biến (trạng thái 1) Ref-M gen tham chiếu trạng thái sau chiếu tia UV gây đột biến (trạng thái 2) Áp dụng công thức Livak sau: ∆1= Ct(SyrB2-W)- Ct(Ref-W)=1,04 ∆2=Ct(SyrB2-M)-Ct(Ref-M)=0,83 ∆= ∆2-∆1= 0,21 Coi hiệu PCR đạt 100%, sau chu kỳ số lượng DNA copy tăng gấp đôi (E=2) tỉ lệ biểu gen SyrB2 kiểu đột biến so với kiểu dại 2^∆= 2^0,21 ~1 Với kết này, mức độ phiên mã, gen SyrB2 kiểu đột biến không biểu mạnh so với kiểu dại Việc gây đột biến tia UV không làm ảnh hưởng tới mức độ biểu gen SyrB2 46 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã phân lập thành công gen SyrB2 phương pháp PCR - Tách dòng giải trình tự thành cơng gene SyrB2 chủng Pseudomonas syringae pv syringae, so sánh trình tự gen với trình tự gen SyrB2 công bố ngân hang gen NCBI - Bằng sử dụng kỹ thuật realtime PCR cho việc định lượng tương đối, kết luận gen SyrB2 khơng có tăng giảm biểu chủng Pseudomonas syringae pv syringae kiểu đột biến 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu mức độ ảnh hưởng gen SyrB2 tới trình sinh tổng hợp Syringomycin E Nghiên cứu đối tượng kiểu dại kiểu đột biến để tìm xem chủng đem lại hiệu tổng hợp Syringomycin cao 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt Th.S Lê Đình Quyền cs (2012), “Ngiên cứu sử dụng vi khuẩn Pseudomonas SP ĐA3.1 kiểm soát nấm hại trồng Rhizoctonia Fusarium”, NXB Viện sinh thái Tài nguyên sinh vậ, Tr 1- 58 II Tài liệu Tiếng Anh A.J De Lucca, T.J Jacks, J.Y Takemoto, B Vinyard, J Peter, E Navarro, T.J Walsh, “Fungal lethality, binding, and cytotoxicity of syr Akira Isogai, Jiro Nakayamaingomycin-E, Antimicrob”, Agents Chemother., (1999) p: 371–373 A.J De Lucca, T.J Walsh, “Antifungal peptides: novel therapeutic compoundsagainst emerging pathogens”, Antimicrob Agents Chemother (1999) p: 1–11 and et al, (1992) “ Structure and stereochemistry of three phytotoxins, syringomycin, syringotoxin and syringostatin, produced by Pseudomonas syringae pv syringae”, J Chem Soc., Perkin Trans 1, 1149-1157 Anzai, Y; Kim, H; Park, JY; Wakabayashi, H; Oyaizu, H (2000) “Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence” International journal of systematic and evolutionary microbiology 50 Pt 4: 1563–89 Blazevic DJ, Köpcke MH, Matsen JM (1973), “ Incidence and identification of Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas putida in the clinical laboratory” Microbiol, p 25: 107 Breidenstein EB, Fuente-Núñez C, Hancock RE (2011) Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance Trends Microbiol 19: 419–26 48 Carol L Bender1, Francisco Alarcón-Chaidez, and Dennis C Gross(1999), “Pseudomonas syringae Phytotoxins: Mode of Action, Regulation, and Biosynthesis by Peptide and Polyketide Synthetases”, Microbiology and molecular biology, June 1999, p 266–292 Cook RJ, Rovira AD (1976) , “The role of bacteria in the biological control of Gaeumannomyces graminis by suppressive soils” Soil Biol Biochem 8: 269- 273 10 Dirk Konz , Marahiel MA, (1999), “How peptide synthetases generate structural diversity?”, Chem Biol, R39-R48 11 Gitanjali M Singh , Fre ´ de ´ ric H Vaillancourt, Jun Yin, and Christopher T Walsh “Characterization of SyrC, an Aminoacyltransferase Shuttling Threonyl and Chlorothreonyl Residues in the Syringomycin Biosynthetic Assembly Line”.Chemistry & Biology, Pt: 1- 10 12 GJ, Jousset A, Bonkowski M, Thorpe MR, Scheu S, Lanoue A, Schurr U, Rose USR (2011), “ Pseudomonas fluorescens maintains carbon delivery to Fusarium graminearum-infected roots and prevents reduction in biomass of barley shoots through systemic interactions” J Exp Bot 62: 4337– 4344 13 H.T.H MUEDI, D FOURIE and N.W MCLAREN, (2011), “Characterisation of bacterial brown spot pathogen from dry bean production areas of South Africa”, African Crop Science Journal, Vol 19, No 4, pp 357 – 367 14 Handelsman J, Stabb EV (1996), “ Biocontrol of Soilborne Plant Pathogens” Plant Cell 8: 1855-1869 49 15 Howell CR, Stipanovic RD (1980), “ Suppression of Pythium ultimuminduced damping-off of cotton seedlings by Pseudomonas fluorescens and its antibioti, pyoluteorin” Phytopathology 70: 712-715 16 Jan-Hua Zhang and et al, (1995), ), “Analysis of the syrB and syrC genes of Pseudomonas syringae pv syringae indicates that syringomycin is synthesized by a thiotemplate mechanism”, Journal of bacteriology, p 4009-4020 17 Kommedahl T, Chang-Mew IP (1975), “ Biocontrol of corn root infection in the field by seed treatment with antagonists” Phytopathology 65: 296-300 18 Leah C Blasiak and et al, 2009, “First-principles study of non-heme Fe(II) halogenase SyrB2 reactivity”, J Am Chem Soc, p 1-22 19 Megan L Matthews et al, “Substrate-Triggered Formation and Remarkable Stability of the C-H Bond-Cleaving Chloroferryl Intermediate in the Aliphatic Halogenase, SyrB2”; Biochemistry 2009, 48, 4331–4343 20 N B., Y.-Y Mo, and D C Gross (1993) “SyrD is required for syringomycin production by Pseudomonas syringae pathovar syringae and is related to a family of ATP-binding secretion proteins” Mol Microbiol 9:787–801 21 Naoyuka Fukuchi and et al , (1992), “Structure and stereochemistry of three phytotoxins, syringomycin, syringotoxin and syringostatin, produced by Pseudomonas syringae pv syringae”, J Chem Soc., Perkin Trans 1, 1992, 1149-1157 22 Segre A, Bachman RC, Ballio A, et al (1989), “The structure of syringomycins A1, E, and G” FEBS Lett 255: 27-31 50 23 Sinden et al (1971), “Properties of syringomycin, a wide spectrum antibiotic and phytoxic produced by Pseudomonas syringae, and its role in the bacterial canker of peach trees”, Physiol, Plant Pathol, 1, 199-213 24 Stockwell VO, Stack JP, (2007), “Using Pseudomonas spp for Integrated Biological Control”, Phytopathology., p 244-249 25 Walker TS, Bais HP, Déziel E, Schweizer HP, Rahme LG, Fall R, Vivanco JM (2004), “ Pseudomonas aeruginosa-plant root interactions Pathogenicity, biofilm formation, and root exudation” Plant Physiol 134: 320-331 26 Weller DM (1988), “ Biological Control of Soilborne Plant Pathogens in the Rhizosphere with Bacteria” Annual Review of Phytopathology 26: 379-407 27 Yang ZJ, Wang W, Jin Y, Hu HB, Zhang XH, Xu YQ (2007), “ Isolation, identification, and degradation characteristics of phenazine-1-carboxylic acid-degrading strain Sphingomonas sp DP58” Curr Microbiol 55: 284-7 III Tài liệu tham khảo từ Internet 28 HTTP://EN.WIKIPEDIA.ORG/WIKI/PSEUDOMONAS_SYRINGAE 29 http://en.wikipedia.org/wiki/Syringomycin_E 30 Ngô Thanh Phong (2012), “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm pseudomonas spp bón cho lúa cao sản vùng đồng sông cửu long”, http://gs.ctu.edu.vn/tomtat_LATS/VSVH_NTPhong.pdf truy cập 18 tháng năm 2015] [Ngày PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết định danh loài phân tích 16S ARN Chủng kiểu dại: - Trình tự gen SyrB2 chủng kiểu dại TCACCGATGGTACCGTCCCCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTG TGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGC GATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTGTGAGATTAG CTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAA GGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTG CCCACCATAATGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCT CACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCCATCCATCT CTGGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATG CTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAG GCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAGAGCTCAAGGCTCCCAACGGCTAGTTGACATCG TTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCA GTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTAC ACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGCTTGCCAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGA GCCCGGGGATTTCACATTCAACTTAACAAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATT AACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGT AACGTCAAAACAATCACGTATTAGGTAACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGA AGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTG CTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGT TACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGAT AGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTCCGTTTCCG AGCGTTATCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGCCACCAGG TACAAGTACCCGTGCTGCCGCTCGACTTGCATGTGT Chủng đột biến: Phụ lục 2: So sánh trình tự gen SyrB2 kiểu dại, kiểu đột biến với trình tự SyrB2 chuẩn NCBI - Chủng kiểu dại - Chủng đột biến Phụ lục 3: So sánh trình tự gen SyrB2 hai chủng kiểu dại kiểu đột biến Range 1: to 1313GraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities 2344 bits(1269) 0.0 Query 1312/1329(99%) Gaps Strand 17/1329(1%) Plus/Plus GGCGGATGGCGCACGGCCAAAGTCCTGGCCGACCACATCTCCCGTAGCCTTGTTCAAGCC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct GGCGGATGGCGCACGGCCAAAGTCCTGGCCGACCACATCTCCCGTAGCCTTGTTCAAGCC 61 Query 61 CATTGACCGAAAAGGAAAAGCTCATGAGCAAAAAATTCGCTTTAACTGCGGAACAGCGTG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 62 Query 121 CATTGACCGAAAAGGAAAAGCTCATGAGCAAAAAATTCGCTTTAACTGCGGAACAGCGTG 121 CCTCGTTCGAGAAAAACGGCTTTATCGGTCCGTTTGACGCCTATTCGCCAGAAGAAATGA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 122 Query 181 CCTCGTTCGAGAAAAACGGCTTTATCGGTCCGTTTGACGCCTATTCGCCAGAAGAAATGA 181 AGGAAACCTGGAAGCGCACCCGTCTGCGCCTGCTCGACCGTAGCGCCGCCGCCTATCAGG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 182 AGGAAACCTGGAAGCGCACCCGTCTGCGCCTGCTCGACCGTAGCGCCGCCGCCTATCAGG 241 Query 241 ACCTGGACGCCATTTCCGGGGGTACCAACATCGCCAACTATGACCGCCATCTGGACGATG 300 Sbjct 242 ACCTGGACGCCATTTCCGGGGGTACCAACATCGCCAACTATGACCGCCATCTGGACGATG 301 Query 301 ACTTTCTGGCCAGCCACATCTGTCGCCCGGAAATCTGCGATCGCGTCGAAAGTATCCTCG 360 Sbjct 302 ACTTTCTGGCCAGCCACATCTGTCGCCCGGAAATCTGCGATCGCGTCGAAAGTATCCTCG 361 Query 361 GCCCTAATGTGCTGTGCTGGCGCACCGAGTTCTTTCCCAAGTATCCGGGCGATGAAGGCA 420 Sbjct 362 GCCCTAATGTGCTGTGCTGGCGCACCGAGTTCTTTCCCAAGTATCCGGGCGATGAAGGCA 421 Query 421 CCGACTGGCATCAGGCCGATACGTTCGCCAATGCCTCCGGCAAGCCGCAGATCATCTGGC 480 Sbjct 422 CCGACTGGCATCAGGCCGATACGTTCGCCAATGCCTCCGGCAAGCCGCAGATCATCTGGC 481 Query 481 CGGAAAACGAAGAGTTCGGCGGCACCATCACCGTCTGGACGGCGTTCACCGACGCCAACA 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 482 CGGAAAACGAAGAGTTCGGCGGCACCATCACCGTCTGGACGGCGTTCACCGACGCCAACA 541 Query 541 TTGCCAATGGCTGCCTGCAGTTCATTCCTGGCACCCAGAACAGCATGAACTACGACGAAA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 542 TTGCCAATGGCTGCCTGCAGTTCATTCCTGGCACCCAGAACAGCATGAACTACGACGAAA 601 Query 601 CCAAGCGCATGAGCTATGAGCCCGACGCCAACAACTCGGTGGTCAAGGACGGCGTGCGTC 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 602 CCAAGCGCATGAGCTATGAGCCCGACGCCAACAACTCGGTGGTCAAGGACGGCGTGCGTC 661 Query 661 GCGGTTTCTTCGGTTACGACTATCGCCAGTTGCAGATCGATGAGAACTGGAAGCCCGACG 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 662 GCGGTTTCTTCGGTTACGACTATCGCCAGTTGCAGATCGATGAGAACTGGAAGCCCGACG 721 Query 721 AGGCCTCTGCTGTGCCCATGCAGATGAAAGCCGGGCAGTTCATCATTTTCTGGTCGACCC 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 722 AGGCCTCTGCTGTGCCCATGCAGATGAAAGCCGGGCAGTTCATCATTTTCTGGTCGACCC 781 Query 781 TGATGCATGCGTCCTATCCGCACAGCGGCGAATCACAGGAGATGCGCATGGGCTTTGCGT 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 782 TGATGCATGCGTCCTATCCGCACAGCGGCGAATCACAGGAGATGCGCATGGGCTTTGCGT 841 Query 841 CACGCTACGTACCGTCGTTCGTGCACATCTATCCGGATTCGGACCACATCGAAGAGTACG 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 842 CACGCTACGTACCGTCGTTCGTGCACATCTATCCGGATTCGGACCACATCGAAGAGTACG 901 Query 901 GCGGCCGCATCAGCCTGGAGAAATACGGTGCGGTGCAGGTGATCGGTGACGAAACACCGG 960 Sbjct 902 GCGGCCGCATCAGCCTGGAGAAATACGGTGCGGTGCAGGTGATCGGTGACGAAACACCGG 961 Query 961 AATACAACCGCCTTGTGACTCACACCACACGCGGCAAGAAATTCGAAGCGGTCTGACCCA 1020 Sbjct 962 AATACAACCGCCTTGTGACTCACACCACACGCGGCAAGAAATTCGAAGCGGTCTGACCCA 1021 Query 1021 CATACGTCAGACGACAGTAGCCTCGCGCAATGGGCCTGTTGCGCGAGGCTACTGTCGTCT 1080 Sbjct 1022 CATACGTCAGACGACAGTAG A -TTGCGCGAGGCTACTGTCGTCT 1064 Query 1081 GACGTATGTGGGTCAGACCGCTTCGAATTTCTTGCCGCGTGTGGTGTGAGTCACAAGGCG 1140 Sbjct 1065 GACGTATGTGGGTCAGACCGCTTCGAATTTCTTGCCGCGTGTGGTGTGAGTCACAAGGCG 1124 Query 1141 GTTGTATTCCGGTGTTTCGTCACCGATCACCTGCACCGCACCGTATTTCTCCAGGCTGAT 1200 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| | |||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1125 GTTGTATTCCGGTGTTTCGTCACCGATCACCTGCACCGCACCGTATTTCTCCAGGCTGAT 1184 Query 1201 GCGGCCGCCGTACTCTTCGATGTGGTCCGAATCCGGATAGATGTGCACGAACGACGGTAC 1260 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1185 GCGGCCGCCGTACTCTTCGATGTGGTCCGAATCCGGATAGATGTGCACGAACGACGGTAC 1244 Query 1261 GTAGCGTGACGCAAAGCCCATGCGCATCTCCTGTGATTCGCCGCTGTGCGGATAGGACGC 1320 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1245 GTAGCGTGACGCAAAGCCCATGCGCATCTCCTGTGATTCGCCGCTGTGCGGATAGGACGC Query 1321 ATGCATCAG 1329 ||||||||| Sbjct 1305 ATGCATCAG 1313 1304