Nghiên cứu phân lập gene syrb 2 ừ chủng vi khuẩn pseudomonas syringae pv syringae sinh tổng hợp syringomycin cao

Nghiên cứu trong ống nghiệm về cơ chế kháng nấm và các hoạt động diệt nấm của ba lipodepsinonapeptides syringomycin E, syringotoxin B, và syringostatin A cho thấy, cả ba hợp chất có khả

- -

ĐINH THỊ HUỆ

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GENE SYRB2 TỪ CHỦNG VI KHUẨN

PSEUDOMONAS SYRINGAE PV SYRINGAE SINH TỔNG HỢP

SYRINGOMYCIN CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2011 - 2015

Thái Nguyên - 2015

- -

ĐINH THỊ HUỆ

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GENE SYRB2 TỪ CHỦNG VI KHUẨN

PSEUDOMONAS SYRINGAE PV SYRINGAE SINH TỔNG HỢP

SYRINGOMYCIN CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Giảng viên hướng dẫn : 1 TS Đồng Văn Quyền

2 ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH- CNTP, Trường Đại học Nông Lâm

Thái Nguyên - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ rất tận tình của thầy cô và bạn bè và gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn:

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đồng Văn Quyền Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện khoa học Việt Nam, ThS Bùi Đình Lãm giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, anh Nguyễn Hải Triều, chị Mai Thùy Linh cán bộ phòng Vi sinh phân tử, Viện Công nghệ Sinh học, Viện khoa học Việt Nam người đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện để tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện khoa học Việt Nam, các cán bộ, anh chị làm việc tại Bộ môn Vi sinh vật học Phân tử đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 6 năm 2015

Sinh viên

Đinh Thị Huệ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Độc tố thực vật sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas spp 6

Bảng 3.1 Thành phần môi trường LB (cho 1 lít môi trường) 23

Bảng 3.2 Thành phần môi trường King’s B nuôi cấy vi khuẩn Pseudomonas syringae pv syringae 23

Bảng 3.3 Thành phần các dung dịch dùng trong tách chiết DNA plasmid 24 Bảng 3.4 Thành phần dung dịch dùng trong điện di DNA 24

Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR gene SyrB2 27

Bảng 3.6: Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng 29

Bảng 3.7: Các thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn 31

Bảng 3.8: Các thành phần của hỗn hợp chất phản ứng A 32

Bảng 3.9: Các thành phần của hỗn hợp chất phản ứng B 33

Bảng 3.10: Thành phần các chất tham gia phản ứng real-time PCR 34

Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng real-time PCR 35

Bảng 4.1: Kết quả đo nồng độ DNA tổng số từ chủng P.syringae kiểu dại và đột biến 38

Bảng 4.2: Kết quả xác định tỉ lệ A260/A280 và nồng độ ARN(ng/μl) của chủng P.syringae pv syringae kiểu dại và kiểu đột biến 38

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Pseudomonas dưới kính hiển vi điện tử [16] 3

Hình 2.2 Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp trên đĩa thạch (A) và hình thái tế bào (B) [1] 4

Hình 2.3 Cấu trúc Syringomycin E [29] 7

Hình 2.4: Cơ chế sinh tổng hợp peptide nonribosomal [10] 9

Hình 2.5 Hoạt động của SyrB2 trong sinh tổng hợp syringomycin 15

Hình 2.6 Vector tách dòng pGEM-T Easy 20

Hình 4.1: DNA tổng số chủng Pseudomonas syringae pv syringae 37

Hình 4.2: Điện di sản phẩm PCR gen SyrB2 ở chủng PS kiểu dại và đột biến 39

Hình 4.3: Đĩa petri chứa khuẩn lạc sau khi biến nạp 40

Hình 4.4: Kết quả tách chiết DNA plasmid từ khuẩn lạc xanh và trắng 41

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Amp Ampicillin

Bp Base pair – cặp base nito

PDA Potato Dextro Agar

BLAST Basic Local Aligenment Search Tool

DNA Deoxyribonucleic axit

dNTP Deoxynucleotide Triphotphate

E coli Escherichia coli

Et al; cs Cộng sự

IPTG Isopropyl Thiogalactoside

Kb Kilo base –kilo base nito

LB Lauria Broth

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi

trùng hợp SR-E Syringomycin E

TAE Tris- acetate- EDTA

X –gal 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside

MỤC LỤC

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 2

Phần 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv syringae 3

2.1.1 Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv syringae 3

2.1.2 Khả năng gây bệnh chung của P syringae 5

2.1.3 Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm 6

2.2 Khái quát về Syringomycin E 7

2.2.1 Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE 7

2.2.2 Cơ chế diệt vi sinh vật của Syringomycin E 10

2.2.3 Phổ hoạt động của Syringomycin E 11

2.3 Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trong và ngoài nước 12

2.3.1 Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trên thế giới 12

2.3.2 Tình hình nghiên cứu Syringomycin E ở Việt Nam 14

2.4 Chức năng của protein SyrB2 15

2.5 Phương pháp PCR, realtime PCR 16

2.5.1 Phương pháp PCR 16

2.5.2 Real-time PCR 18

2.6 Vector tách dòng pGEM-T Easy 19

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc 22

3.1.1 Chủng vi khuẩn 22

3.1.2 Thiết bị, máy móc 22

3.1.3 Hóa chất và sinh phẩm 22

3.1.4 Môi trường và dung dịch 23

3.2 Địa điểm và thời gian thực tập 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi khuẩn 25

3.4.2 Phương pháp PCR 26

3.4.3 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 27

3.4.4 Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy 28

3.4.5 Biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α 29

3.4.6.Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 30

3.4.7 Cắt kiểm tra pGEM-T Easy -SyrB2 với EcoRI 31

3.4.8 Kỹ thuật tách ARN từ vi khuẩn 31

3.4.9 Phương pháp chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên 32

3.4.10 Kỹ thuật Real-time PCR 33

3.4.11 Tinh sạch sản phẩm PCR 35

3.4.12 Giải trình tự gene 36

Phần 4: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƢỢC VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Tách chiết DNA, RNA tổng số vi khuẩn Pseudomonas syrringae PS120 37

4.2 Tạo dòng gen SyrB2 38

4.2.1 Khuếch đại gen SyrB2 của chủng vi khuẩn P syringae PS 120 bằng cặp mồi đặc hiệu 38

4.2.2 Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy 39

4.2.3 Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E coli 40

4.2.4 Kiểm tra kết quả tạo dòng 41

4.3 Kết quả giải trình tự và phân tích gen Syrb2 43

4.3.1 Kết quả giải trình tự gen 43

4.3.2 So sánh trình tự gen SyrB2 kiểu dại, kiểu đột biến và trình tự SyrB2 chuẩn trên NCBI 44

4.3.3 So sánh trình tự gen SyrB2 giữa chủng kiểu dại và chủng đột biến 44

4.4 Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của gen SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật Real time PCR 44

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Hằng năm trên thế giới, bệnh cây gây ra những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp Chúng phá hủy 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp trên thế giới Trong các loại bệnh

thì bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83%, trong đó bệnh do nấm Fusarium

và Rhizocronia gây ra với tỷ lệ lớn Chúng gây bệnh trên nhiều loại rau quả

và cây lương thực như lạc, cà chua, khoai tây, cà phê,tiêu Biện pháp phòng trừ các bệnh hại cây trồng phổ biến nhất cho đến nay vẫn là sử dụng các loại thuốc hóa học Mặc dù có ưu điểm là phổ tác dụng rộng, hiệu quả và tác dụng nhanh, nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như hiệu quả phòng trừ thấp đối với các loại nấm bệnh trong đất, nhanh bị ức chế bởi nấm bệnh sau một thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người

Hơn nữa, ngày càng gia tăng bệnh nhiễm nấm, ít các loại thuốc kháng nấm có sẵn, và các loài nấm ngày càng kháng với thuốc chống nấm có sẵn,

đã dẫn đến việc mở rộng việc tìm kiếm chế phẩm sinh học chống nấm mới

Chủng Pseudomonas syringae pv syringae sản xuất lipodepsinonapeptides

với hoạt tính kháng nấm Nghiên cứu trong ống nghiệm về cơ chế kháng nấm

và các hoạt động diệt nấm của ba lipodepsinonapeptides (syringomycin E, syringotoxin B, và syringostatin A) cho thấy, cả ba hợp chất có khả năng chống nấm phổ rộng và có hoạt tính diệt hầu hết các loài nấm thử nghiệm Syringomycin E (C53 H85CLN14O17) là một trong những hợp chất quan trọng nhất được nghiên cứu Syringomycin B2 là một enzyme quan trọng liên quan chặt chẽ trong quá trình tiết ra Syringomycin E, một hoạt chất có phổ kháng

khuẩn và nấm rộng được sản sinh bởi Pseudomonas syringae pv.Syringae

Việc nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm của SyrB2 là cần thiết Xuất phát từ

thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu phân lập gene SyrB 2

từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv syringae sinh tổng hợp Syringomycin cao”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tách dòng và giải trình tự gen SyrB2, tìm kiếm đột biến trên SyrB2 ở

mức độ gen và protein

- Tách ARN tổng số và chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên

- Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật RT- realtime PCR

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã được học và tham gia nghiên cứu khoa học, cách xử lí và phân tích số liệu, cách trình bày một báo cáo khoa học Quan trọng hơn là việc phân lập và tách dòng thành

công gen syrB2 là cơ sở cho các nghiên cứu tổng quát có liên quan về sản

xuất Syringomycin sau này

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

Sản phẩm của quá trình tách dòng gen syrB2 sẽ cung cấp vật liệu và là

cơ sở cho các nghiên cứu nhằm đưa các gene mã hóa cho các enzyme tổng hợp syringomycin vào vi sinh vật, tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sản xuất syringomycin cao đáp ứng nhu cầu thị trường và hạ mức giá thành của sản phẩm

Phần 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv syringae

2.1.1 Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv syringae

Căn cứ vào đặc điểm hình thái và sự phân bố địa lý Pseudomonas

Syringae pv syringae được phân loại thuộc[28]:

Ngành (Phylum): Proteobacteria

Lớp (Class): Gamma Proteobacteria

Bộ (Order): Pseudomonadales

Họ (Family): Pseudomonadaceae

Chi (Genus): Pseudomonas

Loài (Species): P syringae

Hình 2.1: Pseudomonas dưới kính hiển vi điện tử [16]

Pseudomonas syringae pv.syringae là một thành viên của chi

Pseudomonas, và dựa trên phân tích 16S rRNA, nó được đặt trong nhóm P.syringae [28] Nó được đặt tên theo tên của cây Tử đinh hương (Sơn mai

hoa), chúng được phân lập đầu tiên từ cây này [28] Đặc điểm hình thái học

chung cho chi Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động

nhờ roi ở đầu và không có bào tử Có kích thước 0,5-1 x 1,5-5 μm, có khả năng chuyển động bằng một hay nhiều tiêm mao Tính chất nuôi cấy:

Pseudomonas mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu

khí Nhiệt độ thích hợp 37°C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5o

C - 42°C, pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0 [5]

Hình 2.2 Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp trên đĩa thạch (A)

và hình thái tế bào (B) [1]

Trên môi trường đặc có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: 1 loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi Có xu hướng mọc lan (Hình 2.2A) , 1 loại xù xì bờ không đều, đôi khí có loại khuẩn lạc nhầy Trên môi trường thạch máu đa số gây tan máu Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai [6]

Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng ở trên Pseudomonas mọc

được ở trên môi trường SS (shigella salmonella), đây là đặc điểm để phân biệt

với trực khuẩn Whitmore Tính chất đặc trưng của Pseudomonas là sinh sắc tố

và chất thơm Có hai loại sắc tố chính pyocyanin: có màu xanh lá cây, tan trong nước và chloroform, khuếch tán ra môi trường làm môi trường có màu xanh Pyoverdin: là loại sắc tố huỳnh quang, tan trong nước nhưng không tan trong chloroform, phát màu xanh khi chiếu tia cực tím [1] Sắc tố này không bền vững dễ mất đi trong điều kiện nuôi cấy không tốt Sắc tố của

Pseudomonas dưới ảnh hưởng của các nguyên tố hóa học có thể thay đổi

thành màu nâu, đen Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi

trường Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các

động vật Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu

có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học [7,25]

2.1.2 Khả năng gây bệnh chung của P syringae

P syringae được chứng minh gây ra một loạt các triệu chứng trên thực

vật, bao gồm cả cháy lá, đốm lá, lá sần sùi Loài này được chia thành nhiều biến thể gây bệnh (pathovars), trên nhiều cây chủ khác nhau Khi

Pseudomonas xâm nhập vào mô thực vật, chúng tương tác tạo triệu chứng

ngậm nước, sau đó là quá trình tăng sinh và phát triển các triệu chứng nâng cao hơn Trong khi đó, các tế bào cây chủ phản ứng lại sự xâm nhập của vi khuẩn bằng cơ chế hoại tử sau 12-24 giờ [8] Nhóm gen HRP là cần thiết cho

khả năng gây bệnh của Pseudomonas syringae pv.syringae vì chúng mã hóa

cho sự điều hòa và hình thành con đường tiết độc tố ở thực vật Chúng được

bảo tồn trong các chủng Pseudomonas syringae pv syringae gây bệnh trên thực vật Ngoài ra, Pseudomonas syringae pv syringare cũng sản sinh ra

nhiều tác nhân gây độc khác như các polysaccharide ngoại bào, các độc tố thực vật, các enzyme phá hủy màng tế bào và các phytohormone [8] Dựa trên

phân tích 16sRNA, Pseudomonas syringae pv syringae được đặt trong loài

Pseudomonas syringae pv syringae , là một trong các tác nhân gây bệnh quan

trọng ở hơn 180 loài thực vật trên toàn thế giới, đặc biệt, chúng gây bệnh đốm nâu ở đậu với thiệt hại năng suất lên đến 55% ở Nam Phi [13]

Bảng 2.1: Độc tố thực vật sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas spp

Coronatine

P.syringae pv atropurpurea, glycinea,maculicola,

Fuscopeptin P fuscovaginae Lipodepsipeptide

Persicomycins P syringae pv persicae Chất béo

Phaseolotoxin P.syringae pv actinidiae,

phaseolicola

Sulfodiaminophosphinyl peptide

Rhizobitoxine P andropogonis Vinylglycine

Syringomycins P syringae pv syringae, aptata,

atrofaciens

Lipodepsinonapeptide

Syringopeptins P syringae pv syringae Lipodepsipeptide

Tabtoxin P.syringae pv tabaci,

coronafaciens, garcae

β-Lactam

Viscosin P marginalis ( P fluorescens ) Lipodepsipeptide

2.1.3 Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho rằng các chủng vi khuẩn

Pseudomonas sp đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế các bệnh cây

trồng [9, 15, 17] Hiệu quả của một vi sinh vật kiểm soát sinh học trong nhà kính và trên đồng ruộng phụ thuộc vào sự sinh tổng hợp một hay nhiều chất

đối ức chế sinh trưởng nấm [14] Các chủng Pseudomonas sinh tổng hợp nhiều loại ức chế sinh khác nhau như phenazine [26, 27, ] Henkes và cộng

sự công bố chủng P fluorescens có khả năng ức chế hiệu quả với F

graminearum gây bệnh trên cây lúa mạch [1] Năm 2012, Seema và cộng sự

công bố chủng P.aeriginosa SD12 có khả năng sinh tổng hợp 1 hydrophenazine ức chế mạnh với nấm R solani [1] Chủng P syringae sinh

tổng hợp syringomycin, syringostatin và syringotoxin, có các đặc tính chống nấm tiềm năng Syringomycin-E (SRE) là peptide phổ biến nhất SRE diệt

nấm A.flavus, A fumigatus, A niger, F moniliforme và F oxysporum [3; 22]

2.2 Khái quát về Syringomycin E

2.2.1 Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE

Các syringomycin (SR) gồm A1, E và G, trong đó syringomycin E E) là nhóm chính và được nghiên cứu nhiều nhất [22] SR-E là một peptide tuần hoàn không phải ribosom [11] SR-E có khối lượng phân tử là 1240 kDa

(SR-SR-E được tạo ra do sự trao đổi chất thứ cấp của vi khuẩn P syringae pv

syringae Cấu trúc của SR-E gồm một axit béo mạch dài không phân nhánh và chín axid amin khép vòng, ưa nước, tích điện dương Trình tự axit amin của SR-E là Ser-Ser-Dab-Dab-Arg-Phe-Dhb-4(Cl)Thr-3(OH)Asp, được khép vòng tại nhóm β-carboxy của đầu cùng C và nhóm OH của đầu cùng N nhờ quá trình acetyl hóa được xúc tác bởi axit 3-hydroxydodecanoic[4; 21,] Công thức cấu tạo của SR-E (Hình 2.3) :

Hình 2.3 Cấu trúc Syringomycin E [29]

Syringomycin E(SR-E) tan trong nước và tan trong cồn nồng độ thấp, không tan trong ether và chloroform Điểm đẳng điện ở pH 7 [23] Hoạt tính kháng sinh của SR-E không bền trong dung dịch kiềm, đặc biệt tại pH 8 và bền trong 1N HCl, bền ở nhiệt độ cao, không bị ảnh hưởng bởi tia cực tím SR-E có hoạt tính kháng nhiều loại nấm mốc và nấm men Khả năng kháng nấm men của SR-E tốt hơn nấm mốc Tuy nhiên, chúng không có khả năng

D (syrD) và quá trình điều hòa phụ thuộc vào syringomycin P (syrP) [16]

Đặc điểm nổi bật nhất của cụm gen Syr đó chính là sự xuất hiện của một

khung đọc mở cực kì lớn (28.4kb) của gen SR-E Phân tích trình tự axid amin

đã chỉ ra rằng SR-E mã hóa cho một chuỗi peptide với khối lượng phân tử lên đến 1,039kDa với tám acid amin cấu thành Do đó, SR-E được ghi nhận như

là một protein lớn nhất cho tới thời điểm hiện tại mà prokaryote tạo ra [16]

Sự sinh tổng hợp SR-E theo cơ chế thiotemplate hay cơ chế sinh tổng hợp peptide nonribosomal [20]

Hình 2.4: Cơ chế sinh tổng hợp peptide nonribosomal [10]

Trong quá trình này, có hai vùng trình tự quan trọng đó là Adenylation domain và T domain Vùng A domain thường có chiều dài khoảng 550 acid amin, vùng A domain này xúc tác một vùng nhận biết cụ thể và hoạt hóa một acid carboxyl giống như acyl adenylate bằng sự thủy phân ATP, tạo phức hệ aminoacyl adenylate [8] Đồng thời với quá trình đó, ở vị trí T domain (T domain có thể coi là PCP-peptide carrier protein – là vùng mà 4’-PP cofactor bám vào), thì xúc tác 4’-PP-tranferase làm cho các nhóm hydroxyl của serine

liên kết với cầu pyrophosphate của CoA, dẫn đến việc chuyển giao 4’-PP cofactor vào T domain và giải phóng 3’-5’- ADP (T domain chứa trình tự lõi

là serine) Phức hệ đó kết hợp với aminoacyl adenylate để tạo ra thioester- bound acid amin và giải phóng AMP Các thioester- bound acid amin liên kết

và trao đổi với nhau hình thành nên chuỗi axit amin [8]

2.2.2 Cơ chế diệt vi sinh vật của Syringomycin E

Các nghiên cứu gần đây tập trung nhiều vào cơ chế kháng nấm của các lipodepsinonapeptide mạch vòng nhỏ Cấu trúc phân cức của SR-E thúc đẩy

sự tương tác với màng nguyên sinh chất SR-E làm tăng sự thu nhận tetraphenylphosphonium nên dẫn đến tăng điện thế màng [8] Điều này gây nhiều biến đổi như mất K+

và thêm H+ dẫn đến tế bào bị chết Các nghiên cứu khác chỉ ra rằng SR-E làm thay đổi pH gradient màng nguyên sinh chất do mất

K+ và thêm H+ Cùng với sự trao đổi K+

và H+, SR-E cũng kích thích sự thâm nhập của Ca2+ Trong những năm gần đây, các nghiên cứu tập trung vào mô tả tính chất và sự hình thành kênh của SR-E bằng màng lipit nhân tạo [8] Kết quả nghiên cứu cho thấy SR-E tạo nên kênh phụ thuộc vào điện thế trong màng hai lớp nhân tạo SR-E tạo nên các lỗ dò (bán kính 1 nm) không đặc hiệu mà cation hóa trị 1 và 2 đều thấm qua được Nhờ cấu trúc lưỡng cực với một đầu acid amin

ưa nước và một đuôi acid béo kị nước nên SR-E có thể dễ dàng chèn vào màng lipid của tế bào chủ và hình thành kênh của riêng nó [8] Từ các phân tích lý sinh học về sự hình thành các kênh trên lớp màng kép lipid, một bức tranh về sự hình thành cũng như chức năng của các kênh syringomycin dần được sáng tỏ Ngay sau khi chèn vào lớp màng lipid, các monomer là các đơn phân tử SR-E tập hợp lại hình thành lỗ xuyên qua lớp màng Căn cứ vào điện áp của kênh ion, Feigin

và các cộng sự đã kết luận rằng các kênh được hình thành bởi ít nhất sáu phân tử SR-E [8] Các kênh này cho thấm tự do các cation như K+, H+, Ca2+ Hậu quả dễ thấy nhất của sự hình thành kênh SR-E đó là sự vận chuyển nhanh chóng của các

ion Ca2+ sẽ làm kích hoạt một chuỗi các sự kiện liên quan đến tín hiệu của tế bào

ở thực vật [8]

2.2.3 Phổ hoạt động của Syringomycin E

Nấm là các mầm bệnh rất quan trọng trong y học mà hiện đang tăng dần tính kháng với các chiến lược kiểm soát nấm hiện tại Điều đó đã thúc đẩy việc tăng các nỗ lực nhằm tìm kiếm các chất kháng sinh mới Các peptide từ nhiều loài nấm mốc, vi khuẩn khác nhau được đầu tư nghiên cứu [2] Và Syringomycin nổi lên như một lớp peptide mới có khả năng kháng nấm mạnh Qua các thí nghiệm in vitro, Syringomycin E là độc tố có phổ hoạt động mạnh, nó tiêu diệt được nhiều loài nấm bệnh khác nhau như: SR-E được

sử dụng để tiêu diệt Asperigillus fumigatus, Mucor sp (nấm mốc gây bệnh trên người), Trichophyton sp (nấm kí sinh ở da)[3] Ngoài ra, SRE cũng cho

thấy tiềm năng ứng dụng trong việc bảo quản nông sản khỏi một số loại nấm

gây hại như nấm P.digitatum gây thối hỏng vải thiều, nấm mốc Aspergillus,

Rhizopus, Fusarium, và vi khuẩn Ervinia carotonova gây bệnh trên

cam,vải,xoài và thanh long SRE diệt nấm A flavus, A fumigatus, A niger,

F moniliforme và F oxysporum, có giá trị LD95 là 7,8 μg/ml đối với A

flavus và các giá trị LD95 với 1,9 μg/ml đối với các chủng nấm khác [2; 22] Độc tính của SRE đối với tế bào HeLa (dòng tế bào nghiên cứu ở người) thường gấp 20 lần nồng độ SRE để diệt 95% các nấm gây bệnh SRE có khả

năng diệt bào tử nấm đã nảy mầm của Aspergillus sp và Fusarium sp Hiệu

quả hơn các peptide khác như cecropin A, cecropin B và dermaseptin Kết quả thử độc tính trên chuột và độc tính với tế bào đã chỉ ra rằng SRE có tiềm năng phát triển thành sản phẩm thương mại [2]

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh SRE có hoạt tính kháng nhiều loại

nấm sợi và nấm men gây bệnh trên thực vật như Candida, Cryptococcus,

Geotrichum candidum, Rhodotorula pilimance, Botrytis cinerea, Fusarium,

Pythium ultimum, Rhizoctonia, Greeneria uvicola , Aspergillus japonicus, Mucor sp., Trichophyton sp., Curvularia brachyspora, Nigrospora sphaerica, Penicillium thomii và Penicillium sclerotiorum [2] Tuy nhiên SRE không ức

chế được vi khuẩn Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng khả năng kháng nấm men của SRE tốt hơn nấm mốc SRE không gây độc với tế bào động vật và không gây bệnh trên thực vật [2]

2.3 Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trong và ngoài nước

2.3.1 Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trên thế giới

Mỗi năm, bệnh nấm gây thiệt hại mùa màng trên thế giới đã lên đến hàng trăm triệu dollar mặc dù đã sử dụng thuốc trừ sâu [1] Những vấn đề về môi trường và sự phát triển ức chế thuốc ở các nấm bệnh đã làm giảm hiệu quả của các loại thuốc diệt nấm Do vậy các chất ức chế nấm do các vi sinh vật đất sản sinh ra là một nguồn thuốc sinh học mới, an toàn đầy tiềm năng Do những nguyên nhân này và các nguyên nhân khác mà người ta quan tâm đặc biệt tới kiểm soát sinh học (nghĩa là sử dụng các vi sinh vật tự nhiên hoặc các sản phẩm của chúng để hạn chế sự tấn công và gây hại bởi các mầm bệnh thực vật) [1] Vào thế kỷ 20, một số thuốc trừ sâu, dựa trên các phân tử biocidal, là công cụ chủ yếu để tăng sản lượng và chất lượng thực phẩm và sản phẩm sợi Do các vấn đề về sức khỏe và môi trường nên việc sử dụng nhiều hợp chất hóa học đã gây ra tranh cãi và cần khẩn cấp các chất thay thế chúng Ngoài việc tự ức chế bệnh của cây ngũ cốc, chủ yếu là các biện pháp kiểm soát sinh học khác dựa vào toàn bộ cơ thể ức chế sâu bọ tự nhiên Một

số cách tiếp cận khác về hoạt chất sinh học được thử nghiệm và số chế phẩm thương mại tăng lên [1] Ứng dụng của chế phẩm sinh học vẫn còn rất hạn chế, cần phải có nhiều các nghiên cứu hơn nữa để đưa việc sử dụng chúng trở nên phổ biến hơn Hiện nay chúng chưa thể so sánh được với các loại thuốc

có bản chất hóa học, do tính hiệu quả, thị trường và các yếu tố khác, tuy nhiên, do tiềm năng lớn chúng vẫn hứa hẹn có một tương lai rộng mở hơn [1] Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn

Pseudomonas sp đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các peptide hạn

chế các bệnh cây trồng [1] Theo công bố của Makarand và cộng sự cho thấy

chủng P aeruginosa sinh tổng hợp phenazine-1-cacboxylic acid có khả năng

ức chế nấm A niger NCIM 1025, F oxysporum NCIM 1008, S rolfsii NCIM

1084, C.falcatum NCIM Có giá trị MIC với nấm S rolfsii NCIM 1084 ở nồng độ 29 μg/ml Ở nồng độ 50μg/ml ức chế nấm F oxysporum NCIM

1008 đạt 95% [1] Syringomycin được sản xuất bởi Pseudomonas syringae

pv syringae, là một peptide kháng nấm mới được tìm thấy Nó là những lipodepsinonapeptides, trong đó Syringomycin E (SRE) là nhóm được quan tâm nghiên cứu [2] Theo De Lucca và cs (1999) SR-E có thể ngăn ngừa các

loại nấm: Aspergillus fumigatus , Mucor sp, và Trichophyton sp [2] SR-E

hành động chịu ảnh hưởng của sterol và có thể liên quan đến việc hình thành

các kênh ion vận chuyển Aspergillosis và fusariosis là nấm gây suy giảm

miễn dịch đe dọa tính mạng cho vật chủ [2] Do đó, De Lucca và cs đã nghiên cứu khả năng gây chết nấm của SR-E Họ đã tìm hiểu sự tương tác lý hóa giữa SR-E và thành tường nấm, cũng như khả năng gây độc của SR-E cho các

tế bào HeLa [2] Họ đã làm thử nghiệm invitro để xác định khả năng diệt nấm

của SR-E như sau: Nâm Lethality được nuôi trên môi trường thạch nghiêng

khoai tây, nuôi trong 7 ngày ở 300C Bào tử đích được thu hoạch trong 1% dextrose PDA Dịch huyền phù bào tử nấm (104 bào tử/ml) được ủ trong 8 giờ ở 300C để có được bào tử nảy mầm Tỷ lệ bào tử nảy mầm sẽ được quan sát thấy sớm hơn Các mẫu đối chứng gồm 45ml bào tử cộng với 405ml môi trường thạch khoai tây 1% (PDA) Kiểm tra mẫu bao gồm 45ml bào tử và thể tích thích hợp của stock SR-E và PDA 1% để cho nồng độ peptide mong

muốn từ 0.05-6.4 mM, trong một thể tích 450ml SR-E được tinh chế đồng nhất dựa trên hiệu suất cao của phương pháp sắc ký lỏng và nguyên tử bắn phá nhanh chóng khi phân tích quang phổ [2] Qua một số thí nghiệm, SR-E

đã được chứng minh gây chết nấm đáng kể Gần như tất cả các bào tử nảy

mầm của A niger và A fumigates đã bị chết ở nồng độ SR-E 1.9 mg/ml Số

lượng CFU đã giảm 95% đạt 7.8 mg mỗi ml SR-E cho các bào tử nảy mầm

của A.flavus [2]

Chế phẩm nấm đối kháng P syringae ESC-10 với tên thương mại là

BioSave® -10LP đã được Tổ chức Bảo vệ môi trường của Mỹ chứng nhận

và cho phép sử dụng để kiểm soát một số loại bệnh sau thu hoạch như bệnh mốc xanh, mốc xám, bệnh bạc vảy trên cam, quýt, các loại quả hạch và

khoai tây [24] Khả năng sinh SR-E của chủng P syringae van Hall chủng

ESC-10 và ESC-11 đã được nghiên cứu Cả 2 chủng đều có khả năng sinh tổng hợp SR-E [24]

2.3.2 Tình hình nghiên cứu Syringomycin E ở Việt Nam

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về Syringomycin E còn rất hạn chế, chưa có công trình nghiên cứu nào về Syringomycin được công bố Tuy nhiên việc nghiên cứu biện pháp sinh học phòng chống nấm bệnh cây đã được quan tâm

và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu trong nước trong những năm vừa qua như ở Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh học nhiệt đới (Viện KH&CNVN), Viện Bảo vệ thực vật (Bộ NN&PTNT), Viện Thổ nhưỡng và Nông hóa (Bộ NN&PTNT), Đại học Nông Lâm Tp HCM, Đại học Cần Thơ [1] Các công bố cho thấy, các nhóm vi sinh vật như Trichoderma (Trần Thị Thuần, 1997; Đào Kiều Dung, 1999; Nguyễn Kim Vân, 2003; Trần Thị Thuần, 2004), Bacillus (Nguyễn Ngọc Dũng, 2005; Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Minh Anh, 2007; Trần Phương Thảo., 2007), Pseudomonas (Nguyễn Minh Anh, 2003; Nguyễn Ngọc Dũng, 2003; Nguyễn Thị Tuyết Nhung,

2004; Nguyễn Thị Tuyết Nhung, 2006) và Serratia (Lê Thị Hồng Minh ,2005)

đã được phân lập, tuyển chọn và được đánh giá là những tác nhân tiềm tàng cho phát triển các chế phẩm sinh học để phòng chống nấm bệnh cây [1] Việc nghiên cứu ứng dụng các vi sinh vật đối ức chế nấm bệnh cây đã được thực hiện rất sớm ở Việt Nam và đạt được những thành tựu bước đầu như sử dụng

vi sinh vật đối ức chế nấm như một sinh vật chức năng trong sản xuất sinh bón hữu cơ vi sinh; các chế phẩm lên men xốp sử dụng nhóm vi nấm

Trichoderma Có vài chục công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Trichoderma để phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng

2.4 Chức năng của protein SyrB2

SyrB2 là một enzyme không chứa nhân heme FeII

, khối lượng khoảng 36kDa có hoạt tính xúc tác, chúng có khả năng gắn một nhóm methyl lên threonyl bám protein [18] SyrB2 là một enzyme gắn hoạt động trong vùng

trans trên nhóm threonyl hiện diện bởi domain T trong SyrB1 [18]

Hình 2.5 Hoạt động của SyrB2 trong sinh tổng hợp syringomycin

Gen SyrB2 có kích thước khoảng 1,3kb, chiều dài khung đọc mở là 932bp SyrB2 được tìm thấy trong vi khuẩn Pseudomonas syringae pv

syringae tham gia vào con đường sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên và là một trong những protein đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên một peptide kháng nấm gọi là Syringomycin E [18] Các axid amin thứ chín của SR-E là một threonine clo (4-Cl-L-Thr) Các cơ chất cho SyrB2 L-Thr và 66kDa protein SyrB1 trên nhóm threonyl hiện diện bởi vùng domain T trong SyrB1 Khi phức hợp L-Thr-S-SyrB1 được đưa vào trung tâm vị trí hoạt động của SyrB2, SyrB2 phản ứng với L-Thr để tạo ra 4-Cl-Thr-S-SyrB1, sau đó chúng gắn kết với các axid amin còn lại để tạo ra SR-E hoàn chỉnh [18].Trong nghiên cứu của Megan L Matthews và cs, đã chứng minh phản ứng của các SyrB2, Fe (II), αKG, Cl phản ứng với O2 mạnh hơn 8 lần khi có mặt của các chất nền tự nhiên ( l -Thr- S -SyrB1) hơn trong cả hai sự vắng mặt của protein vận chuyển hoặc sự hiện diện của SyrB1 [19]

2.5 Phương pháp PCR, realtime PCR

2.5.1 Phương pháp PCR

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR:

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích ban đầu, khuếch đại, nhân

số lượng bản sao của khuôn này thành hang triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA

này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu

về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm

3 bước như sau :

Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation)

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 950C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới

Bước 2: (bắt cặp, annealing)

Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 650

C Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây

Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)

Nhiệt độ được tăng lên 720

C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n

m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa

n: Là số chu kỳ

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230

đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao

2.5.2 Real-time PCR

Định nghĩa: Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại

DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kì nhiệt của phản ứng

Chu kỳ ngưỡng (Ct): là chu kỳ nhiệt mà tại thời điểm này thiết bị

real-time ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền hay có thể định nghĩa chu kỳ ngưỡng là trị số được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đường nền cắt được đường biểu diễn khuếch đại

Giá trị Ct xuất hiện sớm hay muộn là do số lượng bản DNA đích ban đầu (starting quantity, Sq) có trong ống phản ứng nhiều hay ít Nếu trong ống phản ứng số lượng DNA đích nhiều thì sẽ cần ít chu kì nhiệt hơn để đạt đến số lượng bản sao đủ để ống phản ứng cho được tín hiệu huỳnh quang mà máy sẽ ghi nhận được, còn nếu số lượng DNA đích ít hơn thì cần nhiều chu kì nhiệt hơn Đây là một đặc điểm vượt trội của real-time PCR, vì nhờ nó mà người làm thí nghiệm xác định được số copies của tác nhân đích có trong mẫu thử

Nguyên lý

Real-time PCR là một phương pháp PCR mới, nó kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng, từ đó mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kì nhiệt của phản ứng, và do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại

Phương pháp định lượng tương đối dựa trên gen tham chiếu

(reference gene): phương pháp 2 -ΔΔCt của Livak

Đặc trưng của real-time PCR là phát hiện sản phẩm khuếch đại trong quá trình chạy PCR khi sản phẩm khuếch đại từ DNA đích được nhân bản đạt

đủ số lượng để làm cho ống phản ứng dựa vào sự xuất hiện huỳnh quang của ống phản ứng sớm hay muộn, tức là chu kì ngưỡng (Ct) của ống phản ứng nhỏ hay lớn Định lượng tương đối được sử dụng cho việc định lượng tác nhân đích mà người làm thí nghiệm không thể cân đo đong đếm được mẫu thử để có được số lượng chính xác hoặc chúng cũng được sử dụng trong các nghiên cứu để định lượng một biểu hiện gen nào đó Trong phương pháp này, người làm thí nghiệm sẽ định lượng không chỉ gen cần nghiên cứu (Target gene) mà cả một gen tham chiếu ( reference gene) tức là gen mà các nghiên cứu trước đó đã xác định là có biểu hiện như nhau giữa hai mẫu thử nghiệm

và đối chứng để từ đó tính ra được tỉ lệ biểu hiện của gen đích trên mẫu thử so với mẫu đối chứng theo phương pháp tính của Livak

2.6 Vector tách dòng pGEM-T Easy

Nguyên lý: Đưa đoạn DNA sản phẩm của PCR nối ghép vào trong hệ

gen của một vòng DNA đã được thiết kế trước, gọi là plasmid hay vector dẫn truyền Sau đó plasmid chứa DNA ngoại lai này (gọi là plasmid tái tổ hợp) được chuyển nạp vào tế bào chủ thích ứng để nuôi cấy với một lượng lớn và tách DNA plasmid chứa đoạn sản phẩm PCR nói trên, nhằm thu được một lượng lớn bản sao DNA một cách chính xác

Trong kỹ thuật dòng hóa gen của vi khuẩn Pseudomonas syringae pv syringae chúng tôi sử dụng vecto tách dòng pGEM-T Easy

Hình 2.6 Vector tách dòng pGEM-T Easy

Hình 2.7: Promoter và trình tự đa nối của vecto pGEM-T Easy

 Đặc điểm của vector pGEM-T Easy:

- Đầu thừa Thymidine 3’ để tách dòng sản phẩm PCR: pGEM-T

Easy vector được thiết kế với một 3’- thymidine ở cả hai đầu T- nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình gắn sản phẩm PCR bằng cách ngăn chặn việc tự gắn vòng của vector và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR đã được tạo ra bởi các enzyme tổng hợp

- Lựa chọn các thể biến nạp xanh/ trắng: pGEM-T Easy là vector có

số lượng bản copy cao, chứa các promoter T7 và SP6 RNA polymerase nằm cạnh vùng MCR (Multiple Cloning Region), bên trong đoạn mã cho α-peptite

và đoạn mã cho enzyme β-galactosidase Sự bất hoạt do hoạt động chèn vào của đoạn α-peptite cho phép xác định các thể chuyển nạp hay không chuyển nạp bằng cách sàng lọc màu sắc xanh/trắng trên đĩa thạch

- Vị trí enzyne giới hạn cho việc cắt đoạn sản phẩm gắn: Vector

chứa một số lớn vị trí cắt của ezyme giới hạn trong vùng đa chọn lọc MCR

Vị trí MCR của vector pGEM -T Easy nằm dọc theo các vị trí nhận biết của enzyme EcoRI, BstZI và NotI, cho phép 3 enzym riêng rẽ cắt đoạn chèn Vùng lựa chọn của vector pGEM-T Easy nằm dọc theo các vị trí nhận biết của BstZI Cuối cùng, một vị trí cắt đôi có thể được sử dụng để giải phóng đoạn chèn từ vector này hay vector khác

- Gắn nhanh chóng: Phản ứng gắn có thể được ủ trong vòng 1 giờ ở

nhiệt độ phòng Khoảng thời gian ủ có thể tăng thêm để tăng số lượng khuẩn lạc được biến nạp

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc

3.1.1 Chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv syringae đã được phân lập

trên môi trường thạch do Viện Cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch cung cấp

3.1.3 Hóa chất và sinh phẩm

- PureLinkTM Genomic DNA MiniKit (Invitrogen), Gene JET PCR

Purification Kit (Thermo scientific), môi trường nuôi Pseudomonas syringae

pv Syringae; bộ Kit SuperScript ™ First-Strand Synthesis System for PCR (Invitrogen)

RT Agarose 1% (1g agarose pha trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X); dung di ̣ch đê ̣m TAE 50X (60,5 g Tris base; 14,3ml axit axetic; 25ml EDTA 0,5M, pH 8,0), 10mg/ml EtBr (ethidium bromide), đệm tra mẫu 10X (loading buffer: 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3% glyxerol 100% và định mức bằng

H2O đến 1ml)

- Tris base, EDTA(Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), IPTG, methanol, và các hóa chất thông dụng khác được mua từ các hãng New England Biolabs, Merk/BDH Chemicals(Đức), Sigma(Mỹ)

3.1.4 Môi trường và dung dịch

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn E.coli

Bảng 3.1 Thành phần môi trường LB (cho 1 lít môi trường)

Yeast extract 5g

Đối với môi trường thạch, cần bổ sung 2% agar bacteria

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Pseudomonas syringae pv syringae

Bảng 3.2 Thành phần môi trường King’s B nuôi cấy vi khuẩn

Pseudomonas syringae pv syringae

- Dung dịch tách chiết DNA plasmid

Bảng 3.3 Thành phần các dung dịch dùng trong tách chiết DNA plasmid

Dung dịch I (sol I) 25 mM Tris HCl, pH 8

10 mM EDTA, pH 8

Dung dịch II (sol II) 0.2 M NaOH

1% SDS Dung dịch III (sol III) Đệm acetate kali 3M, pH 5.5

Dung dịch chloroform :

isomylalcohol (24:1)

24ml chloroform 1ml isomylalcohol

EDTA

- Dung dịch cho điện di ADN

Bảng 3.4 Thành phần dung dịch dùng trong điện di DNA

Dung dịch đệm điện di TAE 50X

121 g Tris base 28.6 ml Acid acetic glacial