Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ

PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) đƣợc trồng rộng khắp ở các tỉnh trong cả nƣớc với nhiều vùng trồng tập trung, đem lại nguồn thu nhập cho ngƣời dân, góp phần ổn định tình hình kinh tế - xã hội. Sắn là cây lƣơng thực, đồng thời cung cấp nguyên liệu phục vụ cho công nghiệp chế biến, xuất khẩu và làm nguyên liệu sinh học. Sắn đã trở thành 1 trong 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng, có giá trị kinh tế cao của Việt Nam và là một trong những loại cây trồng đƣợc ƣu tiên phát triển trong tầm nhìn chiến lƣợc đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Ở nƣớc ta trong những năm gần đây, trên cây sắn xuất hiện một loại bệnh mới đƣợc gọi là bệnh chổi phù thuỷ (hay bệnh chổi rồng) với biểu hiện triệu chứng đặc trƣng do bị nhiễm phytoplasma, nhƣ cây mọc nhiều chồi phụ ở ngọn và phần thân chính, lá biến vàng. Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn đƣợc ghi nhận xuất hiện rải rác từ năm 2005 trên giống sắn KM94 tại một số huyện của tỉnh Quảng Ngãi và đã trở thành dịch nghiêm trọng tại nhiều vùng trồng sắn thuộc một số tỉnh Đông Nam Bộ nhƣ Bà Rịa-Vũng Tàu và Đồng Nai. Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, năng suất giảm 10 - 30%, hàm lƣợng tinh bột giảm 20 - 30% (Nguyên Khê, 2011). Ở các khu vực tiến hành trồng lại hay trồng mới thuộc các tỉnh Đông Nam Bộ, bệnh chổi phù thuỷ sắn vẫn xuất hiện, gây quan ngại cho nông dân và chính quyền địa phƣơng. Do nguyên nhân gây bệnh chƣa đƣợc xác định chính xác nên việc quản lý bệnh gặp nhiều lúng túng. Ở một số vùng trồng sắn, nông dân đã tiến hành thử nghiệm các loại thuốc trừ nấm để xử lý hom và phun cho cây sắn khi xuất hiện bệnh chổi phù thuỷ. Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả phòng chống bệnh. Cây sắn bị nhiều bệnh gây hại khác nhau, trong đó có bệnh phytoplasma. Bệnh phytoplasma hại sắn đã đƣợc ghi nhận ở một số vùng trồng sắn trên thế giới nhƣ quần đảo Wallis-Futuna, Uganda, Cuba, một số nƣớc thuộc châu Mỹ và châu Á. Phytoplasma gây hại trên cây sắn xác định đƣợc liên quan đến bệnh biến vàng lá, bệnh chổi phù thuỷ và bệnh da cóc. Ở Brazil, tại một số vùng trồng sắn thuộc phía đông bắc nƣớc này, tỷ lệ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ lên đến 85% và năng suất củ giảm đến 70% (Flôres et al., 2013), thậm chí năng suất củ giảm sút đến 90% cũng đã đƣợc ghi nhận (Lozano, 1992). Phytoplasma là một tác nhân đặc biệt gây bệnh trên cây trồng. Phytoplasma không thể nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo, tế bào thiếu lớp vách bên ngoài do bộ gen của chúng đã bị suy thoái mạnh. Con đƣờng lan truyền của phytoplasma ngoài tự nhiên là qua nhân giống vô tính và qua côn trùng môi giới. Do phytoplasma không nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo nên chẩn đoán và phân loại nhóm tác nhân gây bệnh này chủ yếu dựa trên phân tích một số vùng gen, quan trọng nhất là gen mã hóa 16S RNA ribosome (Bertaccini et al., 2014). Trên thế giới, phytoplasma gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác nhau và số lƣợng bệnh mới do phytoplasma gây ra tăng theo từng năm (Bertaccini et al., 2014). Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh phytoplasma trên cây trồng còn hạn chế. Các kết quả điều tra cơ bản trƣớc đây đều chƣa phát hiện ra bệnh phytoplasma ở Việt Nam. Gần đây, dựa trên đánh giá triệu chứng và chẩn đoán phân tử, nguyên nhân gây bệnh chồi cỏ mía và trắng lá mía đã đƣợc xác định là do phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013). Hai bệnh này đã gây thành dịch nghiêm trọng tại một số vùng trồng mía trọng điểm của Việt Nam. Phòng chống hiệu quả bệnh cây nói chung và bệnh chổi phù thuỷ hại sắn nói riêng phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó, đầu tiên là phải xác định chính xác tác nhân gây bệnh và các đặc điểm sinh học của bệnh. Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn là một bệnh mới ở Việt Nam nên cần phải thực hiện nghiên cứu về bệnh, đặc biệt tại các tỉnh trọng điểm có dịch ở Đông Nam Bộ. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Chẩn đoán và phân loại đƣợc phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá đƣợc một số đặc điểm sinh học chính nhƣ tính gây bệnh và khả năng lan truyền của chúng.

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP, NĂM 2016 MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây sắn 2.1.1 Lƣợc sử nguồn gốc phân loại sắn 2.1.2 Giá trị sử dụng giá trị dinh dƣỡng 2.1.3 Tình hình sản xuất sắn giới 2.1.4 Tình hình sản xuất sắn Việt Nam 2.2 Phytoplasma hại thực vật 2.2.1 Lịch sử phát phytoplasma 2.2.2 Phân loại phytoplasma 2.2.3 Tầm quan trọng phytoplasma 12 2.2.4 Đặc điểm hình thái phytoplasma 13 2.2.5 Triệu chứng bệnh phytoplasma gây 14 2.2.6 Cơ chế gây bệnh phytoplasma 14 2.2.7 Sự đa dạng phytoplasma 15 2.2.8 Lan truyền phytoplasma 16 2.2.9 Phƣơng pháp chẩn đoán phytoplasma 20 iii 2.2.10 Biện pháp phòng chống 26 2.3 Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại sắn 27 2.4 Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật Việt Nam 32 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 3.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 36 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 36 3.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 37 3.2 Nội dung nghiên cứu 37 3.2.1 Điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 37 3.2.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mô PCR 37 3.2.3 Định danh phân tử phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 38 3.2.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 3.2.5 38 Xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây 38 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 39 3.3.1 Phƣơng pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 39 3.3.2 Phƣơng pháp phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mô PCR 40 3.3.3 Phƣơng pháp định danh phân tử phân tích phả hệ 44 3.3.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 3.3.5 3.4 46 Phƣơng pháp xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây 47 Phƣơng pháp tính xử lý số liệu 49 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 51 Mô tả triệu chứng điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 51 4.1.1 Mô tả triệu chứng bệnh 51 4.1.2 Mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 53 4.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mô PCR 54 4.2.1 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử 54 iv 4.2.2 Phát phytoplasma hại sắn nhuộm mô 57 4.2.3 Phát phytoplasma hại sắn kỹ thuật PCR 59 4.3 Định danh phân tử phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 65 4.3.1 Kết định danh giải trình tự sản phẩm PCR 65 4.3.2 Kết định danh kỹ thuật RFLP 75 4.3.3 Kết định danh phân tích đồng trình tự nucleotide 84 4.3.4 Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trình tự nucleotide 86 4.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 96 4.4.1 Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 96 4.4.2 Đánh giá khả phát phytoplasma mồi LAMP 4.5 Xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 101 phytoplasma gây 104 4.5.1 Ảnh hƣởng đất hom giống đến khả lan truyền bệnh 104 4.5.2 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép 108 4.5.3 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 109 4.5.4 Khả lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn qua số loài côn trùng 112 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 120 5.1 Kết luận 120 5.2 Kiến nghị 121 Danh mục công trình công bố 122 Tài liệu tham khảo 123 Phụ lục 141 v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Diễn giải ký hiệu, nghĩa tiếng Việt/tiếng Anh cs Cộng CT Công thức µl Microliter A laidlawii Acholeplasma laidlawii BIP Backward internal primer (Mồi ngƣợc dòng bên trong) BLAST Basic local alignment search tool (Công cụ tìm kiếm chuỗi tƣơng đồng cục bộ) bp Base pair (Cặp bazơ) Ca Phytoplasma Candidatus Phytoplasma CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DAPI 4‟,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride DNA Deoxy nucleic acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtOH Ethanol FAO Food and agriculture organization (Tổ chức Nông nghiệp Lƣơng thực Liên hiệp Quốc) FIP Forward internal primer (Mồi xuôi dòng bên trong) IRPCM International research project for comparative mycoplasmology (Dự án Nghiên cứu Quốc tế Mycoplasma) kb Kilo base LAMP-PCR Loop mediated isothermal amplification - PCR (Kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt) M esculenta Manihot esculenta ml Mililiter nm Nanometer nts Nucleotides PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) vi RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) rRNA ribosomal ribonucleic acid TAE Tris-acetate acid EDTA TEM Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua) UPGMA Unweighted pair group method with arithmetic mean (Phƣơng pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng) vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Phân loại phytoplasma dựa phân tích gen 16S RNA ribosome 2.2 Thành phần nhóm côn trùng Hemiptera môi giới truyền phytoplasma 17 2.3 Một số mồi PCR phát phytoplasma đƣợc công bố 23 2.4 Danh sách nhóm phytoplasma hại sắn đƣợc xác định dựa vào phân tích phân tử 32 3.1 Các cặp mồi đƣợc sử dụng để phát phytoplasma sắn 42 4.1 Mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn điểm điều tra số tỉnh (năm 2011) 53 4.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử 55 4.3 Phát phytoplasma hại sắn nhuộm DAPI (năm 2014) 57 4.4 Kết PCR phát phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7R16F2n/R16R2 4.5 60 Kết PCR phát phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7 R16mF2/R16mR1 4.6 63 Kết giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 4.7 66 Kết tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 4.8 67 Kết giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 4.9 70 Kết tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 4.10 71 Danh sách mẫu phytoplasma hại sắn đƣợc đăng ký Ngân hàng Gen 74 4.11 Danh sách mẫu dùng phân tích RFLP mô 77 4.12 Mức tƣơng đồng di truyền dựa mô hình cắt RFLP mô vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome mẫu phytoplasma hại sắn 4.13 83 So sánh mức đồng trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome mẫu phytoplasma hại sắn 85 viii 4.14 Đại diện 28 nhóm phytoplasma dùng phân tích phả hệ 86 4.15 Đại diện nhóm phụ nhóm 16SrI dùng phân tích phả hệ 89 4.16 Đại diện nhóm phụ nhóm 16SrII dùng phân tích phả hệ 92 4.17 Các nhóm/nhóm phụ 16S RNA ribosome phytoplasma hại sắn Việt Nam 4.18 94 Đặc điểm trình tự phù hợp gen mã hóa 16S RNA ribosome để thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 4.19 Trình tự mồi LAMP cải tiến đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 4.20 Phản ứng LAMP phát phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số chiết từ 4.21 Phản ứng LAMP phát phytoplasma nhóm 16SrII từ sản phẩm PCR 102 Phản ứng LAMP phát phytoplasma từ loại mẫu sắn khác bị bệnh chổi phù thuỷ 4.23 103 Ảnh hƣởng đất trồng hom giống đến khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn (Đồng Nai, năm 2012) 4.24 107 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua phƣơng pháp ghép (Đồng Nai, năm 2012) 4.26 108 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng (Đồng Nai, năm 2012) 4.27 110 Kết bẫy đèn thu thập số loài rầy vùng trồng sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ (Đồng Nai, năm 2012) 4.28 105 Ảnh hƣởng nguồn vật liệu hom giống đến tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ (Đồng Nai, năm 2013) 4.25 100 101 tinh 4.22 99 113 Xác định khả lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn côn trùng thí nghiệm 116 ix DANH MỤC HÌNH STT 2.1 Tên hình Trang Hình thái kích thƣớc phytoplasma tế bào ống rây mạch phloem đƣợc chụp dƣới kính hiển vi điện tử 2.2 13 Minh họa phân bố phytoplasma thể côn trùng môi giới lan truyền bệnh 18 2.3 Sơ đồ mồi đƣợc sử dụng phản ứng LAMP-PCR 24 2.4 Sơ đồ nguyên lý phản ứng LAMP-PCR 25 2.5 Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ 29 2.6 a) Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ vùng São Paulo, Brazil; b) sắn bị bệnh biến vàng vùng Kuwanda, Uganda 29 2.7 Bệnh da cóc hại sắn 29 2.8 Một số hình ảnh xác định phytoplasma phƣơng pháp hiển vi điện tử Việt Nam 3.1 34 Lƣợc đồ cụm gen rDNA phytoplasma, vị trí mồi kích thƣớc sản phẩm PCR 42 4.1 Triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ hại sắn đồng 52 4.2 Xác định phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử (đợt 1, năm 2011) 56 4.3 Xác định phyttoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử (đợt 2, năm 2011) 56 4.4 Kết thí nghiệm nhuộm DAPI 58 4.5 Minh họa kết điện di sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi P1/P7R16F2n/R16R2 4.6 62 Minh họa kết điện di sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi P1/P7R16mF2/R16mR1 64 4.7 Phân tích sản phẩm PCR kỹ thuật RFLP 75 4.8 Phân tích đa hình mô trình tự nucleotide pDRAW32 81 4.9 Phân tích cụm dựa số liệu RFLP mô vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome mẫu phytoplasma hại sắn Việt Nam 4.10 82 Cây phả hệ xác định nhóm phytoplasma hại sắn đƣợc vẽ theo phƣơng pháp Neighbor-Joining 88 4.11 Cây phả hệ xác định nhóm phụ phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI 91 4.12 Cây phả hệ xác định nhóm phụ phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII 93 x 4.13 Minh họa phần vùng gen 16S RNA ribosome chứa trình tự phytoplasma nhóm 16SrII với nhóm lại 4.14 Vị trí trình tự vùng gen mục tiêu mồi tƣơng ứng kỹ thuật LAMP cải tiến 4.15 98 Tám đoạn trình tự đƣợc lựa chọn để thiết mồi LAMP cải tiến đặc hiệu nhóm 16SrII 4.16 98 Kết điện di sản phẩm LAMP phát phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số chiết từ 4.17 101 Kết điện di sản phẩm LAMP phát phytoplasma nhóm 16SrII từ sản phẩm PCR tinh 4.18 102 Phản ứng LAMP phát phytoplasma từ loại mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ khác 4.19 103 Ảnh thí nghiệm ảnh hƣởng đất trồng đến khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ sắn thí nghiệm nhà lƣới (năm 2012) 4.20 97 106 Ảnh thí nghiệm xác định khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua phƣơng pháp ghép 109 4.21 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 110 4.22 Một số loài rầy thu thập vùng trồng sắn có bị bệnh chổi phù thuỷ Đồng Nai (năm 2012) 114 xi KT-03 Đăk Tờre, Kon Rẫy, 23/02/2011 Kon Tum Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM94 KT-04 Đăk Tờre, Kon Rẫy, 23/02/2011 Kon Tum Đăk Tờre, Kon Rẫy, 23/02/2011 Kon Tum Sơn Nham,Sơn Hà, 24/02/2011 Quảng Ngãi Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM94 Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng Đồng Phú, Bình Phƣớc Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM140 Chổi phù KM140 Chổi phù KM60 Chổi phù KM60 KT-17 QNg-01 QNg-02 QNg-02.1 QNg-03 147 QNg-04 QNg-04.1 ĐN-34 ĐN-35 BD-01 BD-02 BP-01 BP-02 Đồng Phƣớc Phú, 24/02/2011 24/02/2011 24/02/2011 24/02/2011 24/02/2011 03/4/2012 03/4/2012 06/04/2012 06/04/2012 25/8/2012 Bình 25/8/2012 thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch Thân mọc nhiều chồi phụ Lá biến dạng, thùy lá, biến vàng Nhƣ Nhƣ Lá co nhỏ, biến vàng Thân gỗ màu đen, lõi màu nâu nhạt Nhƣ Trời nắng nóng Đất Củ sắn bị bệnh chổi đồi núi đá dốc Trồng phù thuỷ rải rác hộ nông Lá co nhỏ, biến vàng Thân dân Tự để hom giống gỗ màu đen Nhƣ thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch thuỷ (sắn)thuỷ (sắn)thuỷ (sắn)thuỷ (sắn)- Củ sắn bị bệnh chổi phù thuỷ Chờ thu hoạch Thân mọc nhiều chồi phụ Lá co nhỏ, biến vàng Chờ thu hoạch Thân mọc nhiều chồi phụ Lá co nhỏ, biến vàng Phát triển thân Lá co nhỏ, biến vàng Lõi thân có màu nâu nhạt Phátriển thân Nhƣ thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch Nhƣ thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch Nhƣ 147 Ruộng trồng sắn tập trung Không rõ nguồn gốc Không rõ nguồn hom giống sử dụng Trồng rải rác hộ nông dân Không rõ nguồn hom giống sử dụng Đồng Phú, Bình 25/8/2012 Phƣớc Hƣng Lộc, Thống 07/12/2013 Nhất, Đồng Nai Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM60 Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM94 07/12/2013 Chờ thu hoạch Không rõ Không rõ Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ (sắn) Chổi phù thuỷ (sắn)KM140 Chổi phù thuỷ (sắn) Chổi phù thuỷ (sắn) 9/2012 Chổi phù thuỷ (sắn) Chờ thu hoạch 2011 SCWL-01 Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai Quảng Ngãi Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng Tây Ninh Tân Thành, Bà RịaVùng Tàu Cổ Tiết, Tam Nông, Phú Thọ Mậu A, Văn Yên, Yên Bái Mậu A, Văn Yên, Yên Bái Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Định Quán, Đồng Nai 2011 Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ đậu tƣơng Chổi phù thuỷ đậu tƣơng Trắng mía SCWL-02 Định Quán, Đồng Nai 2011 Biến vàng BP-03 T7-ĐN T8-ĐN T14-ĐN T15-ĐN T20-ĐN T11-QNg 148 T17-BD T18-TN T19-BRVT PhT-01 YB-01 YB-02 ĐT-01 ĐT-02 07/12/2013 07/12/2013 07/12/2013 Không rõ 06/04/2012 2011 2011 2011 148 Nhƣ Chờ thu hoạch Cây phát búi Lá co nhỏ, biến vàng Thân gỗ màu đen, lõi màu nâu nhạt Nhƣ Trồng rải rác nông dân Không Nhƣ nguồn hom giống dụng Vùng đất bazan Nhƣ Chờ thu hoạch Nhƣ Chờ thu hoạch hộ rõ sử đỏ Không rõ Không rõ DNA tổng số lƣu lại Phát triển thân Lá co nhỏ, biến vàng Lõi thân có màu nâu nhạt Không rõ Không rõ DNA tổng số lƣu lại Không rõ Không rõ DNA tổng số lƣu lại Lá co nhỏ, biến vàng Thân gỗ màu đen Chờ thu hoạch Lá co nhỏ, biến vàng Thân gỗ màu đen Chờ thu hoạch Lá co nhỏ, biến vàng Thân gỗ màu đen Cây hoa-đậu Cây phát búi dạng chổi phù thuỷ Lá biến dạng Cây hoa-đậu Nhƣ Cây Lá có màu trắng kem sữa Cây thấp lùn xuống Cây vƣơn lóng Gân, thịt biên vàng Không rõ nguồn hom giống sử dụng Không rõ nguồn hom giống sử dụng Không rõ nguồn hom giống sử dụng Trồng rải rác hộ nông dân Trồng rải rác hộ nông dân Trồng rải rác hộ nông dân Trồng rải rác PHỤ LỤC Một số cặp mồi sử dụng phản ứng PCR trực tiếp nhằm phát phytoplasma gây hại sắn P1/P7 M 2000 bp 1000 bp Hình Kết điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi P1/P7 M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ đến 7: mẫu thử nghiệm gồm QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; ĐT-01: chổi phù thuỷ đậu tƣơng Trảng Bom - Đồng Nai; Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai SN910601/SN011119 M  1,8 kb Hình Kết điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi SN910601/SN011119 M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ đến 7: mẫu thử nghiệm gồm QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai; ĐT-01: chổi phù thuỷ đậu tƣơng Trảng Bom - Đồng Nai Hình Kết điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi A) Phy1F/SN011119 B) P1/SN011119 M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ đến 7: mẫu thử nghiệm gồm QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; ĐT-01: chổi phù thuỷ đậu tƣơng Trảng Bom - Đồng Nai; Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai 149 Phy1F/P7 M  1,8 kb Hình Kết điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi Phy1F/P7 M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ đến 7: mẫu thử nghiệm gồm QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; SCWL-02: biến vàng mía Định Quán- Đồng Nai; Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai Hình Kết điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi Phy1F/Spacer1R M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ đến 7: mẫu thử nghiệm gồm QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; SCWL-01: trắng mía Định Quán- Đồng Nai; Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai Bảng Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tiếp xúc học (Đồng Nai, 2013) STT Cây thí nghiệm Sắn KM94 Sắn KM937-26 Thầu dầu Dừa cạn Tỷ lệ phát bệnh (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 Thời kỳ tiềm dục 0 0 Ghi chú: n 30 cây; (–) tức phản ứng PCR âm tính 150 Kiểm tra PCR – – – – PHỤ LỤC Danh sách mẫu phytoplasma dùng để lựa chọn vùng gen thiết kế mồi LAMP đặc hiệu nhóm 16SrII Bảng Danh sách 92 mẫu trình tự 16S RNA ribosome dùng để lựa chọn vùng gen thiết kế mồi LAMP đặc hiệu nhóm 16SrII STT Nhóm Mẫu* Số mẫu 16SrI I-Y-EF199549; I-D-AY265206-PaWB; I-B-M3079013 MAY; I-N-AY265205-IoWB; I-B-NC005303-OY-M; IM-AY265209-AVUT; I-L-AY180957-AV2192; I-EAY265213-BBS3; I-A-NC007716-AYWB; I-FAY265211-A-AY; I-C-AF222065-CPh; I-A-L33760-BB; I-P-AF503568-PopAY 16SrII II-A-L33765-PnWB; II-KM280680-CWBT11.QNg; II16 KM280681-CWBT18.TN; II-C-X83432-FBP; II-BU15442-WBDL; II-D-Y10096-PpM; II-KM280682CWBT19.BRVT; II-KM280679-CWBT7.DN; IIKC295285-CWB.BR02; II-KM360172-CWB.BR9.1; IIKM360171-CWB.BR7.2; II-KM360170-CWB.BR5; IIKM360169-CWB.QNg19.2; II-JQ957931-Alp4; II-FEF186827-CoP; II-E-Y16393-PEY 16SrIII III-L-EU346761-CFSD; III-J-AF147706-ChWBIII; III-P9 AF370119-DanV; III-V-GU292082-PassWB-Br4; III-MFJ226074-PPT-MT117; III-F-AF510724-MW1; III-BAF173558-CYE; III-N-GU004365-PPT-AK6; III-AJQ044393-PX11Ct1 16SrIV IV-A-AF498307-LYJ-C8; IV-B-MOU18753-LDY; IV-C3 X80117-LDT 16SrV V-C-X76560-FDC; V-D-AJ548787-FD1487; V-F6 AB689678-BltWB; V-B-AB052876-JWBG1; V-AAY197655-EY; V-E-AY197648-RusS 16SrVI VI-D-AF228053-PLLBd; VI-E-AY270156-CSVI; VI-A7 AY390261-CP; VI-B-AF190224-MC; VI-C-AF409069EY-Il1; VI-F-EF186819-CPS; VI-I-GU292081-PassWB 16SrVII VII-B-AY034608-ErWB; VII-A-AF092209-AshY; VII-C3 AY147038-ArAWB 16SrVIII VIII-A-AF086621-LufWB; VIII-A-AF086621-LufWB 16SrIX IX-C-HQ589191-NAXOS: IX-A-AF248957-PPWB; IX4 B-AF515636-CPPA4; IX-D-AF515637-AlWB 16SrX X-D-X92869-SpaWB; X-E-X76431-BAWB; X-A3 AJ542541-AP15 10 16SrXI XI-B-X76432-SCWL; XI-A-AB052873-RYD; XI-C3 X76429-BVK 11 16SrXII XII-A-AF248959-STOL11; XII-C-AJ243045-StrawLY; XII-H-JN833705-BYS57; XII-D-AB010425-JHP 12 16SrXIII XIII-A-AF248960-MPV 13 16SrXIV XIV-A-AJ550984-BGWL-C1; XIV-B-EF4444852 F.BGWL 151 STT 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Nhóm Mẫu* 16SrXV 16SrXVI 16SrXVII 16SrXVIII 16SrXIX 16SrXX 16SrXXI 16SrXXII 16SrXXIII 16SrXXV 16SrXXVIII 16SrXXX 16SrXXXI 16SrXXXII Tổng XV-A-AF147708-HibWB; XV-B-HQ258882-GWB XVI-A-AY725228-SYLS XVII-A-AY725234-PBT XVIII-A-DQ174122-APPTW XIX-A-AB054986-CPC XX-JQ868449-RhCa XXI-A-AJ310849-PinP; XXI-A-AJ310849-PinP XXII-A-KF751387-LYDM178; XXII-B-JQ868442-CLYP XXIII-A-AY083605-BVGY XXV-A-AF521672-WTTW XXVIII-A-AY744945-DP XXX-A-FJ432664-SaCW XXXI-A-HQ225630SST1 XXXII-A-EU371934-MaPV Số mẫu 1 1 2 1 1 1 92 Các mẫu đƣợc trình bày theo thứ tự Nhóm – Nhóm phụ - Mã truy cập Ngân hàng gen-Mẫu 152 PHỤ LỤC Đề xuất quy trình chẩn đoán, giám định phytoplasma hại sắn Thu thập bảo quản mẫu bệnh a Thu thập mẫu bệnh Thu thập, chụp ảnh, mô tả triệu chứng sắn nghi ngờ nhiễm bệnh có biểu triệu chứng đặc trƣng nhƣ mọc nhiều chồi chồi thân phần thân chính; nhỏ lại, biến màu vàng nhạt, tím nhạt thô cứng, đốt thân ngắn lại, thân sắn ngả mầu thâm đen, phần lõi có màu nâu nhạt, chồi bị chết khô, nhiều bị thấp lùn lại b Xử lý bảo quản mẫu Đối với cách bảo quản tƣơi: chọn phận (lá, thân cành) có biểu triệu chứng điển hình bệnh chổi phù thuỷ đƣợc giữ ẩm giấy thấm ƣớt bọc giấy báo, bọc vải ẩm đựng vào thùng xốp Đối với cách bảo quản khô: chọn phận (lá, gân lá, thân cành) cho vào túi nilon có chứa hạt silicagel tự thị Thay hạt silicagel tự thị mẫu bảo quản khô, giòn đƣợc Cất giữ bảo quản mẫu nhiệt độ phòng tủ lạnh sâu –20oC Chẩn đoán, giám định bệnh a Chẩn đoán Chẩn đoán bệnh kỹ thuật nhuộm mô với DAPI (4‟,6-diamidino-2phenylindole dihydrochloride) phƣơng pháp kính hiển vi điện tử Chẩn đoán bệnh kỹ thuật LAMP-PCR b Giám định bệnh Áp dụng kỹ thuật PCR lồng cặp mồi P1/P7, R16mF2/R16mR1 R16F2n/R16R2 Phân tích kỹ thuật phân tích đa hình thông thƣờng (RFLP) sản phẩm PCR, phân tích đa hình RFLP thực mô trình tự nucleotide chƣơng trình pDRAW32 c Giải trình tự phân tích phả hệ Tinh sản phẩm PCR Kit theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Gửi đọc trình tự mẫu phân tích sở nƣớc nƣớc Trình tự nucleotide đƣợc so sánh mức độ tƣơng đồng với chƣơng trình tin sinh học ClustalW2, BioEdit 7.0.0, dùng chƣơng trình trực tuyến BLAST để tìm kiếm chuỗi nucleotide tƣơng đồng có sẵn Ngân hàng Gen NCBI địa http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Cây phả hệ đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor-Joining (N-J) với khoảng cách di truyền chuỗi đƣợc xác định dựa mô hình thay Kimura tham số, giá trị thống kê kỹ thuật bootstrap (%) với 1.000 lần lặp lại MEGA 5.0 Sau đó, xác định danh tính loài phytolasma gây hại sắn bị bệnh 153 PHỤ LỤC Kết xử lý thống kê 1) Tỷ lệ bệnh sắn bị bệnh chổi phù thuỷ (%) - thí nghiệm xác định khả lan truyền qua hom chậu vại, Hƣng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, năm 2012 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE THANHF1 19/12/** 9:07 PAGE Anh huong cua dat den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai nha luoi (Dong Nai, nam 2012) VARIATE V003 TLB LN aye Cu chuoi ah SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 7769.34 2589.78 181.23 0.000 * RESIDUAL 114.320 14.2900 * TOTAL (CORRECTED) 11 7883.66 716.696 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF1 19/12/** 9:07 PAGE Anh huong cua dat den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai nha luoi (Dong Nai, nam 2012) MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ CT1 CT2 CT3 CT4 NOS 3 3 TLB 43.3000 0.000000 56.7000 0.000000 SE(N= 3) 2.18251 5%LSD 8DF 7.11693 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF1 19/12/** 9:07 PAGE Anh huong cua dat den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai nha luoi (Dong Nai, nam 2012) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLB GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 25.000 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 26.771 3.7802 15.1 0.0000 154 | | | | 2) Thí nghiệm xác định khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng (Đồng Nai, năm 2012) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE NDT 19/12/** 15:19 PAGE Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%) VARIATE V003 TLB LN ndthanhf SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 1077.74 538.870 273.54 0.000 * RESIDUAL 11.8201 1.97001 * TOTAL (CORRECTED) 1089.56 136.195 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NDT 19/12/** 15:19 PAGE Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%) MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ CT1 CT2 CT3 NOS 3 TLB 11.3000 26.7000 0.000000 SE(N= 3) 0.810352 5%LSD 6DF 2.80314 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NDT 19/12/** 15:19 PAGE Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLB GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 12.667 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 11.670 1.4036 11.1 0.0000 155 | | | | 3) Tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ sắn (%) thời điểm thu hoạch, Hƣng Thịnh - Trảng Bom Đồng Nai, tháng 12 năm 2013 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE THANHF7 4/12/** 9:39 PAGE Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 VARIATE V003 TLB LN aye, Cu chuoi ah SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= GIONG$ 580.301 193.434 78.71 0.000 * RESIDUAL 19.6608 2.45760 * TOTAL (CORRECTED) 11 599.962 54.5420 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF7 4/12/** 9:39 PAGE Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 MEANS FOR EFFECT GIONG$ GIONG$ KM94 KM419 SM937-26 NOS 3 TLB 7.36000 19.2000 6.08000 SE(N= 3) 0.905097 5%LSD 8DF 2.95143 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF7 4/12/** 9:39 PAGE Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLB GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 8.1600 STANDARD DEVIATION C OF V |GIONG$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 7.3853 1.5677 19.2 0.0000 156 | | | | 4) Ảnh hƣởng bệnh chổi phù thuỷ sắn đến chiều cao thời điểm thu hoạch, Hƣng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, tháng 12 năm 2013 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCC FILE THANHF 4/12/** 9:39 PAGE Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 VARIATE V003 CCC LN aye, cu chuoi ah SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= GIONG$ 37.7048 12.5683 124.12 0.000 * RESIDUAL 116 11.7464 101262 * TOTAL (CORRECTED) 119 49.4513 415557 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF 4/12/** 9:39 PAGE Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 MEANS FOR EFFECT GIONG$ GIONG$ KM94 KM419 SM937-26 HL-S11 NOS 30 30 30 30 CCC 3.33067 1.78567 2.75933 2.84533 SE(N= 30) 0.580983E-01 5%LSD 116DF 0.162717 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF 4/12/** 9:39 PAGE Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE CCC GRAND MEAN (N= 120) NO OBS 120 2.6802 STANDARD DEVIATION C OF V |GIONG$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.64464 0.31822 11.9 0.0000 157 | | | | 5) Năng suất, số thu hoạch hàm lƣợng tinh bột giống sắn thời điểm thu hoạch (Hƣng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, tháng 12 năm 2013) BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTL FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V003 NSTL anh nho em nhieu ndt LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 2.16365 1.08182 0.25 0.786 CT$ 805.085 268.362 62.58 0.000 * RESIDUAL 25.7294 4.28823 * TOTAL (CORRECTED) 11 832.978 75.7253 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSCT FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V004 NSCT cu chuoi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 127.042 63.5212 4.12 0.075 CT$ 845.280 281.760 18.28 0.003 * RESIDUAL 92.4868 15.4145 * TOTAL (CORRECTED) 11 1064.81 96.8009 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTB FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V005 NSTB ndt LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 8.23852 4.11926 3.84 0.084 CT$ 90.7119 30.2373 28.17 0.001 * RESIDUAL 6.44142 1.07357 * TOTAL (CORRECTED) 11 105.392 9.58108 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HLTB FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V006 HLTB aye, Cu Chuoi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 1.82000 910000 0.46 0.656 CT$ 32.9767 10.9922 5.53 0.037 * RESIDUAL 11.9333 1.98889 - 158 * TOTAL (CORRECTED) 11 46.7300 4.24818 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CSTH FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V007 CSTH ndthtt7879 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 65.0964 32.5482 8.38 0.019 CT$ 135.067 45.0222 11.59 0.007 * RESIDUAL 23.3076 3.88461 * TOTAL (CORRECTED) 11 223.471 20.3155 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) MEANS FOR EFFECT NLAI NLAI NOS 4 SE(N= 5%LSD 4) 6DF NLAI NOS 4 NSTL 26.8125 26.1875 27.2200 NSCT 32.5650 28.5950 36.5650 NSTB 8.68750 7.40000 9.40250 HLTB 26.2000 25.8000 25.2500 1.03540 3.58162 1.96306 6.79055 0.518066 1.79207 0.705140 2.43919 CSTH 54.9700 52.1475 57.8525 SE(N= 4) 0.985470 5%LSD 6DF 3.40890 MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS NSTL NSCT NSTB HLTB KM94 24.8333 34.9633 8.83000 25.2667 KM419 18.2100 25.3333 6.42333 25.5000 SM937-26 23.6667 24.7100 5.88000 23.8333 HL-S11 40.2500 45.2933 12.8533 28.4000 SE(N= 5%LSD 3) 6DF CT$ KM94 KM419 SM937-26 HL-S11 1.19558 4.13570 NOS 3 3 2.26675 7.84105 0.598211 2.06931 0.814225 2.81654 CSTH 58.4867 58.0533 50.7367 52.6833 SE(N= 3) 1.13792 5%LSD 6DF 3.93626 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE 159 Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE NSTL NSCT NSTB HLTB CSTH GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 26.740 12 32.575 12 8.4967 12 25.750 12 54.990 STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 8.7020 2.0708 7.7 0.7862 9.8387 3.9261 12.1 0.0747 3.0953 1.0361 12.2 0.0843 2.0611 1.4103 5.5 0.6564 4.5073 1.9709 3.6 0.0189 160 |CT$ | | | 0.0002 0.0026 0.0010 0.0373 0.0073 | | | | PHỤ LỤC Một số hình ảnh thí nghiệm Điều tra, thu thập mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ đồng Theo dõi, thu thập rầy ruộng trồng sắn bẫy ánh sáng Cây sắn bệnh mọc từ hạt Cây dừa cạn bệnh mọc từ hạt Máy điện di gel agarose Nồi hấp khử trùng đất thí nghiệm 161 [...]... Đức Thành Tên luận án: Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 62 62 01 12 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chẩn đoán và phân loại đƣợc phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá đƣợc một số đặc điểm sinh học chính nhƣ tính gây bệnh và khả năng lan... DAPI để phát hiện phytoplasma hại sắn tại Việt Nam Thiết kế thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu để xác định phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn tại Đông Nam Bộ Đề xuất đƣợc quy trình chẩn đoán phytoplasma hại sắn cho một số tỉnh Đông Nam Bộ Cung cấp dẫn liệu khoa học về một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra Xác định đƣợc con đƣờng lan truyền chính của bệnh là qua nhân... phải thực hiện nghiên cứu về bệnh, đặc biệt tại các tỉnh trọng điểm có dịch ở Đông Nam Bộ 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Chẩn đoán và phân loại đƣợc phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá đƣợc một số đặc điểm sinh học chính nhƣ tính gây bệnh và khả năng lan truyền của chúng 1.3 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu Phytoplasma gây hại trên cây sắn, tập trung... và một số đặc điểm sinh học 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thủy hại sắn ở Đông Nam Bộ, xác định nguyên nhân phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn Nghiên cứu biện pháp chẩn đoán, xác định và phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn và khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn ở điều kiện chậu vại trong nhà lƣới 2 1.3.3 Địa điểm thời gian nghiên. .. truyền của phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn tại Đông Nam Bộ là chủ yếu qua nhân giống vô tính 3 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Xác định đƣợc phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn, cũng nhƣ xác định đƣợc con đƣờng lan truyền chủ yếu của phytoplasma hại sắn đã góp phần đƣa ra biện pháp quản lý bệnh chổi phù thuỷ một cách có hiệu quả trong điều kiện sản xuất tại một số tỉnh Đông Nam Bộ Biện pháp... cây sắn khi xuất hiện bệnh chổi phù thuỷ Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả phòng chống bệnh Cây sắn bị nhiều bệnh gây hại khác nhau, trong đó có bệnh phytoplasma Bệnh phytoplasma hại sắn đã đƣợc ghi nhận ở một số vùng trồng sắn trên thế giới nhƣ quần đảo Wallis-Futuna, Uganda, Cuba, một số nƣớc thuộc châu Mỹ và châu Á Phytoplasma gây hại trên cây sắn xác định đƣợc liên quan đến bệnh. .. nghiên cứu Điều tra trên đồng, thu thập mẫu đƣợc thực hiện tại một số tỉnh Đông Nam Bộ gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dƣơng, Bình Phƣớc, Tây Ninh và một số tỉnh khác, bao gồm Phú Thọ, Yên Bái, Quảng Ngãi, Kon Tum Các nghiên cứu liên quan tới xác định đặc điểm sinh học đƣợc thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc; nghiên cứu chẩn đoán, phân loại phytoplasma hại sắn đƣợc... là do phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013) Hai bệnh này đã gây thành dịch nghiêm trọng tại một số vùng trồng mía trọng điểm của Việt Nam Phòng chống hiệu quả bệnh cây nói chung và bệnh chổi phù thuỷ hại sắn nói riêng phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó, đầu tiên là phải xác định chính xác tác nhân gây bệnh và các đặc điểm sinh học của bệnh Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn là một bệnh mới ở Việt Nam. .. hiện triệu chứng đặc trƣng do bị nhiễm phytoplasma, nhƣ cây mọc nhiều chồi phụ ở ngọn và phần thân chính, lá biến vàng Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn đƣợc ghi nhận xuất hiện rải rác từ năm 2005 trên giống sắn KM94 tại một số huyện của tỉnh Quảng Ngãi và đã trở thành dịch nghiêm trọng tại nhiều vùng trồng sắn thuộc một số tỉnh Đông Nam Bộ nhƣ Bà Rịa-Vũng Tàu và Đồng Nai Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, năng... hiện tại Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới Thời gian thực hiện các thí nghiệm trong đề tài từ năm 2011 đến năm 2014 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đề tài đã xác định đƣợc bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Việt Nam do phytoplasma gây ra Phytoplasma hại sắn tại Việt Nam thuộc 2 nhóm gồm 16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A) Riêng mẫu phytoplasma hại sắn YB-01