Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (manihot esculenta crantz) tại một số tỉnh đông nam bộ (TT)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ CHUYÊN NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ: 62 62 01 12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2016 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS HÀ VIẾT CƢỜNG TS TRỊNH XUÂN HOẠT Phản biện 1: PGS.TS NGÔ BÍCH HẢO Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 2:PGS.TS NGUYỄN KIM VÂN Hội Khoa học Kỹ thuật Bảo vệ thực vật Việt Nam Phản biện 3:TS HÀ MINH THANH Viện Bảo vệ thực vật Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) trồng nhiều tỉnh phía nam Việt Nam với vùng trồng tập trung, đem lại nguồn thu nhập cho người dân, góp phần ổn định tình hình kinh tế - xã hội Sắn trở thành 10 mặt hàng nông sản xuất quan trọng, có giá trị kinh tế cao Việt Nam loại trồng ưu tiên phát triển tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Ở nước ta năm gần đây, sắn xuất loại bệnh gọi bệnh chổi phù thuỷ (hay bệnh chổi rồng) với biểu triệu chứng đặc trưng bị nhiễm phytoplasma, mọc nhiều chồi phụ phần thân chính, biến vàng Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, suất giảm 10 - 30%, hàm lượng tinh bột giảm 20 - 30% (Nguyên Khê, 2011) Ở khu vực tiến hành trồng lại hay trồng thuộc tỉnh Đông Nam Bộ, bệnh chổi phù thuỷ sắn xuất hiện, gây quan ngại cho nông dân quyền địa phương Do nguyên nhân gây bệnh chưa xác định xác nên việc quản lý bệnh gặp nhiều lúng túng Ở số vùng trồng sắn, nông dân tiến hành thử nghiệm loại thuốc trừ nấm để xử lý hom phun cho sắn xuất bệnh chổi phù thuỷ Tuy nhiên, biện pháp hiệu phòng chống bệnh Cây sắn bị nhiều bệnh gây hại khác nhau, có bệnh phytoplasma Bệnh phytoplasma hại sắn ghi nhận số vùng trồng sắn giới quần đảo Wallis-Futuna, Uganda, Cuba, số nước thuộc châu Mỹ châu Á Phytoplasma gây hại sắn xác định liên quan đến bệnh biến vàng lá, bệnh chổi phù thuỷ bệnh da cóc Ở Brazil, số vùng trồng sắn thuộc phía đông bắc nước này, tỷ lệ sắn bị bệnh chổi phù thuỷ lên đến 85% làm giảm suất củ đến 70% (Flôres et al., 2013), chí suất củ giảm sút đến 90% ghi nhận (Lozano, 1992) Phytoplasma tác nhân đặc biệt gây bệnh trồng Con đường lan truyền phytoplasma tự nhiên qua nhân giống vô tính qua côn trùng môi giới Do phytoplasma không nuôi cấy môi trường nhân tạo nên chẩn đoán phân loại nhóm tác nhân gây bệnh chủ yếu dựa phân tích số vùng gen, quan trọng gen mã hóa 16S RNA ribosome (Bertaccini et al., 2014) Trên giới, phytoplasma gây bệnh hàng trăm loại trồng khác số lượng bệnh phytoplasma gây tăng theo năm (Bertaccini et al., 2014) Ở Việt Nam, nghiên cứu bệnh phytoplasma trồng hạn chế Các kết điều tra trước chưa phát bệnh phytoplasma Việt Nam Gần đây, dựa đánh giá triệu chứng chẩn đoán phân tử, nguyên nhân gây bệnh chồi cỏ mía trắng mía xác định phytoplasma gây (Hoat et al., 2012, 2013) Phòng chống hiệu bệnh nói chung bệnh chổi phù thuỷ hại sắn nói riêng phụ thuộc nhiều yếu tố, đó, phải xác định xác tác nhân gây bệnh đặc điểm sinh học bệnh Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn bệnh Việt Nam nên cần phải thực nghiên cứu bệnh, đặc biệt tỉnh trọng điểm có dịch Đông Nam Bộ 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Chẩn đoán phân loại phytoplasma gây hại sắn số tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá số đặc điểm sinh học tính gây bệnh khả lan truyền chúng 1.3 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu Phytoplasma gây hại sắn, tập trung vào lĩnh vực chẩn đoán, phân loại số đặc điểm sinh học 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thủy hại sắn Đông Nam Bộ, xác định nguyên nhân phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn Nghiên cứu biện pháp chẩn đoán xác định, phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn khả lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn điều kiện chậu vại nhà lưới 1.3.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu Điều tra đồng ruộng, thu thập mẫu thực số tỉnh Đông Nam Bộ gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước Tây Ninh; số tỉnh khác bao gồm Phú Thọ, Yên Bái, Quảng Ngãi Kon Tum Các nghiên cứu liên quan tới xác định đặc điểm sinh học thực Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc; nghiên cứu chẩn đoán, phân loại phytoplasma hại sắn thực Viện Bảo vệ thực vật Trung tâm Nghiên cứu bệnh nhiệt đới Thời gian thực thí nghiệm đề tài từ năm 2011 đến năm 2014 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đề tài xác định bệnh chổi phù thủy hại sắn Việt Nam phytoplasma gây Phytoplasma hại sắn Việt Nam thuộc nhóm gồm 16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A) Riêng mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 (KM360166) Yên Bái thuộc nhóm 16SrI nằm nhóm phụ hoàn toàn mới, chưa công bố Áp dụng thành công kỹ thuật nhuộm mô DAPI để phát phytoplasma hại sắn Việt Nam Thiết kế thành công mồi LAMP-PCR đặc hiệu để xác định phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn Đông Nam Bộ Đề xuất quy trình chẩn đoán phytoplasma hại sắn cho số tỉnh Đông Nam Bộ Cung cấp dẫn liệu khoa học số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây Xác định đường lan truyền bệnh qua nhân giống vô tính bị nhiễm bệnh 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học Đã xác định phytoplasma nguyên nhân gây bệnh chổi phù thuỷ hại sắn Đông Nam Bộ, phân loại phytoplasma hại sắn Việt Nam thuộc nhóm 16SrI 16SrII Đã ứng dụng thành công kỹ thuật để chẩn đoán, phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy sắn kính hiển vi điện tử, kỹ thuật nhuộm mô DAPI, kỹ thuật PCR lồng, kỹ thuật RFLP, kỹ thuật LAMP-PCR Xác định đường lan truyền phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy sắn Đông Nam Bộ chủ yếu qua nhân giống vô tính 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Xác định phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy sắn, xác định đường lan truyền chủ yếu phytoplasma hại sắn góp phần đưa biện pháp quản lý bệnh chổi phù thuỷ cách có hiệu điều kiện sản xuất số tỉnh Đông Nam Bộ Biện pháp quan trọng để quản lý bệnh phát bệnh sớm sử dụng giống bệnh PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 CÂY SẮN Cây sắn có nguồn gốc vùng nhiệt đới châu Mỹ trồng cách 5.000 - 7.000 năm trước Công nguyên (Allem, 2002) Về phân loại, sắn có tên khoa học Manihot esculenta Crantz, thuộc chi Manihot, họ Euphorbiaceae (Howeler et al., 2013) Sắn có nhiều công dụng chế biến công nghiệp, thức ăn gia súc lương thực - thực phẩm Củ sắn chứa nhiều tinh bột nên thường chế biến thành bột sắn khô Trong củ sắn tươi có chứa đến 80% hàm lượng carbonhydrate, canxi (50 mg/100 g), phốtpho (40 mg/100 g), vitamin (25 mg/100 g) chất dinh dưỡng khác Lá sắn nguồn cung cấp protein, có chứa nhiều axít amin cần thiết thiếu lysine, methionine tryptophan (Ravindran, 1992) Diện tích, suất sản lượng sắn toàn giới giai đoạn 10 năm từ năm 1999 đến năm 2009 tăng, số vào năm 1999 16,85 triệu ha; 10,09 tấn/ha 170,01 triệu tấn, đến năm 2009 số 18,92 triệu ha; 12,36 tấn/ha 233,80 triệu (FAOSTAT, 2014) Năng suất sắn củ tươi bình quân giới đạt 12,38 tấn/ha vào năm 2009 Ấn Độ nước có suất sắn cao giới (34,36 tấn/ha), Thái Lan (22,68 tấn/ha) Indonesia (18,74 tấn/ha) Thái Lan nước xuất sắn khô lớn nhất, chiếm 77% sản lượng xuất giới năm 2005 Nước xuất sắn khô lớn thứ hai Việt Nam (13,6%), In-đô-nê-xi-a (5,8%) Costa Rica (2,1%) (FAOSTAT, 2014) Theo số liệu Tổng cục Thống kê (2014), diện tích sắn Việt Nam vào năm 1995 có khoảng 277,4 nghìn với sản lượng 2211,5 nghìn tấn; số đến năm 2012 551,9 nghìn 9735,4 nghìn Năm 2011, diện tích trồng sắn cao (558,4 nghìn ha), với sản lượng cao (9897,9 nghìn tấn) 2.2 PHYTOPLASMA HẠI THỰC VẬT Hiện nay, phân loại, tất phytoplasma xếp vào chi ‘Candidatus Phytoplasma’ (‘Ca Phytoplasma’), Acholeplasmatales, lớp Mollicutes, ngành Firmucutes (IRPCM, 2004; Hogenhout et al., 2008) Dựa sở so sánh chuỗi gen mã hóa 16S RNA ribosome, loài thuộc chi ‘Ca Phytoplasma’ xếp vào 33 nhóm phả hệ khác (ký hiệu từ 16SrI đến 16SrXXXIII) Phytoplasma tác nhân gây bệnh nhiễm hệ thống, giới hạn mạch phloem, nên truyền qua nhân giống vô tính ghép, củ giống, hom giống, thân ngầm, đường lan truyền quan trọng, xem quan trọng loài nhân giống vô tính Tuy nhiên, phytoplasma không truyền qua tiếp xúc học phytoplasma đưa vào tế bào biểu bì nhu mô chúng khả di chuyển xuống tế bào ống rây mạch phloem (Lee et al., 2000; Christensen et al., 2005; Duduk and Bertaccini, 2006) Tơ hồng (Cuscutas spp.) loại thực vật diệp lục ký sinh thực vật Vì có đặc điểm ký sinh đặc biệt nên tơ hồng truyền dễ dàng phytoplasma thường sử dụng loại vector hiệu để truyền phytoplasma sang thí nghiệm (Přibylová and Špak, 2013) Phytoplasma không xem tác nhân gây bệnh truyền qua hạt (Lee et al., 2000) Các nghiên cứu rằng, phytoplasma phát thấy vỏ hạt truyền sang (Faghihi et al., 2011) Các nghiên cứu lan truyền chứng tỏ côn trùng chích hút môi giới quan trọng bệnh phytoplasma nhiễm trồng từ hạt Tất loài côn trùng môi giới phytoplasma thuộc Hemiptera Các loài côn trùng thuộc Hemiptera có hành vi chích hút đa dạng, có nhóm chích hút mạch phloem, có nhóm chích hút mạch xylem Do phytoplasma giới hạn mạch phloem nên nhóm côn trùng chích hút loại mô có khả truyền chúng (Wilson and Weintraub, 2007) Hiện có 102 loài côn trùng chích hút Hemiptera xác định côn trùng môi giới phytoplasma, phần lớn thuộc họ Rầy xanh (Cicadellidae) Phytoplasma nuôi cấy môi trường nhân tạo nên chẩn đoán loại tác nhân gây bệnh phức tạp Chính vậy, bệnh phytoplasma, triệu chứng, nhiều biện pháp chẩn đoán khác thường sử dụng gồm nhóm (i) chẩn đoán trực tiếp phytoplasma tế bào vi điện tử nhuộm mô thuốc nhuộm huỳnh quang; (ii) chẩn đoán gián tiếp phân tích phân tử phản ứng trùng hợp chuỗi acid nucleic (polymerase chain reaction, PCR), giải trình tự Để phòng chống bệnh phytoplasma gây hại trồng, biện pháp sau thường áp dụng sản xuất: i) Chọn giống chống bệnh, sử dụng bệnh; ii) Nhổ bỏ, tiêu hủy tàn dư bệnh, kết hợp với vệ sinh đồng ruộng; iii) Không vận chuyển, trao đổi hom giống từ vùng bị bệnh đến vùng chưa bị bệnh, hay vùng trồng Tổ chức sản xuất kiểm tra giống bệnh trước trồng; iv) Tiêu diệt côn trùng môi giới truyền bệnh (nếu có) số trường hợp, xử lý hom giống nước nóng nước nóng 2.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH PHYTOPLASMA HẠI SẮN Bệnh phytoplasma hại sắn phát thấy nhiều vùng giới vùng Wallis-Futuna, Uganda, Cuba; số nước thuộc châu Mỹ Bra-xin, Cô-lôm-bia, Costa Rica, Peru, Panama, Venezuela; số nước thuộc châu Á Việt Nam, Thái Lan, Cam-pu-chia Trung Quốc Phytoplasma hại sắn xác định liên quan đến bệnh chổi phù thuỷ (Frison and Feliu, 1991; Davis et al., 2005; Alvarez et al., 2013; Flôres et al., 2013; Alvarez et al., 2014), bệnh biến vàng (Arocha et al., 2009a, 2009b) bệnh da cóc (Alvarez et al., 2009; Souza et al., 2014; Oliveira et al., 2014) Cho đến nay, có dạng triệu chứng bệnh phytoplasma hại sắn giới mô tả, bao gồm: i) Bệnh chổi phù thuỷ (witches’ broom), ii) Bệnh biến vàng (yellowing), iii) Bệnh da cóc (frog skin) Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn ghi nhận lần đầu bang Ceara, Pernambuco, Sao Paula thuộc Brazil phía nam Mê-hicô Lúc đó, tác nhân gây bệnh xác định phytoplasma gây (Costa and Kitajima, 1972); bệnh xác định lan truyền qua hom giống không lan truyền qua tiếp xúc học Hiện giới, phytoplasma hại sắn phân loại vào nhóm khác dựa giải trình tự vùng gen 16S RNA ribosome Các nhà khoa học, chuyên gia bệnh Trung tâm Nông nghiệp nhiệt đới Quốc tế (CIAT), Đại học Bologna (I-ta-li-a), nước khác Bra-xin, Cuba, Cô-lôm-bi-a, Ốt-xtrây-li-a, xác định nguyên nhân gây bệnh phytoplasma hại sắn dựa chủ yếu vào kỹ thuật sinh học phân tử; việc xác định số đặc trưng sinh học bệnh hạn chế, 43 năm qua (từ năm 1972 đến 2015), việc xác định loài côn trùng có khả lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn chưa tìm thấy 2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU BỆNH PHYTOPLASMA HẠI THỰC VẬT Ở VIỆT NAM Ở Việt Nam, nghiên cứu bệnh phytoplasma gây hại trồng Nghiên cứu mức giải trình tự gen phytoplasma nghiên cứu nhà khoa học Anh Mỹ thực xoan ta (Melia azedarach) bị bệnh biến vàng thu thập Huế năm 2003 Đến nay, số phytoplasma xác định mức giải trình tự gen nhà nghiên cứu Việt Nam thực hiện, phát tác nhân gây bệnh chồi cỏ mía, bệnh trắng mía phytoplasma gây (Hoat et al., 2012, 2013); bệnh diệp hóa vừng, bệnh chổi phù thuỷ đậu tương số bệnh số loài khác phytoplasma gây (Nguyễn Đức Thành cs., 2012, 2013, 2014) PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Vật liệu, thiết bị hóa chất nghiên cứu Các giống sắn KM94, KM419 SM937-26 Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR, máy huỳnh quang, máy li tâm để bàn, máy cắt tiêu bản, cân điện tử, bể nhiệt Hóa chất dùng phản ứng PCR Hóa chất dùng phản ứng LAMP-PCR Các hóa chất khác: agarose, chloroform/isoamyl alcohol (24/1), glutaraldehyde,…có nguồn gốc từ hãng Wako (Nhật Bản), Fermentas (Đức) 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu  Viện Bảo vệ thực vật, Bắc Từ Liêm, thành phố Hà Nội  Trung tâm Nghiên cứu Bệnh nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội  Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc xã Hưng Thịnh, huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai 3.1.3 Thời gian nghiên cứu Đề tài thực từ năm 2011 đến năm 2014 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn - Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mô PCR - Định danh phân tử phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn - Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn - Xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phát phytoplasma sắn kính hiển vi điện tử truyền qua máy JEOL 1010 nhuộm với DAPI - DNA tổng số tách chiết CTAB theo tài liệu mô tả Doyle and Doyle (1990) Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp Kết kiểm tra PCR cho thấy 35/57 (61,4%) mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ thu tỉnh gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Quảng Ngãi, Đồng Nai, Kon Tum, Bình Phước, Phú Thọ Yên Bái tạo sản phẩm PCR với kích thước mong muốn ~1,2 kb (hình 4.1) Các mẫu thử gân sắn nhiễm bệnh, đó, mẫu thử lõi thân chính, vỏ thân chính, vỏ củ sắn nhiễm bệnh không tạo sản phẩm PCR điện di (22/57 mẫu thử, chiếm 38,6%) 4.1.3.2 Phát phytoplasma kỹ thuật PCR lồng với cặp mồi R16mF2/R16mR1 Một thí nghiệm PCR bổ sung nhằm phát phytoplasma mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ thu thập số tỉnh khác có tỉnh thuộc Đông Nam Bộ Phản ứng PCR lồng thực dùng tổ hợp mồi P1/P7 (bước 1) R16mF2/R16mR1 (bước 2) sử dụng nhằm phát phytoplasma gây hại sắn bị bệnh chổi phù thuỷ Kết kiểm tra PCR lồng dùng hai cặp mồi P1/P7 R16mF2/R16mR1 26 mẫu sắn bệnh cho thấy 20/26 (76,9%) mẫu thử tạo sản phẩm PCR với kích thước mong muốn ~1,4 kb Cần ý có 14 mẫu kiểm tra thí nghiệm (gồm mẫu: BRVT-01, BRVT-02, BRVT-03, QNg-01, QNg-02, QNg-03, ĐN-01, ĐN-02, ĐN03, KT-01, KT-02, KT-03, YB-01 YB-02) mẫu kiểm tra với cặp mồi P1/P7-R16F2n/R16R2 Nghiên cứu phần này, dựa kỹ thuật chẩn đoán truyền thống PCR, lần xác định có mặt phytoplasma sắn bị bệnh chổi phù thuỷ Việt Nam, đặc biệt vùng trồng sắn trọng điểm bị dịch bệnh chổi phù thuỷ Đông Nam Bộ Kết kiểm tra PCR gợi ý có đa dạng trình tự gen mã hóa 16S RNA ribosome phytoplasma nhiễm mẫu 4.2 ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHYTOPLASMA HẠI SẮN 4.2.1 Kết định danh giải trình tự sản phẩm PCR Trong tổng số 83 sản phẩm PCR từ 67 mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ thu tỉnh giải trình tự, cuối thu 19 mẫu có chất lượng trình tự tốt Tìm kiếm trình tự tương đồng Ngân hàng 11 Gen phần mềm BLAST cho thấy tất 19 mẫu có trình tự trùng khớp với trình tự gen mã hóa 16S RNA ribosome phytoplasma gây bệnh Do đó, khẳng định nguyên nhân gây bệnh chổi phù thuỷ sắn Việt Nam phytoplasma gây Ngoài ra, kết giải trình tự tìm kiếm BLAST cho thấy mồi chung P1, P7, R16F2n, R16R2, R16mF2 R16mR2 có tính đặc hiệu cao chẩn đoán bệnh phytoplasma sắn Việt Nam Trình tự 19 mẫu có độ dài phù hợp, đủ để phân tích định danh dựa so sánh trình tự, phân tích đa hình RFLP phả hệ, đăng ký Ngân hàng Gen 4.2.2 Kết định danh kỹ thuật RFLP Phân tích RFLP mô (virtual RFLP) công cụ phân loại định danh hữu hiệu phytoplasma Kỹ thuật thực số phần mềm pDRAW32 cho phép so sánh mô hình cắt gồm 17 enzym cắt giới hạn khác trình tự gen mã hóa 16S RNA ribosome (Lee et al., 2000) Có enzym cắt AluI, BfaI, HaeIII, HpaII, KpnI, MseI, RsaI, Sau96I TaqI cho kết sai khác, phân biệt rõ ràng mô hình cắt phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (12/25 mẫu) so với nhóm 16SrII (11/25 mẫu), so với nhóm 16SrIIII (1/25 mẫu) so với nhóm 16SrXV (1/25 mẫu) Enzym KpnI, MseI RsaI coi enzym khóa để phân biệt nhóm phytoplasma khác Đối với mô hình cắt phytoplasma thuộc nhóm 16SrI, enzym KpnI tạo vạch băng có kích thước khoảng 42, 188 473 bp điện di Còn enzym MseI tạo vạch băng có kích thước khoảng 41, 45, 56, 265 288 bp điện di; enzym RsaI tạo vạch băng có kích thước khoảng 16, 44, 55, 73, 131 336 bp trình tự thuộc nhóm 16SrI sai khác hẳn so với nhóm 16SrII, 16SrIII 16SrXV Dựa mức tương đồng di truyền mẫu, mối quan hệ di truyền mẫu xác định dùng phần mềm NTSYSpc với khoảng cách di truyền xác định theo phương pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang (unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA) (hình 4.2) 12 Dựa mô hình cắt mẫu, mức tương đồng di truyền 26 mẫu xác định dựa phân tích hệ số tương đồng Nei and Li (1979) Hình 4.2 Cây đƣợc vẽ theo phƣơng pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang (UPGMA) Kết phân tích cho thấy mẫu phytoplasma hại sắn Việt Nam, BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17 ĐN-34, BP-01, ĐN02 YB-02, có hệ số tương đồng gần gũi với mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (mã truy cập M30790 AY787139), từ 77% đến 100% Trên phả hệ, mẫu phân nhóm với mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrI-A 16SrI-B Phân tích cho thấy mẫu phytoplasma hại sắn Việt Nam, BRVT-02, QNg-19.2, BR-5, BR-7.2, BR-9.1, T7-ĐN, T11-QNg, T18-TN T19-BRVT, có hệ số tương đồng gần gũi với mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrII, nhóm phụ 16SrII-A (mã truy cập JQ957931 L33765), với giá trị từ 94% đến 100% Tương tự, 13 phả hệ, mẫu phân nhóm rõ ràng với mẫu phytoplasma nhóm 16SrII, nhóm phụ 16SrII-A Đáng ý, mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 Yên Bái có quan hệ gần gũi với mẫu nhóm 16SrI có hệ số tương đồng thấp với mẫu phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI, từ 63% đến 78% Phân tích cho thấy mẫu YB-01 thuộc nhóm phụ nhóm 16SrI Như vậy, phân tích RFLP mô dùng 17 enzym cắt giới hạn xác định phytoplasma hại sắn Việt Nam gồm nhóm, 16SrI 16SrII 4.3 ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHYTOPLASMA HẠI SẮN 4.3.1 Kết định danh phân tích đồng trình tự nucleotide Ngoài phân tích RFLP mô phỏng, tiến hành so sánh mức đồng trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome 26 mẫu phytoplasma thử nghiệm Kết phân tích cho thấy mẫu phytoplasma hại sắn Việt Nam, BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17 ĐN-34, BP-01, ĐN02 YB-02, có mức đồng trình tự nucleotide gần gũi với mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (mã truy cập M30790 AY787139), với giá trị từ 98% đến 100% Phân tích cho thấy mẫu phytoplasma hại sắn Việt Nam, BRVT-02, QNg-19.2, BR-5, BR-7.2, BR-9.1, T7-ĐN, T11-QNg, T18-TN T19-BRVT, có mức đồng trình tự nucleotide gần gũi với mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrII, nhóm phụ 16SrII-A (mã truy cập JQ957931 L33765), với giá trị từ 99% đến 100% 4.3.2 Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trình tự nucleotide 4.3.2.1 Phân tích phả hệ nhóm phytoplasma hại sắn Nhằm hiểu rõ mối quan hệ mẫu phytoplasma hại sắn với phytoplasma khác, phân tích phả hệ dựa trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome xác định Đầu tiên, quan hệ phả hệ 19 mẫu nghiên cứu phân tích với đại diện 28 nhóm phytoplasma ghi nhận (hình 4.3) 14 Hình 4.3 Cây phả hệ xác định nhóm phytoplasma hại sắn đƣợc vẽ theo phƣơng pháp Neighbor-Joining  Trình tự phytoplasma hại sắn Việt Nam xác định nghiên cứu Giá trị bootstrap (%) rõ gốc nhánh Tên nhóm phytoplasma phía bên tay phải 15 Kết phân tích phả hệ cho thấy có 10/19 (52,6%) mẫu phytoplasma hại sắn Việt Nam nghiên cứu này, BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17 ĐN-34, BP-01, ĐN-02, YB-01 YB-02, phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap 97%) với tất mẫu phytoplasma nhóm 16SrI gồm phytoplasma hại sắn (AY787139) Wallis - Futuna, hại cúc tây (NC_007716, M30790) Hoa Kỳ Tương tự kết phân tích RFLP mô trên, mẫu YB-01 hình thành nhánh riêng biệt cụm nhóm 16SrI Cả 9/19 (47,4%) mẫu phytoplasma hại sắn Việt Nam lại phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap 97%) với đại diện phytoplasma nhóm 16SrII gồm phytoplasma hại sắn Trung Quốc (JQ957931), hại lạc Đài Loan (L33765) Như vậy, phân tích phả hệ dựa trình tự cho kết tương tự với phân tích RFLP mô so sánh trình tự Các mẫu phytoplasma hại sắn Việt Nam xếp vào nhóm phytoplasma gồm nhóm 16SrI 16SrII hệ thống phân loại phytoplasma (Lee et al., 1998; Bertaccini et al., 2014) 4.3.2.2 Phân tích phả hệ nhóm phụ phytoplasma thuộc nhóm 16SrI Tiếp theo, nhằm làm rõ vị trí phân loại, xác định nhóm phụ mẫu phytoplasma nhóm 16SrI hại sắn, sử dụng 10 mẫu phytoplasma hại sắn Việt Nam thuộc nhóm 16SrI nghiên cứu phân tích với 29 mẫu đại diện 16 nhóm phụ xác định (hình 4.4) Kết phân tích phả hệ cho thấy, có 9/10 mẫu (90%) gồm BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17, ĐN-34, BP-01, ĐN-02 YB-02, phân nhóm rõ rệt, cụm với phytoplasma gây bệnh biến vàng cúc tây (M30790, EU215426, AY265210), lục hóa dừa cạn (HM590621), biến vàng gân báo xuân (HM590623), lục hóa cải dầu (HM590625), lục hóa anh thảo (HM590616) chúng thuộc nhóm phụ B (16SrI-B) 16 Hình 4.4 Cây phả hệ xác định nhóm phụ phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI  Trình tự phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI Việt Nam Tên viết tắt, mã truy cập Ngân hàng Gen nằm dấu ngoặc đơn 17 4.3.2.3 Phân tích phả hệ nhóm phụ phytoplasma thuộc nhóm 16SrII Tiếp theo, nhằm làm rõ vị trí phân loại, xác định nhóm phụ mẫu phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn, sử dụng mẫu phytoplasma hại sắn Việt Nam thuộc nhóm 16SrII nghiên cứu phân tích với mẫu đại diện nhóm phụ xác định hệ thống phân loại phytoplasma Lee et al (1998), Bertaccini et al (2014) Kết trình bày hình 4.5 Hình 4.5 Cây phả hệ xác định nhóm phụ phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII  Trình tự phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII Việt Nam Tên viết tắt, mã truy cập Ngân hàng Gen nằm dấu ngoặc đơn Kết phân tích phả hệ cho thấy, tất 9/9 phytoplasma hại sắn Việt Nam, gồm BRVT-02, QNg-19.2, BR-5, BR-7.2, BR-9.1, T7ĐN, T11-QNg, T18-TN T19-BRVT, phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap 99%) với đại diện phytoplasma nhóm 16SrII gồm phytoplasma hại sắn Trung Quốc (JQ957931), hại lạc Đài Loan (L33765), chúng thuộc nhóm phụ A (16SrII-A) 18 Dựa kết định danh kỹ thuật RFLP, xác định mức tương đồng di truyền dựa phân tích hệ số tương đồng, định danh phân tích đồng trình tự nucleotide phân tích phả hệ phytoplasma dựa trình tự nucleotide, nghiên cứu xác định phytoplasma hại sắn Việt Nam gồm nhóm, 16SrI 16SrII 4.4 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAMP-PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN PHYTOPLASMA NHÓM 16SrII HẠI SẮN 4.4.1 Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII Sau xác định vùng phù hợp để thiết kế mồi, sử dụng trình tự gen 16S RNA ribosme mẫu phytoplasma đại diện nhóm 16SrII làm khuôn để thiết kế mồi Dựa yếu tố chủ chốt nhiệt độ tách mồi, độ ổn định đầu 3’, hàm lượng GC cấu trúc thứ cấp, trình tự tốt vùng gen đích mẫu T7-ĐN (KM280679) chọn (hình 4.6) Hình 4.6 Tám đoạn trình tự đƣợc lựa chọn để thiết mồi LAMP cải tiến đặc hiệu nhóm 16SrII Dựa trình tự lựa chọn trên, mồi LAMP thiết kế; mồi LAMP-PCR thiết kế gồm CWB-F3, CWB-B3, CWB-FIP, CWB-BIP, CWB-F-loop, CWB-B-loop tổng hợp hãng Macrogen (Hàn Quốc) chúng ứng dụng để đánh giá khả phát phytoplasma thuộc nhóm 16SrII hại sắn Đông Nam Bộ 19 4.4.2 Đánh giá khả phát phytoplasma mồi LAMP Trước tiên, thử nghiệm khả phân biệt nhóm phytoplasma gây hại sắn mồi LAMP tự thiết kế DNA tổng số mẫu sắn bệnh chổi phù thuỷ với phytoplasma gây bệnh xác định trước PCR giải trình tự sử dụng để kiểm tra mồi LAMP (bảng 4.1) Bảng 4.1 Phản ứng LAMP phát phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số chiết từ STT Mẫu thử DNA tổng số sắn bệnh chổi phù thuỷ DNA tổng số sắn bệnh chổi phù thuỷ DNA tổng số sắn bệnh chổi phù thuỷ DNA tổng số sắn bệnh chổi phù thuỷ DNA tổng số sắn khỏe (đối chứng) Nước siêu Invitrogen (đối chứng) Nhóm phytoplasma* 16SrII 16SrI 16SrII 16SrII Kết LAMP** + – + + – – Ghi chú: * Nhóm mẫu kiểm tra xác định PCR lồng giải trình tự; ** (–) phản ứng âm tính; (+) phản ứng dương tính Kết kiểm tra cho thấy, mồi LAMP cho kết dương tính mẫu DNA tổng số chiết CTAB từ sắn bị nhiễm với phytoplasma nhóm 16SrII Các mồi cho kết âm tính mẫu bị nhiễm phytoplasma nhóm 16SrI đối chứng khỏe nước siêu (Invitrogen) Tương tự, mồi LAMP tự thiết kế thử nghiệm với mẫu thử sản phẩm PCR tinh (dùng QIAquick gel extraction kit, GmbH) nhân lên từ nguồn sắn bị bệnh chổi phù thuỷ Các mẫu kiểm tra xác định thuộc nhóm 16SrII giải trình tự (bảng 4.2) Bảng 4.2 Phản ứng LAMP phát phytoplasma nhóm 16SrII từ sản phẩm PCR tinh STT Mẫu thử* Sản phẩm PCR tinh Sản phẩm PCR tinh Sản phẩm PCR tinh Sản phẩm PCR tinh DNA tổng số sắn khỏe (đối chứng) Nước Invitrogen (đối chứng) Nhóm phytoplasma** 16SrII 16SrII 16SrII 16SrII Kết LAMP*** + + + + – – Ghi chú: * Phản ứng PCR lồng thực dùng cặp mồi R16mF1/R16mR1; ** Nhóm mẫu kiểm tra giải trình tự; *** (–) phản ứng âm tính; (+) phản ứng dương tính 20 Kết kiểm tra (bảng 4.2) cho thấy mồi LAMP cho kết dương tính mẫu sản phẩm PCR tinh từ sắn bị nhiễm với phytoplasma nhóm 16SrII Các mồi cho kết âm tính đối chứng khỏe nước siêu (Invitrogen) Như vậy, mồi LAMP có khả phát phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số từ sản phẩm PCR tinh Như vậy, kết thí nghiệm cho thấy mồi LAMP thiết kế hoàn toàn phát phytoplasma nhóm 16SrII gây hại sắn đồng ruộng Đây kết sử dụng kỹ thuật LAMP chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII gây hại sắn Việt Nam 4.5 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BỆNH CHỔI PHÙ THUỶ HẠI SẮN DO PHYTOPLASMA GÂY RA 4.5.1 Ảnh hƣởng đất hom giống đến khả lan truyền bệnh Bằng phương pháp nhân giống vô tính, sắn chủ yếu lấy từ phần thân để làm hom giống Việc sử dụng hom giống không bị bệnh điều quan trọng, điều góp phần kiểm soát nguồn vật liệu giống ban đầu, tránh cho bệnh lây lan nhanh đồng ruộng Hom giống sắn KM94 nhiễm bệnh (kiểm tra PCR cho kết dương tính với phytoplasma) hom giống sắn KM94 khoẻ dùng thí nghiệm, tiến hành khử trùng đất nước nóng 121oC thời gian 30 phút lấy đất ruộng trồng có sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ phần gốc (bảng 4.3) Bảng 4.3 Ảnh hƣởng đất trồng hom giống đến khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn (Đồng Nai, năm 2012) STT Công thức thí nghiệm* CT1: Trồng hom sắn bị bệnh chổi phù thuỷ đất hấp khử trùng CT2: Trồng hom sắn khoẻ đất trồng có sắn bị bệnh chổi phù thuỷ CT3: Trồng hom sắn bị bệnh chổi phù thuỷ đất trồng có sắn bị bệnh chổi phù thuỷ CT4: Trồng hom sắn khỏe đất hấp khử trùng Tỷ lệ phát bệnh sau tháng (%) 43,3 Kiểm tra PCR (số nhiễm/số thử) 5/5 Kết luận PCR + 0,0 0/5  56,7 5/5 + 0,0 0/5  Ghi chú: * n = 30 cây; (–) phản ứng âm tính; (+) phản ứng dương tính; LSD0,05 = 7,12 21 Hom sắn KM94 bệnh trồng đất hấp khử trùng đất trồng có sắn bị bệnh chổi phù thuỷ thể triệu chứng chổi phù thuỷ xuất gây hại, ngược lại hom sắn KM94 khỏe trồng hai loại đất không xuất triệu chứng bệnh Tỷ lệ bệnh cao công thức (17/30 cây), công thức (13/30 cây) Để khẳng định chắn nữa, sử dụng kỹ thuật PCR lồng cặp mồi phát phytoplasma gây hại sắn phần trình bày trên, công thức kiểm tra cây, kết kiểm tra cho thấy rằng, có hom sắn KM94 khoẻ trồng đất hấp khử trùng (5/5) đất trồng có sắn bị bệnh chổi phù thuỷ (5/5) cho kết PCR dương tính Các kết nghiên cứu cho biết rằng, phytoplasma tác nhân gây bệnh nhiễm hệ thống, giới hạn mạch phloem, nên truyền qua nhân giống vô tính ghép, củ giống, hom giống, thân ngầm đường lan truyền quan trọng, xem quan trọng loài nhân giống vô tính (Lee et al., 2000; Christensen et al., 2005; Duduk and Bertaccini, 2006) Như vậy, bệnh phytoplasma gây hại sắn KM94 lan truyền qua nhân giống vô tính từ bị nhiễm bệnh thí nghiệm chậu vại Hình 4.7 Ảnh thí nghiệm ảnh hƣởng đất trồng đến khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ sắn thí nghiệm nhà lƣới (năm 2012) A) Giống sắn KM94 khỏe trồng đất hấp khử trùng (công thức 4); B) Giống sắn KM94 nhiễm bệnh chổi phù thuỷ sắn trồng đất hấp khử trùng (công thức 1) 4.5.2 Khả lan truyền bệnh qua tơ hồng Tơ hồng (Cuscutas spp.) dùng làm vật liệu thí nghiệm nghiên cứu bệnh hại thực vật, coi vật trung gian để xác định bệnh hại, có bệnh phytoplasma Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) coi thị nghiên cứu bệnh phytoplasma gây loài 22 mẫn cảm với tác nhân gây bệnh phytoplasma dùng làm trì, nhân nguồn nghiên cứu bệnh Cây dừa cạn trồng từ hạt để thu nguồn làm thí nghiệm Sử dụng giống sắn KM94 bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ Đồng Nai làm nguồn bệnh (bảng 4.4) Bảng 4.4 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng (Đồng Nai, năm 2012) STT Công thức thí nghiệm* Tỷ lệ Kiểm tra PCR phát bệnh sau (số tháng (%) nhiễm/số thử) CT1: KM94 bệnh chổi phù 13,3 2/5 thuỷ - Tơ hồng - KM94 khỏe CT2: KM94 bệnh chổi phù 26,7 4/5 thuỷ - Tơ hồng - Cây dừa cạn khỏe CT3: KM94 khỏe - Tơ 0,0 0/5 hồng – KM94 khỏe Kết luận PCR + +  Ghi chú: * n = 15 cây; (–) phản ứng âm tính; (+) phản ứng dương tính; LSD0,05 = 2,80 Kết thí nghiệm (bảng 4.4) cho thấy tơ hồng bám dính tốt lên thí nghiệm Tuy nhiên, triệu chứng bệnh lâu xuất (9 tháng) tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, lan truyền từ sắn bệnh qua tơ hồng lên sắn khỏe 13,3% (2/15 bị nhiễm bệnh), lan truyền từ sắn bệnh qua tơ hồng lên dừa cạn (C roseus) khỏe 26,7% (4/15 bị nhiễm bệnh) cho kết PCR dương tính Tiến hành giải trình tự mẫu sắn nhiễm bệnh (công thức 1) mẫu dừa cạn nhiễm (công thức 2) sản phẩm PCR lồng (R16F2n/R16R2) tìm kiếm chuỗi tương đồng công cụ trực tuyến BLAST Ngân hàng Gen cho thấy trình tự nucleotide từ sản phẩm PCR mẫu bệnh phân lập mẫu sắn mẫu dừa cạn chuỗi mã hóa 16S RNA ribosome phytoplasma gây bệnh cây, có mẫu phytoplasma gây hại sắn PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây phát tỉnh gồm Bà Rịa-Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình 23 Phước, Tây Ninh, Quảng Ngãi, Kon Tum, Phú Thọ Yên Bái Triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ xuất giai đoạn sinh trưởng phát triển sắn nhiều giống sắn khác gồm KM60, KM94, KM140, KM419 Loại hình triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ gây hại sắn giống điểm điều tra Cây nhiễm bệnh giai đoạn thường sinh trưởng kém, chí dẫn đến chết Cây nhiễm bệnh giai đoạn muộn có suất củ tươi, suất tinh bột thấp so với không nhiễm bệnh Tỷ lệ nhiễm bệnh chổi phù thuỷ đạt thấp (5,7%) giống sắn KM94 giai đoạn chờ thu hoạch huyện Sơn Hà, tỉnh Quảng Ngãi tỷ lệ bệnh cao (60,2%) giống sắn KM419 giai đoạn huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai 2) Sử dụng phương pháp kính hiển vi điện tử, kỹ thuật nhuộm mô với DAPI hay phương pháp PCR với cặp mồi P1/P7 R16mF2/R16mR1 cặp mồi P1/P7-R16F2n/R16R2 phát hiện, chẩn đoán phytoplasma gây bệnh chổi phủ thủy sắn 3) Bằng kỹ thuật RFLP, phân tích trình tự nucleotide phân tích phả hệ dựa gen 16S RNA ribosome xác định phytoplasma hại sắn Đông Nam Bộ thuộc nhóm gồm 16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A) Mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 (KM360166) Yên Bái thuộc nhóm 16SrI nằm nhóm phụ hoàn toàn mới, chưa công bố 4) Thiết kế mồi LAMP-PCR đặc hiệu để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn, mồi áp dụng để phát phytoplasma nhóm 16SrII sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ đồng ruộng 5) Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây lan truyền chủ yếu thông qua việc sử dụng hom giống bị nhiễm bệnh làm vật liệu nhân giống vô tính, đồng thời, bệnh truyền qua phương pháp ghép qua tơ hồng, chưa phát thấy loài côn trùng có khả lan truyền bệnh 5.2 KIẾN NGHỊ Sử dụng mồi LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn Không dùng sắn bị nhiễm bệnh để làm vật liệu nhân giống vô tính; cần nghiên cứu tuyển chọn giống sắn có khả kháng bệnh phytoplasma có tiềm năng suất cao 24 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ Trịnh Xuân Hoạt, Nguyễn Đức Thành, Ngô Gia Bôn, Mai Văn Quân Vũ Duy Hiện (2012) Phát xác định phytoplasma liên quan đến bệnh chổi rồng hại sắn số tỉnh phía Nam Việt Nam Tạp chí Bảo vệ thực vật tr 10-14 Nguyễn Đức Thành, Mai Văn Quân, Ngô Gia Bôn, Nguyễn Hữu Hỷ, Hà Viết Cường Trịnh Xuân Hoạt (2014) Đặc điểm sinh học bệnh chổi rồng sắn Đồng Nai năm 2011-2013 Tạp chí Khoa học Phát triển 12 (3) tr 325-333 Nguyễn Đức Thành, Trịnh Xuân Hoạt, Mai Văn Quân Hà Viết Cường (2015) Xác định phytoplasma nhóm 16SrII-A gây hại sắn Đông Nam Bộ kỹ thuật PCR, RFLP Tạp chí Bảo vệ thực vật 2.tr 42-49 [...]... hiện phytoplasma bằng kỹ thuật PCR lồng với cặp mồi R16mF2/R16mR1 Một thí nghiệm PCR bổ sung nhằm phát hiện phytoplasma trên các mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ được thu thập tại một số tỉnh khác nhau trong đó có các tỉnh thuộc Đông Nam Bộ Phản ứng PCR lồng được thực hiện dùng 2 tổ hợp mồi là P1/P7 (bước 1) và R16mF2/R16mR1 (bước 2) cũng được sử dụng nhằm phát hiện phytoplasma gây hại trên cây sắn bị bệnh. .. phytoplasma gây hại trên sắn của bộ mồi LAMP tự thiết kế DNA tổng số của 4 mẫu cây sắn bệnh chổi phù thuỷ với phytoplasma gây bệnh được xác định trước bằng PCR và giải trình tự đã được sử dụng để kiểm tra bộ mồi LAMP (bảng 4.1) Bảng 4.1 Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số chiết từ cây STT Mẫu thử 1 2 3 4 5 6 DNA tổng số cây sắn bệnh chổi phù thuỷ 1 DNA tổng số cây sắn bệnh chổi... thể phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII gây hại trên cây sắn ngoài đồng ruộng Đây là kết quả đầu tiên sử dụng kỹ thuật LAMP chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII gây hại trên cây sắn tại Việt Nam 4.5 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BỆNH CHỔI PHÙ THUỶ HẠI SẮN DO PHYTOPLASMA GÂY RA 4.5.1 Ảnh hƣởng của đất và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh Bằng phương pháp nhân giống vô tính, sắn chủ yếu được... (47,4%) mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam còn lại đã phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap 97%) với các đại diện của phytoplasma nhóm 16SrII gồm phytoplasma hại sắn tại Trung Quốc (JQ957931), hại lạc tại Đài Loan (L33765) Như vậy, phân tích phả hệ dựa trên trình tự cho kết quả tương tự với các phân tích RFLP mô phỏng và so sánh trình tự Các mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam được xếp vào 2 nhóm phytoplasma. .. 4.5.2 Khả năng lan truyền của bệnh qua tơ hồng Tơ hồng (Cuscutas spp.) được dùng làm vật liệu thí nghiệm trong nghiên cứu bệnh hại thực vật, được coi là vật trung gian để xác định bệnh hại, trong đó có bệnh phytoplasma Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) được coi là cây chỉ thị trong nghiên cứu bệnh do phytoplasma gây ra vì loài 22 cây này mẫn cảm với tác nhân gây bệnh phytoplasma và được dùng làm cây... của phytoplasma trong cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ ở Việt Nam, đặc biệt ở vùng trồng sắn trọng điểm bị dịch bệnh chổi phù thuỷ tại Đông Nam Bộ Kết quả kiểm tra PCR cũng gợi ý có sự đa dạng về trình tự gen mã hóa 16S RNA ribosome của các phytoplasma nhiễm trên các mẫu này 4.2 ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHYTOPLASMA HẠI SẮN 4.2.1 Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR Trong tổng số. .. công bố 4) Thiết kế được bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn, bộ mồi này có thể áp dụng để phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII trên cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ ở ngoài đồng ruộng 5) Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra lan truyền chủ yếu thông qua việc sử dụng hom giống đã bị nhiễm bệnh làm vật liệu nhân giống vô tính, đồng thời, bệnh cũng truyền qua... lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn (Đồng Nai, năm 2012) STT Công thức thí nghiệm* 1 CT1: Trồng hom sắn bị bệnh chổi phù thuỷ trên đất đã hấp khử trùng CT2: Trồng hom sắn khoẻ trên đất trồng có cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ CT3: Trồng hom sắn bị bệnh chổi phù thuỷ trên đất trồng có cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ CT4: Trồng hom sắn khỏe trên đất đã hấp khử trùng 2 3 4 Tỷ lệ cây phát bệnh sau 9 tháng... phloem cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ tại các tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu và Đồng Nai thuộc Đông Nam Bộ 4.1.2 Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô Kỹ thuật nhuộm mô bằng DAPI được thực hiện vào tháng 02 năm 2014 dựa theo tài liệu mô tả của Andrade and Arismendi (2013) nhằm phát hiện phytoplasma trên giống sắn KM94 bị bệnh chổi phù thuỷ (4 mẫu) và giống sắn KM94 không bị bệnh (4 mẫu) Kết quả thí... nguồn trong nghiên cứu bệnh cây Cây dừa cạn được trồng từ hạt để thu nguồn cây sạch làm thí nghiệm Sử dụng giống sắn KM94 bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ tại Đồng Nai làm nguồn bệnh (bảng 4.4) Bảng 4.4 Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng (Đồng Nai, năm 2012) STT 1 2 3 Công thức thí nghiệm* Tỷ lệ cây Kiểm tra PCR phát bệnh sau (số cây 9 tháng (%) nhiễm /số cây thử) CT1: KM94 bệnh chổi