Chuong VI Bảo quản và nhân giống vi sinh vật

Chương 6: Bảo quản nhân giống vi sinh vật Bảo quản vi sinh vật Phương pháp cấy chuyền định kỳ Phương pháp bảo quản nhiệt độ thấp Phương pháp đông khô Các phương pháp bảo quản khác  Mục đích – Nguyên tắc bảo quản giống VSV  Giống gì?  Mục đích bảo quản giống vi sinh vật: bảo tồn hoạt tính vi sinh vật theo thời gian  Nguyên tắc:   Giữ giống dạng tế bào sinh dưỡng Giữ giống dạng bào tử Phương pháp cấy chuyền định kỳ     Ứng dụng: vi khuẩn, nấm men, nấm mốc… Sử dụng môi trường đặc Điều kiện bảo quản: nhiệt độ thấp (46 oC), nơi tối Thời gian lần cấy chuyền: – tháng Phương pháp cấy chuyền định kỳ  Ưu điểm:     Đơn giản, dễ làm, rẻ tiền Phổ biến, ứng dụng cho nhiều loại vi sinh vật khác Quá trình hoạt hóa đơn giản Nhược điểm:      Chỉ thích hợp cho phòng thí nghiệm, qui mô sản xuất nhỏ Thời gian bảo quản giống ngắn Nếu cấy chuyền thường xuyên: VSV bị hoạt tính Dễ bị lây nhiễm VSV khác môi trường xung quanh Bộ sưu tập giống lớn: Phương pháp cấy chuyền định kỳ   Có thể kết hợp sử dụng dầu khoáng để kéo dài thời gian lần cấy chuyền (6 – 12 tháng) Tác dụng lớp dầu khoáng:     Hạn chế trao đổi chất VSV Tránh nhiễm khuẩn Giảm thời gian khô hóa môi trường Nhược điểm:   Kỹ thuật gieo cấy phức tạp Khi muốn sử dụng VSV : kỹ thuật phức tạp cm 30o Phương pháp cấy chuyền định kỳ   Có thể kết hợp sử dụng dầu khoáng để kéo dài thời gian lần cấy chuyền (6 – 12 tháng) Tác dụng lớp dầu khoáng:     Hạn chế trao đổi chất VSV Tránh nhiễm khuẩn Giảm thời gian khô hóa môi trường Nhược điểm:   Kỹ thuật gieo cấy phức tạp Khi muốn sử dụng VSV : kỹ thuật phức tạp Phương pháp cấy chuyền định kỳ  Bảo quản VSV nước cất: Phương pháp bảo quản nhiệt độ thấp     Ứng dụng: số vi khuẩn, virus… Sử dụng nhiệt độ: -20  40oC, -80oC -196oC Quy trình: nuôi vi sinh vật môi trường tổng hợp giàu dinh dưỡng  cho vào ampoule  hạ nhiệt độ giá trị chọn  bảo quản Chất bảo vệ (protector): phổ biến glycerol, saccharide, dimethylsulfocid,…  Cơ chế bảo vệ: Ví dụ: bổ sung Tween 20 (sodium oleate) – 0,1% vào môi trường nuôi Lactobacillus bulgaricus Phương pháp bảo quản nhiệt độ thấp  Ưu điểm:     Nhược điểm:   Rất khó bị nhiễm VSV từ môi trường Cả tế bào dinh dưỡng bảo quản phương pháp Thời gian bảo quản lâu không làm thay đổi hoạt tính VSV Rất tốn kém, đắt tiền Chú ý:   Trước sử dụng: cần làm tan giá môi trường hoạt hóa VSV Yếu tố quan trọng: tốc độ giảm nhiệt độ trình lạnh đông tốc độ tăng nhiệt độ trình tan giá Phương pháp đông khô   Ứng dụng: vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, tảo, virus… Quy trình:      Hạ nhiệt độ mẫu chứa sinh khối VSV để nước chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, Tạo áp lực chân không nâng nhiệt độ để nước chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái Độ ẩm sau sấy thăng hoa: – 6% Điều kiện bảo quản: T = – oC, môi trường khí trơ chân không cho kết tốt Trước sử dụng: cần hoạt hóa VSV  Ưu điểm:     Áp dụng nhiều nhất, tốt (vì làm thay đổi hoạt tính VSV Có thể bảo quản nhiệt độ thường Vận chuyển nhẹ nhàng, gọn nhẹ, bị nhiễm Nhược điểm:   Đắt tiền Cần trang thiết bị đại (máy sấy thăng hoa) Các phương pháp bảo quản khác  Phương pháp bảo quản vi sinh vật đất, cát, hạt ngũ cốc…  Sấy khô không khí: bảo quản số vi khuẩn, virus Đây thường loại gây bệnh  bảo quản trực tiếp vật chủ •   Ví dụ: Bảo quản môi trường silicagel: bảo quản bào tử, không bảo quản tế bào dinh dưỡng Bảo quản đất: Chú ý  Để an toàn, thường phối hợp phương pháp bảo quản lúc:      Vi khuẩn, tảo lam: cấy chuyền Protozoa: bảo quản nhiệt độ thấp với có mặt chất chống đông Vi khuẩn: • cấy chuyền • Nitơ lỏng, đông khô Virut: • virus thực vật: Sấy khô đơn giản không khí • Virus động vật: bảo quản mô động vật  đông khô Nấm men, nấm mốc: • cấy chuyền bảo quản dầu • Cấp đông, đông khô Nhân giống vi sinh vật Nguyên tắc  Sử dụng canh trường vi sinh vật khiết  Chọn môi trường lỏng/rắn có thành phần tối ưu cho sinh sản giống vi sinh vật  Chọn điều kiện nuôi tối ưu cho sinh sản giống  Tăng dần thể tích canh trường sau giai đoạn nhân giống Cách thực  giai đoạn:  Nhân giống phòng thí nghiệm: • • •  Điều kiện vô trùng Thể tích canh trường giống tăng lên đến 10L Sử dụng ống nghiệm, tủ ấm, erlenmeyer, thiết bị lắc điều nhiệt, bình nuôi cấy thủy tinh khuấy trộn điều nhiệt Nhân giống phân xưởng: • • Điều kiện vô trùng bán vô trùng Sử dụng thiết bị nhân giống có cánh khuấy phận sục khí vô trùng Các điều kiện nuôi  Nhiệt độ  pH  Sự khuấy trộn  Cung cấp oxy  Độ ẩm  Thời gian Kiểm tra chất lượng giống    Hiệu suất thu hồi sinh khối Tỉ lệ tế bào chết Hoạt tính giống