Chuong VI Bảo quản và nhân giống vi sinh vật

Bảo quản vi sinh vậtPhương pháp cấy chuyền định kỳ Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp Phương pháp đông khô Các phương pháp bảo quản khác...  Mục đích bảo quản giống vi sinh vật: b

Chương 6: Bảo quản và nhân giống vi sinh vật

1 Bảo quản vi sinh vật

Phương pháp cấy chuyền định kỳ

Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp

Phương pháp đông khô

Các phương pháp bảo quản khác

Mục đích – Nguyên tắc bảo quản giống VSV

 Giống là gì?

 Mục đích bảo quản giống vi sinh vật: bảo tồn hoạt tính của vi sinh vật theo thời gian

 Nguyên tắc:

 Giữ giống dưới dạng tế bào sinh dưỡng

 Giữ giống dưới dạng bào tử

Phương pháp cấy chuyền định kỳ

 Ứng dụng: vi khuẩn, nấm men, nấm

mốc…

 Sử dụng môi trường đặc

 Điều kiện bảo quản: nhiệt độ thấp

(4-6 oC), nơi tối

 Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền: 3 –

6 tháng

Phương pháp cấy chuyền định kỳ

 Ưu điểm:

 Đơn giản, dễ làm, rẻ tiền

 Phổ biến, ứng dụng cho nhiều loại vi sinh vật khác nhau

 Quá trình hoạt hóa đơn giản

 Nhược điểm:

 Chỉ thích hợp cho phòng thí nghiệm, qui mô sản xuất nhỏ

 Thời gian bảo quản giống ngắn

 Nếu cấy chuyền thường xuyên: VSV sẽ bị mất hoạt tính

 Dễ bị lây nhiễm các VSV khác trong môi trường xung quanh

 Bộ sưu tập giống lớn:

Phương pháp cấy chuyền định kỳ

 Có thể kết hợp sử dụng dầu

khoáng để kéo dài thời gian giữa

2 lần cấy chuyền (6 – 12 tháng)

 Tác dụng lớp dầu khoáng:

 Hạn chế sự trao đổi chất của

VSV

 Tránh nhiễm khuẩn

 Giảm thời gian khô hóa môi

trường

 Nhược điểm:

 Kỹ thuật gieo cấy phức tạp

 Khi muốn sử dụng VSV : kỹ

thuật phức tạp

1 cm

30 o

Phương pháp cấy chuyền định kỳ

 Có thể kết hợp sử dụng dầu

khoáng để kéo dài thời gian giữa

2 lần cấy chuyền (6 – 12 tháng)

 Tác dụng lớp dầu khoáng:

 Hạn chế sự trao đổi chất của VSV

 Tránh nhiễm khuẩn

 Giảm thời gian khô hóa môi

trường

 Nhược điểm:

 Kỹ thuật gieo cấy phức tạp

 Khi muốn sử dụng VSV : kỹ thuật

phức tạp

Phương pháp cấy chuyền định kỳ

 Bảo quản VSV trong nước cất:

Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp

 Ứng dụng: một số vi khuẩn, virus…

 Sử dụng nhiệt độ: -20  40oC, -80oC hoặc -196oC

 Quy trình: nuôi vi sinh vật trên các môi trường tổng hợp

giàu dinh dưỡng  cho vào các ampoule  hạ nhiệt độ về giá trị đã chọn  bảo quản.

 Chất bảo vệ (protector): phổ biến là glycerol, saccharide, dimethylsulfocid,…

 Cơ chế bảo vệ:

Ví dụ: bổ sung Tween 20 (sodium oleate) – 0,1% vào môi

trường nuôi Lactobacillus bulgaricus

Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp

 Ưu điểm:

 Rất khó bị nhiễm VSV từ môi trường ngoài

 Cả tế bào dinh dưỡng cũng được bảo quản bằng phương pháp này

 Thời gian bảo quản lâu nhưng không làm thay đổi hoạt tính của VSV

 Nhược điểm:

 Rất tốn kém, đắt tiền

 Chú ý:

 Trước khi sử dụng: cần làm tan giá môi trường và hoạt hóa VSV

 Yếu tố quan trọng: tốc độ giảm nhiệt độ trong quá trình lạnh đông và tốc độ tăng nhiệt độ trong quá trình tan giá

Phương pháp đông khô

 Ứng dụng: vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, tảo, virus…

 Quy trình:

 Hạ nhiệt độ mẫu chứa sinh khối VSV để nước chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn,

 Tạo áp lực chân không và nâng nhiệt độ để nước chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi

 Độ ẩm sau khi sấy thăng hoa: 2 – 6%

 Điều kiện bảo quản: T = 4 – 6 oC, môi trường khí trơ hoặc chân không cho kết quả rất tốt.

 Trước khi sử dụng: cần hoạt hóa VSV

 Ưu điểm:

 Áp dụng nhiều nhất, tốt nhất (vì ít làm thay đổi hoạt tính của VSV

 Có thể bảo quản ở nhiệt độ thường

 Vận chuyển nhẹ nhàng, gọn nhẹ, ít bị nhiễm

 Nhược điểm:

 Đắt tiền

 Cần trang thiết bị hiện đại (máy sấy thăng hoa)

Các phương pháp bảo quản khác

 Phương pháp bảo quản vi sinh vật trong đất, cát, trên hạt ngũ cốc…

 Sấy khô bằng không khí: bảo quản một số vi khuẩn, virus Đây thường là những loại gây bệnh  bảo quản trực tiếp trên vật chủ

• Ví dụ:

 Bảo quản trong môi trường silicagel: chỉ bảo quản được bào

tử, không bảo quản tế bào dinh dưỡng

 Bảo quản trong đất:

Chú ý

 Để an toàn, thường phối hợp 2 phương pháp bảo quản cùng 1 lúc:

 Protozoa: bảo quản ở nhiệt độ thấp với sự có mặt của các chất chống đông

 Vi khuẩn:

• Nitơ lỏng, đông khô

 Virut:

• virus thực vật: Sấy khô đơn giản trong không khí

Nhân giống vi sinh vật

Nguyên tắc

 Sử dụng canh trường vi sinh vật thuần khiết

 Chọn môi trường lỏng/rắn có thành phần tối ưu cho sự sinh sản của giống vi sinh vật

 Chọn các điều kiện nuôi tối ưu cho sự sinh sản của giống

 Tăng dần thể tích các canh trường sau mỗi giai đoạn nhân giống

Cách thực hiện

 2 giai đoạn:

 Nhân giống ở phòng thí nghiệm:

• Điều kiện vô trùng

• Thể tích canh trường giống tăng lên đến 10L

• Sử dụng ống nghiệm, tủ ấm, erlenmeyer, thiết bị lắc điều nhiệt, bình nuôi cấy thủy tinh có thể khuấy trộn

và điều nhiệt

 Nhân giống ở phân xưởng:

• Điều kiện vô trùng hoặc bán vô trùng

• Sử dụng thiết bị nhân giống có cánh khuấy và bộ phận sục khí vô trùng.

Các điều kiện nuôi

 Nhiệt độ

 pH

 Sự khuấy trộn

 Cung cấp oxy

 Độ ẩm

 Thời gian

Kiểm tra chất lượng giống

 Hiệu suất thu hồi sinh khối

 Tỉ lệ tế bào chết

 Hoạt tính giống