Bài Giảng Flavonoid & Dược Liệu Chứa Flavonoid

Trạng thái • Flavonoid được phân lập dưới dạng - genin/glycosid : hầu hết flavonol, flavanon, chalcon - chủ yếu genin : flavanonol, catechin, LAC, biflavonoid - chủ yếu là g

Sau khi học chương này, SV phải trình bày được

• Cấu trúc cơ bản của 3 nhóm Flavonoid

• Các tính chất căn bản của Flavonoid

• Nguyên tắc chiết xuất, định tính, định lượng Flavonoid

• Các tác dụng & công dụng của Flavonoid

• Các (10) dược liệu chứa Flavonoid chính

- hoa Hòe - Diếp cá - Núc nác

• Về mặt hóa học

- 1664, R Boyle : hoa Viola tricolor → màu tím

(màu xanh / kiềm, tím / trung tính, đỏ / acid)

- 1814, Chevreul : gỗ Morus tinctoria → Morin

- 1835, L.C Marquart : hoa Centaurea cyanus

→ anthocyanin (Δ’ 2-benzo pyrilium)

Sau đó, đã phân lập :

- phloridzin / Táo (1835), naringin / Bưởi (1857),

Sự liên quan về cấu tạo hóa học chưa được làm rõ,

các nghiên cứu chưa hệ thống → tên không thống nhất

anthoxanthin, anthoxanthidin, anthocyanin, anthochlor, chymochrome

Năm 1952 :

T.A Geissman : → Flavone (Δ’ 2-phenyl chromon)

→ những chất # Flavone này được gọi là Flavonoid

- do từ-nguyên (flavus = màu vàng)

FLAVONOID

• Về mặt dược lực học

- Derris elliptica thuốc cá, diệt côn trùng (rotenon) →

- 1928, S Györgyi và I Rusznyak → yếu tố P

→ Citrin (hesperidin + eriodictyol) chống xuất huyết

- 1954, Bradbury & White → Formononetin và Genistein từ cỏ Trifolium (làm cừu ↓ sinh sản)

- 1970, Kupchan → eupatin, eupatoretin,

centaureidin (kháng khối u)

- từ Pueraria trilobata → Daidzein

O HO

O HO

O

O OH

O

A

B C

7

2

3 4 5

6

7

1

3 5

7

3 4

6

5 1

I EU-FLAVONOID

III NEO-FLAVONOID

O

4

2 3

4-phenyl chroman 4-phenyl coumarin

brazilein

(tô mộc)

O

O HO

- ít quan trọng, chủ yếu gặp / ngành Hạt trần.

- Cấu trúc : Flavonoid – Flavonoid (dimer)

- Đại đa số : Flavon(ol) – Flavon(ol)

(apigenin – apigenin)

- Thường : nối C-C (~120 chất), C-O-C (~20 chất)

C4’ - C6 : robusta-flavonC6 - C6 : cupressu-flavonC3' - C8 : amento-flavon

IV BI-FLAVONOID

O OH

MeO

OMe O

O OH

HO

OH

3' 8

ginkgetin /Ginkgo biloba

V CẤU TRÚC KHÁC

O HO

OH

OH OH

OH

O HO

OH OH OH

OH

O HO

OH

OH OH

OH

OH OMe

CH 2 OH

O HO

O O OH

Flavo-Lignan

OH

OH

O O

O-glycosid

(rutin)

CÁC KIỂU GLYCOSID

sulfat glycosid(persicarin)

O

O OH

β-D-glc β-D-gal α-L-rha

CÁC OSE THƯỜNG GẶP

1 6

O

CH 2 OH

O Genin

O Me

O

1

2

O Me

O

O O

Genin

HO

OH OH OH

7

3’

4’

C1 theo khung của genin

- euflavonoid, isoflavonoid, neoflavonoid

C2 theo loại mạch đường

- O-glycosid, C-glycosid, sulfat glycosid

C3 theo số mạch đường

- monodesmosid (→ monosid, biosid, triosid)

- bidesmosid, tridesmosid

C4 theo cách tổ hợp phân tử

- monomer, dimer, trimer

C TÓM TẮT PHÂN LOẠI

OR OR

- Flavon - Flavonol

- Flavanon - Flavanonol

- Chalcon - Dihydrochalcon (DHC)

- Auron - Anthocyanidin (AC)

- Catechin - Leuco-anthocyanidin (LAC)

1 PHÂN LOẠI EU-FLAVONOID

O

O

O OH

OH

1.1 Flavon

apigenin luteolin tricetin

OH HO

O

OH

OH HO

O

O

O OH

O HO

hesperidin

OH HO

O

O

HO

OH OH OH

O

OH

O OH

OH HO

OH O

OH

OH OH

OH

HO

O OH

1.6 Dihydrochalcon (DHC)

O OH

O OH

OH

OH

OH

HO O

O OH

OH

OH HO

O

O OH

OH HO

bracteatin

OH OH OH

O HO

OH OH OH

OH

O HO

OH OH OH

O HO

OH

OH OH OH

O HO

OH

OH OH

OH HO

2 SINH NGUYÊN FLAVONOID

acid shikimic (I)

COOH

OH OH

HO

COOH

OH OH

O P

CH 2

COOH

C COOH O

CH 2

O H

C OH

CH 2

O H

CH 3 C CH 2 C CH 2 C OH

O O

O

HO O

OH

C

O O

H H

H

H

H H H OH

CH 3

O O

OH

OH HO

3 đơn vị acetic

Ý NGHĨA VỀ MẶT CẤU TRÚC

3.1 Trạng thái

• Flavonoid được phân lập dưới dạng

- genin/glycosid : hầu hết flavon(ol), flavanon, chalcon

- chủ yếu genin : flavanonol, catechin, LAC, biflavonoid

- chủ yếu là glycosid : AC

• dạng glycosid thường khó kết tinh

• dạng genin thường kết tinh, điểm chảy cao

• biflavonoid thường bền, điểm chảy cao

3 LÝ TÍNH FLAVONOID

3.2 Màu sắc

- flavanon(ol), DHC : không màu

- catechin, LAC : không màu

- flavon, isoflavon : không màu → vàng nhạt

- flavonol : vàng nhạt → vàng

- chalcon, auron : vàng → đỏ cam

- anthocyanidin : vàng cam, đỏ, tím (tùy pH)

Trong cùng nhóm : càng ít OH → màu càng nhạt

3.3 Độ bền

- dạng genin :

flavon(ol) > flavanon(ol), chalcon, auron, DHC >

> AC, catechin, LAC (kém bền nhất)

- dạng glycosid :

C-glycosid > O-glycuronid > O-glycosid

- polymere > monomere

3.4 Độ tan

3.4.1 Độ tan của genin

- tan / dung môi phân cực vừa đến ph.cực mạnh

(EtOAc, Me2CO, MeOH, EtOH )

- kém tan / d.môi kém ph.cực (hexan, Bz, EP, Et2O )

- càng nhiều OH → càng khó tan / d.môi kém ph.cực

- càng nhiều OMe → càng dễ tan / d.môi kém ph.cực

3.4.2 Độ tan của glycosid

- tan trong MeOH, EtOH

- mạch đường dài / nhiều : có thể tan / nước nóng

- AC (ion, glycosid) : dễ tan / nước, cồn loãng

kém tan /cồn cao độ

- OH/C-7: tính acid → tan / NaOH, Na2CO3, NaHCO3

• Phổ UV : có 2 band

- band II (220-290 nm, chủ yếu do vòng A)

- band I (290-380 nm, chủ yếu do vòng B+C)

• Mỗi loại flavonoid có 1 dạng phổ UV với λmax riêng,

Nói chung, λmax tăng dần theo dãy

(isoflavon, flavanon) → (flavon, flavonol) (chalcon, auron) → (anthocyanin)

4 PHỔ UV

4 PHỔ UV

band II (nm) band I (nm) phân nhóm

5 PHỔ IR

- Thường dùng để định danh (so với phổ chuẩn)

- Ít có ứng dụng thực tế khác

- Chú ý các băng (cm-1) trong vùng

• 3300 – 3400 (OH linh động)

• 1450 – 1650 (vòng pyron)

• 1050 – 1150 (carbinol; C – O)

O

O OH

OH HO

OH

OH

HO

O O

OH OH

Rutinose

Rutin

3400

O

O OH

OH HO

3300

O OH

OH

HO

O H

3 5

7

4'

6.1 Của các nhóm -OH

Có tính acid yếu (-OH/C-7 > 4' > 3' > 3, 5)

Tính acid giảm khi -OH ở gần chức carbonyl

6 HÓA TÍNH FLAVONOID

tính acid mạnh hơntính acid

mạnh hơn

6.1.1 Tạo glycosid với đường (hoặc Δ’ của đường)

- thường : glc, rha, gal, xyl là O-glyc ở 3,7, 4',5

- số mạch : 1, 2 mạch, ít khi > 3 mạch

- mỗi mạch gồm 1, 2, ít khi > 3 ose

- mạch thường thẳng, hiếm khi phân nhánh

- nếu có glc : sát genin (OH/C1 của ose → OH/genin)

- các biosid đáng chú ý: (R = αL-rha, G = βD-glc)

rutinose R1 → 6G gentibiose G1 → 6G

6.1.2 Tạo muối

- với kiềm loãng : → phenolat kém bền (↑ màu)

- tạo sulfat-glycosid (-OH thành -OSO3K),

6.1.3 Tạo phức với ion kim loại

(Al+++, Fe+++, Mg++, Pb++, Zn++, Zr++)

Đặc biệt với (-OH/C-3; C-5) hoặc (o-diOH/B)

Các phức này có độ bền khác nhau / HCl

Căn cứ vào độ bền này → cấu trúc của flavonoid

Sự dịch chuyển band I / phổ UV của luteolin

O

OH

OH OH

O

O Al O

O Al

OH

O Al

Khi Flavonoid + thuốc thử tăng màu :

+ kiềm loãng (NaOH, Na2CO3, AcONa, EtONa)

+ muối kim loại (AlCl3, ZnCl2 ) → chuyển dịch λmax

- bathochrom nếu ↑ λmax - hyperchrom nếu ↑ Abs

- hypsochrom nếu ↓ λmax - hypochrom nếu ↓ Abs

Căn cứ vào

- λmax và Abs của flavonoid trước và sau khi + th’.thử

- độ bền của sản phẩm màu / HCl

6.2 Hóa tính của vòng γ-pyron

6.2.1 Tính kiềm

- vòng γ-pyron : kiềm yếu, với acid → tạo muối kém bền

- flavon(ol) có thể tan một phần trong acid

- nhóm -OH / C-5, 7, 4' làm tăng tính kiềm của vòng C

- vòng pyrilium của anthocyanidin có tính kiềm mạnh

với acid → muối bền, tồn tại trong tự nhiên

Như vậy, flavonoid : lưỡng tính (vừa acid vừa kiềm)

HCl

6.2.2 Tính oxy hóa khử

a khi khử

vòng γ-pyron / γ-dihydropyron → vòng pyrilium

(tăng màu, quan trọng / định tính) Nếu có xúc tác, có thể khử → catechin hay LAC

b khi oxy hóa

flavanon → flavanonol → flavon → flavonol

6.3 Hóa tính của các vòng thơm (A và B)

Phản ứng thế azoic : tạo màu, dùng / định tính

Tác nhân : p-nitroanilin, acid sulfanilic đã được diazo-hóa, Điều kiện : - môi trường kiềm yếu,

- các vị trí o- hay p-(/OH) còn trống

- không bị cản trở lập thể

O

OH HO

6.4.1 Kiềm phân eu-flavonoid

Flavonoid + kiềm đặc và nóng (NaOH 2M, KOH )

→ các mảnh nhỏ và đơn giản

So sánh các mảnh nhỏ này với các chuẩn có sẵn,

→

O

OH OH OH

O H

OH

O H

HO

- Trong môi trường kiềm, các iso-F có H-5 sẽ bị mất 1 carbon C-2, tạo deoxybenzoin thế và formiat

- Tách deoxybenzoin bằng Et2O / HCl; so sánh

(SKLM ) với các chuẩn (có nhóm R khác nhau),

→ cấu trúc ban đầu của iso-F

+ HCOO

NaOH 5%

40 O C × 2h

–6.4.2 Kiềm phân isoflavonoid

6.4.3 Thủy phân Flavonoid

Sự thủy phân dễ hay khó tùy theo

- loại glycosid (C-glycosid / O-glycosid),

- loại đường (-ose / -uronic),

- kiểu mạch đường (biose nối 1-2 / 1-6),

- vị trí gắn đường (vị trí số 3 / 7 / 4' )

- khung genin (flavon glycosid > flavonol glycosid)

Nói chung, C-glycosid bền hơn O-glycosid

a Thủy phân bằng acid

Với HCl 2N / MeOH (1:1), cách thủy 1 giờ thì :

C-glycosid O-glycuronid O-glycosid

không thủy phân thphân 1 phần thphân h.toàn

Nếu nhóm -OH của ose bị acyl-hóa hoặc bisulfat-hóa

thì glycosid của chúng cũng có thể không bị thủy phân.Có thể thủy phân flavonoid glycosid bằng nhiều cách:

b Thủy phân bằng kiềm loãng (KOH 0.5% / N2)

- Ít sử dụng đối với các flavonoid glycosid

- dùng để phân biệt 3-O- với 7-O- và glycosid

(3-O- bền hơn 7-O- và 4'-O-glycosid)

O

O

O O

O OH

ose

ose

ose 3

7

4'

- các biosid nối (1 → 2) bền hơn (1 → 6)

bị thủy phân sau 1-2 h

c Thủy phân bằng enzym

Mỗi loại enzym sẽ thủy phân 1 vài glycosid nhất định Các loại enzym này có bán sẵn trên thị trường

7.1 Dùng ROH + nước

- Thường : MeOH, EtOH (70-90%) nóng hoặc nguội

(thu được các glycosid + genin ph.cực + tạp ph.cực)

- Loại tạp kém phân cực bằng các d.môi kém ph.cực

- Kết tinh / tủa trong các dung môi thích hợp

- Thu được genin + tạp kém ph.cực (ch’ béo, chlorophyll) → loại tạp tiếp bằng các phương pháp thích hợp

7.2 Dùng d.môi ph.cực trung bình (Cf, DCM )

7.3 Dùng dãy dung môi

- Ngấm kiệt với (ROH + H2O),

- cô, loại tạp kém phân cực bằng cách lắc với EP

lớp nước chứa flavonoid + tạp phân cực (đường )

- Lắc lớp nước này với Et2O rồi với EtOAc,

lớp Et2O chủ yếu chứa genin,

lớp EA chủ yếu chứa glycosid + ít genin còn sót lớp nước chủ yếu chứa ose,

- tiếp tục phân lập bằng các kỹ thuật khác (SKC…)

bột dược liệu

7.4 Dùng cồn acid

- Ngấm kiệt bằng ROH loãng chứa 0.1% - 1% acid

(HCl, AcOH, tartric, citric )

- Cô dịch chiết ở nhiệt độ thấp hoặc đông khô

- Loại tạp, rồi tinh chế bằng các ph.pháp thích hợp

- Áp dụng đối với các flavonoid kém bền

7.5 Dùng cồn kiềm

- Chiết dược liệu với (ROH + H2O) + NaOH

- Trung hòa dịch (= acid vô cơ loãng), cô dung môi,

- acid hóa, Flavonoid (glycosid & aglycon) sẽ tủa

- Tinh chế bằng (C* + ROH nóng) thu dịch cồn nóng

- Để nguội, để lạnh → Flavonoid sẽ kết tinh

- Kết tinh lại lần 2, nếu cần

- Thường áp dụng với các Citro-Flavonoid / chi Citrus

Nói chung, Flavonoid là các hợp chất phân cực, khó phlập.

Độ phân cực Flavonoid thì :

• kém hơn đường, tannin

• xấp xỉ saponosid, anthraglycosid

• mạnh hơn sapogenin > anthraquinon > phytosterol

> coumarin, tinh dầu, chất béo

Trong Flavonoid, độ phân cực giảm dần theo dãy:

• glycuronid glycosid > glycosid

• bidesmosid > monodesmosid; polymer > monomer

Để phân lập 1 hỗn hợp Flavonoid → các Flavonoid tinh khiết,có thể dùng các kỹ thuật :

• chiết phân bố (lỏng – lỏng)

• SKC phân bố đảo (Si-gel RP; Diaion HP-20)

• SKC phân bố thuận (Polyamid, Cellulose)

• SKC rây phân tử (Sephadex G, Sephadex

LH-20)

Đáng chú ý là SKC với Diaion HP-20 và các Sephadex

• SKC Diaion HP-20 với (H2O – MeOH; MeOH % ↑ dần)

- Flavonoid sẽ ra sau đường, tannin (là những chất phân cực hơn Flavonoid)

• SKC Sephadex G/LH-20 với (H2O – MeOH)

- thường thì Flavonoid sẽ ra sau tannin (thường, M của tannin > M của Flavonoid)

8.1.1 Với kiềm đặc-nóng

Phá vỡ cấu trúc (→ phloroglucinol) dùng để xác định cấu trúc flavonoid

8 ĐỊNH TÍNH

O

OH OH OH

OH

8.1 Phản ứng với kiềm (KOH, NaOH)

8.1.2 Với kiềm loãng

Flavonoid tăng màu (tạo phenolat, Δ’ có Δ liên hợp)

trước khi + kiềm sau khi + kiềm

8.2 Phản ứng với acid

(chỉ thị màu)

flavon, flavonol

→ vàng sậm, cam (huỳnh quang !)

chalcon → mất màu

(flavanon)

isoflavon isoflavanon → vàng

8.3 Phản ứng Cyanidin (Shinoda, Shibata, Pew)

a với Mg* / HCl đ.đặc

Flavon(ol), Flavanon(ol)Chalcon

b với Zn* / HCl đ.đặc

đỏ đậm / magenta

→ AC, màu đỏFlavonoid bột Mg, Zn

EtOH HCl đ.đặc+

Lắc sản phẩm của phản ứng Cyanidin với octanol

- dạng glycosid : dịch màu đỏ / lớp EtOH (dưới)

- dạng aglycon : dịch màu đỏ / lớp octanol (trên)

PHÂN BIỆT GENIN / GLYCOSID *

octanol

glycosid aglycon

8.4.1 Với d.dịch FeCl3 loãng

Flavonoid + FeCl3 → phức xanh (nâu, lá, đen)

- để sơ bộ nhận định số lượng nhóm OH / phân tử

- càng nhiều OH (đ.biệt là o-di-OH): màu càng đậm

- các dẫn chất 3',4',5' tri-OH : tạo màu xanh đen

8.4 Phản ứng tạo phức màu với muối kim loại

O HO

OH OH

OH

O HO

OH

8.4.2 Với dd acetat chì : Tạo phức tủa có màu

- dd acetat chì kiềm : → tủa vàng nhạt đến sậm với hầu hết các flavonoid (và cả các polyphenol)

- dd acetat chì trung tính: → tủa vàng nhạt đến sậm với các flavonoid có ortho-di-OH phenol

Màu tủa thay đổi tùy số lượng và vị trí các nhóm thế

nghiên cứu Flavonoid → không dùng chì acetat để loại tạp

8.4.3 Với dung dịch AlCl3 / ROH

- Là thuốc thử tăng màu (shift reagent), dùng để khảo sát cấu trúc flavonoid bằng quang phổ UV

- dựa vào Δλmax, → số lượng & vị trí các nhóm -OH /

khung

Chú ý : Thuốc thử này chỉ quan sát rõ dưới UV 365 nm

Dưới ánh sáng thường: không thấy rõ sự th.đổi

8.4.4 Với thuốc thử Martini-Bettòlo (SbCl5 / CCl4)

→

Flavonoid / Na2CO3 + th’.thử diazonium → đỏ cam / đỏ

8.5 Phản ứng với thuốc thử diazonium

(hay dùng p-nitroanilin đã được diazo-hóa)

các flavonoid (+) khi

- có H ortho hay para / -OH

- H này không bị cản trở lập thể

O

O OH

OH OH HO

8.6 Định tính bằng phương pháp sắc ký (SKG, SKLM)

Dịch cồn của flavonoid được sắc ký (1, 2 chiều)

- SKG (Whatman 3MM ) hay

- SKLM (Si-gel NP, RP-18, cellulose, polyamid)

Dung môi khai triển thông dụng (xem Wagner, 1996)

BAW = nBuOH - AcOH - H2O (4:1:5; ↑)CAW = CHCl3 - AcOH - H2O (30:15:2)TBA = tBuOH - AcOH - H2O (3:1:1)

Phát hiện :

- Vis hoặc UV 365 nm (not 254 nm) trước / sau khi

phun thuốc thử (kiềm, AlCl3/HCl, NaBH4 /MeOH )

- Các thuốc thử khác : FeCl3 , Chì acetat, diazo

cũng được dùng (kém đặc hiệu)

- Chú ý sử dụng thuốc thử vanillin – HCl, FBS No 15 và NP/PEG No 28 (xem slide sau)*

- So màu, Rf với các chất trong tài liệu tham khảo

có thể xác định được flavonoid cần nghiên cứu