Góp phần vào nghiên cứu thành phần hoá học của là nhót (elaeagnus loureiri champ )

Do vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm, phát hiện các hợp chất thiên nhiên mới có hoạt tính sinh học cao cũng như tìm hiểu tác dụng của các cây thuốc dân gian đang là mục tiêu mà các nhà khoa

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-
 -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

GÓP PHẦN VÀO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN

HÓA HỌC CỦA LÁ NHÓT (ELAEAGNUS

LOUREIRI CHAMP.)

HÀ NỘI - 2016

Trần Thị Nga Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Đồ án tốt nghiệp được hoàn thành tại khoa Công nghệ Sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội và Phòng Hóa dược - Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới:

PGS.TS Lê Minh Hà, Phòng Hóa dược, Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Người đã giao cho em đề tài và tận tình hướng dẫn, cho em những kinh nghiệm làm thực nghiệm, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp của mình

Thạc sỹ Ngọ Thị Phương, Phòng Hóa dược, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Người đã cùng với em trong suốt thời gian làm thực nghiệm, chỉ bảo, hướng dẫn tận tình, giúp đỡ và cho em những kỹ năng làm thực nghiệm quý báu

Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy, cô trong khoa Công Nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội, đã giúp đỡ em trong quá trình học tập cũng như quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ

em trong quá trình học tập và làm đồ án tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Nga

Trần Thị Nga Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về họ Nhót Elaeagnceae 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Phân bố 3

1.2 Giới thiệu về chi Elaeagnus 4

1.2.1 Chi Elaeagnus trên thế giới 4

1.2.2 Chi Elaeagnus ở Việt Nam 4

1.3 Những nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Nhót(Elaeagnus) 5

1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Nhót (Elaeagnus) 8

1.5 Cây Nhót(Elaeagnus loureiri Champ.) 10

1.5.1 Tên gọi, đặc điểm thực vật, phân bố của cây Nhót 10

1.5.2 Thành phần hóa học của cây Nhót loureiro 11

1.5.3 Tác dụng dược lý của cây Nhót và một số bài thuốc dân gian 12

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp chiết 14

2.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp chiết 14

2.2.2 Cơ sở của quá trình chiết 14

2.2.3 Quá trình chiết thực vật 15

2.2.3.1 Chọn dung môi chiết 15

2.2.3.2 Quá trình chiết 16

Trần Thị Nga Khóa luận tốt nghiệp

2.3.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 17

2.3.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký 17

2.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký 18

2.3.3.1 Sắc ký cột 18

2.3.3.2 Sắc ký lớp mỏng 20

2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ 21

2.4.1 Phổ hồng ngoại 21

2.4.2 Phổ khối lượng 21

2.4.3 Phổ ESI-MS 22

2.4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 22

2.5 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 23

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM 24

3.1 Thu hái và xử lý mẫu 24

3.2 Thiết bị và hóa chất dùng cho chiết tách và phân lập hợp chất 24

3.2.1 Thiết bị 24

3.2.2 hóa chất 24

3.3 Điều chế cặc chiết 25

3.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học cặc chiết tổng EL/MEOH 27

3.4.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 27

3.4.2 Hoạt tính chống oxi hóa 29

3.5 Phân lập các chất từ cặn chiết 29

3.5.1 Phân lập hợp chất N3 29

3.5.2 Phân lập hợp chất N2 30

3.6 Dữ kiện phổ hợp chất phân lập được 31

3.6.1 Dữ kiện phổ hợp chất N3 31

3.6.2 Dữ kiện phổ hợp chất N2 32

Trần Thị Nga Khóa luận tốt nghiệp

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính chống oxi hóa 33

4.1.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 33

4.1.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa 34

4.2 Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được 35

4.2.1 Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất N3 35

4.2.2 Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất N2 37

KẾT LUẬN 46

KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC

Trần Thị Nga Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Proton Magnetic Resonance spectroscopy

Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

EtOAc Etyl axetat

J Hằng số tương tác spin – spin

Trần Thị Nga Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Bảng 3.1: Hàm lượng các cặn chiết từ cây Nhót

Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cặn

EL/MeOH

Bảng 4.2: Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của cặn EL/MeOH

Bảng 4.3: Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất N2

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ điều chế các cặn chiết

Sơ đồ 3.2:Sơ đồ phân lập chất sạch N3 từ cặn chiết n-hexan

Sơ đồ 3.3:Sơ đồ phân lập chất sạch N2 từ cặn chiết n-hexan

Hình 1.1: Cây Nhót (Elaeagnus Loureiri Champ.)

Hình 4.1: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR của chất N3

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, trong quá trình đấu tranh với thiên nhiên, bệnh tật, để bảo vệ cuộc sống, con người đã biết dùng cây cỏ quanh mình để làm thuốc chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học –

kĩ thuật, thành phần hóa học và dược tính của nhiều loại thảo mộc ngày càng được quan tâm nghiên cứu với mục đích tạo ra những loại dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên an toàn với sức khỏe của con người Thuốc có nguồn gốc thiên nhiên thường ít độc và có khả năng dung nạp tốt vào cơ thể sống và theo các thống kê cho thấy, hiện nay có đến 60% dược phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên Hơn nữa, các loại thuốc tổng hợp – tuy là một trong những thành tựu quan trọng của nhân loại, thì ngoài tác dụng chính vô cùng công hiệu, thuốc tổng hợp còn có một số tác dụng phụ gây ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe Do vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm, phát hiện các hợp chất thiên nhiên mới có hoạt tính sinh học cao cũng như tìm hiểu tác dụng của các cây thuốc dân gian đang là mục tiêu mà các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế

giới quan tâm đến

Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, độ ẩm cao Với điều kiện thiên nhiên thuận lợi như vậy, hệ thực vật Việt Nam phát triển rất phong phú và đa dạng với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao Nhiều loài trong số đó đã được sử dụng trong chữa bệnh và đời sống

Đi cùng với hàng ngàn loài dược liệu khác nhau, bên cạnh những giá trị kinh tế mang lại thì cây Nhót là một loại thảo mộc được biết đến với những tính chất vô cùng quý báu

Cây Nhót Loureiro , tên khoa học là Elaeagnus loureiri Champ thuộc họ

Nhót (Elaeagnaceae), chi Elaeagnus Trên thế giới chưa có nhiều công trình nghiên cứu về cây này, tuy nhiên nó đã được nhân dân ta phát hiện và sử dụng

từ xa xưa và đã có những bài thuốc dân gian sử dụng cây Nhót để chữa bệnh

Ở nước ta, cây mọc ở các đồng cỏ khô ở Lào Cai Với khả năng chữa các

chứng hen, viêm phế quản, khái huyết giả, đau dạ dày, ỉa chảy, viêm gan mạn tính, viêm xương tủy, viêm tinh hoàn cấp tính Hiện nay ở Việt Nam cũng như trên thế giới chưa thấy có các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài nhót này

Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn cây nhót Elaeagnus loureiri Champ

để tiến hành nghiên cứu với đề tài: “Góp phần vào nghiên cứu thành phần

hóa học của lá Nhót (Elaeagnus loureiri Champ.)”

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được một số thành phần hóa học của lá Nhót

Nội dung nghiên cứu

1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính chống oxi hóa

2 Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về họ Nhót Elaeagnaceae

Họ Nhót, tên khoa học là Elaeagnaceaelà một trong 9 họ thực vật có hoa nằm trong bộ Hoa hồng (Rosales) Họ này có quan hệ với Thymeleaceae hoặc

có thể với Rhamnaceae, Proteaceae [7] [33]

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Các loài trong họ này thường là cây gỗ hay cây bụi nhỏ, có gai với các lá đơn có cuống lá thường được bao phủ một lớp lông hay vảy nhỏ, mặt bóng như da, mọc so le, đôi khi mọc đối, thường thành vòng, phiến lá nguyên, gân

lá hình lông chim Quả bế hoặc quả hạch có vị chua, không tự mở, nằm trong ống đài bền đồng trưởng và thường hóa nạc (nên giống như quả mọng) Mặt dưới lá và vỏ quả đều có lông vảy màu ánh bạc Nhị đồng số và đính vào họng của ống đài xen kẽ với các thùy của nó và xen kẽ với các mấu lồi của triền tuyến mật, bầu nhụy 1 lá noãn Hoa lưỡng tính hoặc đa tính, thường đều, các hoa cái không có nhị lép, bầu nhị của hoa đực không có, thụ phấn nhờ gió hay sâu bọ Hoa mọc đơn độc hay thành cụm, cụm hoa đầu cành có dạng chùm hoa, cụm hoa nói chung mọc ở nách lá, hoa thường có mùi thơm, đôi khi không mùi Bao hoa dạng lá đài không cánh, hoa màu trắng, kem hoặc vàng với 4 (đôi khi 2 hoặc 6) lá đài Phần lớn các loài là cây chịu khô hạn (tìm thấy trong các khu vực khô hạn); một vài loài có khả năng chịu mặn, chịu được nồng độ mặn cao của đất [7] [34]

1.1.2 Phân bố

Trên thế giới, họ Nhót có 3 chi đó là Elaeagnus, Hippophaevà Shepherdia, phân bố chủ yếu ở vùng Ôn đới và Cận nhiệt đới, ít có ở vùng

Nhiệt đới châu Á [34]

Ở Việt Nam có 1 chi đó là Elaeagnus gồm khoảng 11 loài [34]

1.2 Giới thiệu về chi Elaeagnus

1.2.1 Chi Elaeagnus trên thế giới

Chi Nhót Elaeagnus là một chi của khoảng 50-70 loài thực vật có hoa trong họ Nhót (Elaeagnaceae) Phần lớn các loài có nguồn gốc ở vùng ôn đới và cận nhiệt đới của châu Á, với một loài (Elaeagnus triflora) sinh trưởng tận phía nam tới vùng đông bắc Úc và một loài khác (Elaeagnus commutata) chỉ sinh trưởng ở khu vực Bắc Mỹ Một loài khác (Elaeagnus angustifolia) có thể có nguồn gốc ở miền cực đông nam của châu Âu mặc dù có thể là do con người đem nó đến đây trong thời kỳ ban đầu

1.2.2 Chi Elaeagnus ở Việt Nam

Theo thống kê, ở Việt Nam, chi Elaeagnus có 11 loài [34] đó là các loài

- Nhót rừng (Elaeagnus bonii H.Lec )

- Nhót dại (Elaeagnus eonferta Roxb)

- Nhót Balansa (Elaeagnus eonferta subsp Balansae Servellaz)

- Nhót mềm (Elaeagnus eonferta subsp mollis H.Lec)

- Nhót Delavay (Elaeagnus delavayi H.Lec)

- Nhót chôi ( Elaeagnus fruticosa)

- Nhót hoa có cạnh (Elaeagnus gonyanthes Benth)

- Nhót Loureiro (Elaeagnus Loureiri Champ.)

- Nhót trườn (Elaeagnus sarmentosus Rehd)

- Nhót Bắc bộ (Elaeagnus ton kinensis)

- Elaeagnus elongatus Tagane & V.S Dang

Trong đó Elaeagnus elongatus Tagane & V.S Dang là loài nhót mới

được các nhà khoa học Viện Sinh học Nhiệt đới thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Nhật Bản, Campuchia và Thái Lan vừa mới phát hiện Nó được mô tả dựa theo mẫu vật thu từ Campuchia và Thái Lan, và

trong đợt khảo sát gần nhất (năm 2014) của các nhà thực vật Viện Sinh học nhiệt đới thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trung tâm Bảo tồn sinh thái châu Á thuộc Đại học Kyushu Nhật Bản thì loài này còn có vùng phân bố ở Vườn Quốc gia Bì Doup-Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng của Việt Nam [37]

1.3 Những nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Nhót (Elaeagnus)

Trên thế giới, cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa

học của các loài trong chi Elaeagnus và có thể khái quát như sau:

- Lần đầu tiên loài Elaeagnus angustifolia được biết đến vào năm 1973,

Gill S và Dembińska-Migas W đã cho rằng trong lá của loài này có chứa flavonoid [17]

-Đến năm 2000, nhóm tác giả Ahmadiani A , Hosseiny J , Semnanian

S, Javan M , Saeedi F , Kamalinejad M , Saremi S đã kết luận trong quả của loài này có chứa flavonoid, terpenoid và cardiac glycosides, polysaccharides, sitosteroles, coumarines, phenol axit cacboxylic, axit amin, saponin, carotenoid, vitamin, và tannin [8] [24]

- Các hợp chất Phenol có rất nhiều trong Elaeagnus angustifolia L Các hợp chất được biết đến như axit 4-hydroxybenzoic từ nhóm benzoic (45,8 mg / 100 g trọng lượng khô) và axit caffeic từ nhóm cinnamic (32 mg / 100 g trọng lượng khô.)

- Một nhóm các flavonoid như 4 (+) - catechin, (-) - epicatechin, (+) - gallocatechin, (-) - epigallocatechin, kaempferol, quercetin, luteolin,

isorhamnetin và isorhamnetin-3 0 -β- d-galactopyranoside đã được phân lập

và xác định từ dịch chiết của Elaeagnus angustifolia L [26]

-Nghiên cứu hóa thực vật của Elaeagnus angustifolia L Chiết xuất từ

quả chỉ ra sự có mặt của các hợp chất flavonoid, polysaccharides, sitosteroles, glycosid tim, terpenoid, coumarines, phenol axit cacboxylic, axit amin,

saponin, carotenoid, vitamin, và tannin [24] [26] [16] Trong đó flavonoid là thành phần chính trong quả của nó [26]

- Elaeagnus angustifolia L chứa một lượng cao tannin ngưng tụ, vỏ cây

chứa nhiều tanin nhất sau đó đến lá và cành [12]

- Năm 2015, I Yıldırım và cộng sự đã nghiên cứu và xác định được trong quả của loài này có chứa một số axit béo như lauric, tridecanoic, myristic, pentadecanoic, palmitic, heptadecanoic, linolenic, oleic, stearic, eicosanoic, và axit docosanoic đã được xác định trong cặn chiết quả của loài này [16]

- Một công trình nghiên cứu về thành phần hóa học trong rễ của

Elaeagnus bockii đã rất thành công do nhóm nhà khoa học người Trung Quốc

thực hiện Họ đã phân lập được 7 hợp chất trong rễ của loài này và cấu trúc của chúng được xác định là angelicin (1), psoralen (2), acid vanillic (3), bakuchiol (4), axit oleanolic (5), axit ursolic (6) và beta-sitosterol (7) [21]

-Hai hợp chất đã được tách ra từ lá củaElaeagnus pungen và đã được

các tác giả Li M , Liao M , Ge Y , Mei Z xác định là kaempferol glucopyranosyl- (1 -> 3) -alpha-L-rhamn-opyranosyl- (1 -> 6) - / 3-D-galactopyranoside (1) và kaempferol (2) [20]

3-O-β-D Từ cặn chiết etylacetate từ lá của Elaeagnus pungens, nhóm tác giả người Trung Quốc đã phân lập được năm hợp chất và cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ là acid 4-hydroxybenzoic (1), 3, 3'-dimethoxyquercetin (2), axit caffeic methyl ester (3), metyl 3, 4 dihydroxybenzoate (4), spingic axit (5), 4-methoxylbenzoic axit (6), 3-methylkaempferol (7), kaempferol-3-O-beta-D-glucoside (8), dausosterol (9) Nghiên cứu này đã được công bố năm

2006 [25]

- Đến năm 2013, người ta công bố thêm hai glycosides flavonol được xác định là kaempferol 3-O-β-d-glucopyranosyl- (1 → 3) -α-l-rhamnopyranosyl- (1 → 6) - [α-l-rhamnopyranosyl (1 → 2)] - β -d-

galactopyranoside (1), isorhamnetin 3-O-β-d-glucopyranosyl- (1 → 3) rhamnopyranosyl- (1 → 6) -β-d-galactopyranoside (2) có trong lá của

-α-l-Elaeagnus pungen [14]

- Cùng với bốn hợp chất được biết đến trước đó bao gồm hai glycosides phenol, một secoiso-flavanol và một phenol ether thì ba hợp chất mới có tên

là pungens A-C đã được phân lập từ vỏ cây của Elaeagnus pungens [30]

- Lần đầu tiên lá của Elaeagnus oldhamii Maximđược phân lập năm

2013 bởi nhà khoa học Liao CR cùng cộng sự và đã phân lập được 5 hợp chất Trong đó, một hợp chất lignanoid có tên isoamericanol B (1), cùng với bốn hợp chất-cis-3-Op-hydroxycinnamoyloleanolic triterpenoid axit (2), trans-3-Op-hydroxy axit cinnamoyloleanolic (3), axit cis-3-Op-hydroxycinnamoylursolic ( 4), trans-3-Op-hydroxycinnamoylursolic axit (5) [23]

- Cùng nhóm tác giả này, đến năm 2014, họ đã công bố 25 hợp chất cũng được phân lập từ lá của loài này Các hợp chất đó là axit oleanolic (1), 3-O- (Z) axit oleanolic -coumaroyl (2), 3-O (E) -coumaroyl oleanolic acid (3), 3-O-caffeoyl axit oleanolic (4), ursolic axit (5), 3-O- (Z) axit ursolic -coumaroyl (6), 3-O (E) -coumaroyl ursolic acid (7), 3-O-caffeoyl axit ursolic (8), 3β, 13β- dihydroxyolean-11-en-28-OIC axit (9), 3β, 13β-dihydroxyurs-11-en-28-OIC axit (10), uvaol (11), betulin (12), lupeol (13), kaempferol (14 ), aromadendrin (15), epigallocatechin (16), cis-tiliroside (17), trans-tiliroside (18), isoamericanol B (19), trans-p-coumaric acid (20), acid protocatechuic (21), acid salicylic (22), acid trans-ferulic (23), acid syringic (24) và axit 3-O-methylgallic (25) Trong đó hợp chất (19) đã được công bố năm 2013 [22]

- Một số loài thuộc chi Elaeagnus có thành phần hóa học chủ yếu là các

loại dầu dễ bay hơi, tecpen, ancaloit, flavonoit, có tác dụng dược lý chủ yếu trong việc giảm lượng đường trong máu, mỡ trong máu, oxy hóa chống lipid, giảm đau chống viêm [1]

1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Nhót (Elaeagnus)

Gần đây, các loài trong chi Nhót đã được nghiên cứu khá nhiều Trong quá trình nghiên cứu đã tìm ra nhiều hợp chất có hoạt tính đáng quý Các hoạt tính đó là kháng viêm, kháng nấm, chữa viêm họng, khả năng chống oxy hóa cao và gần đây nhất là họat tính chống ung thư phổi sử dụng trong hóa trị liệu

để điều trị bệnh ung thư phổi

- Như đã trình bày thì Elaeagnus angustifolia L chứa một lượng cao tannin ngưng tụ [12]

- Tanin có tính chất làm tủa protit, tổ chức của da, niêm mạc, vết loét tiếp xúc với tanin sẽ tủa và đanh lại, tạo thành một lớp cứng làm máu đông lại, ngừng chảy, do đó có tác dụng cầm máu, tế bào của các hạch nhân tiết cũng bị đông lại và làm giảm sự bài tiết của các dịch, niêm mạc đc khô ráo Đầu dây thần kinh cũng bị cứng lại, di đó hơi có tác dụng gây tê [1]

- Tanin còn có tác dụng tủa với các chất ancaloit, làm giảm sự hấp thụ,

do đó có thể làm thuốc giải độc [1]

- Tannin đã được chứng minh là có tác dụng chống cholesterol, chống viêm, chống ung thư, tim mạch và tác dụng ngăn ngừa ung thư trong cơ thể [12]

- Năm 2012, Mehrabani Natanzi M và cộng sự đã thử nghiệm chữa lành vết thương ở da của chuột Các kết quả cho thấy chiết xuất dung dịch nước từ quả của Elaeagnus angustifoliacó tác dụng đáng kể trong việc đẩy nhanh quá trình chữa lành vết thương và làm giảm viêm và đau ở chuột Ảnh hưởng của

nó có thể là do sự gia tăng tái tạo biểu mô và collagen lắng đọng trong vết thương , vì vậy nó có thể đặc vụ cho việc chữa lành vết thương trong tương lai [24]

- Cặn chiết methanol từ lá của Elaeagnus angustifolia có tác dụng kháng

khuẩn, kháng nấm, diệt côn trùng, chống oxy hóa, chống đột biến [26] [18]

- Elaeagnus angustifolia sở hữu một loạt các tác dụng dược lý và điều trị,

trong đó có kháng sinh, thuốc diệt côn trùng, chất chống oxy hóa, chống viêm khớp, chữa lành vết thương, bảo vệ tim mạch, chống viêm, chống đột biến, chống ung thư và tác dụng bảo vệ dạ dày Thành phần hóa học của nó bao gồm alkaloids β-Carboline, polysaccharides, este, glycosides flavone, phenol, axit phenolic, xeton, este phenyl, pyrimidine, steroid và tecpen, cũng như các thành phần dinh dưỡng như axit và Nutraceuticals như amin thiết yếu và không thiết yếu vitamin và axit béo [13]

- Các lá của Elaeagnus lanceolata, Elaeagnus henryi và

Elaeagnus pungens đã được ghi nhận như một loại thảo dược có hiệu quả

trong điều trị các bệnh hen suyễn và viêm phế quản mạn tính trong y học cổ truyền Trung Quốc Theo tài liệu công bố năm 2015, nghiên cứu của Ge Y và cộng sự lại một lần nữa khẳng định lá của ba loài này có thể dùng để điều trị các bệnh hen suyễn và viêm phế quản mạn tính [15]

Theo nghiên cứu về thành phần gây độc tế bào từ lá củaElaeagnus

oldhamii Maxim trong các tế bào ung thư phổi, nghiên cứu bởi một nhóm tác

giả người Trung quốc, họ đã kết luận 5 hợp chất có trong lá của loài này có tác dụng trong việc điều trị bệnh phổi[22]

- Năm 2004, tại Phòng thí nghiệm bệnh học thực vật của trường Đại học Nông nghiệp, Rawalakot Pakistan, các nhà khoa học đã cho kết quả chiết xuất ether trong hoa của Elaeagnus umbellata Thunb có hiệu quả cao đối với E coli, P aeruginosa, S aureus và Bacillus subtilis (B subtilis) Chiết xuất

alcohol từ lá của loài này cũng hoạt động mạnh mẽ chống lại các vi khuẩn gram dương và âm Các chiết xuất trong dung dịch nước từ quả chín mọng ức chế mạnh sự phát triển của E coli và S aureu Chiết xuất acetone của quả cho thấy hoạt động tốt đối với P Aeruginosa [28]

- Năm 2007, nghiên cứu này đã được công bố và kết luận rằng thành phần trong Elaeagnus umbellata Thunb có hoạt tính kháng khuẩn Các vi khuẩn S aureus, B subtilis và vi khuẩn gram âm như E coli và P

aeruginosa bị ức chế Nghiên cứu này có thể có ích trong việc điều trị các

bệnh truyền nhiễm [28]

- Đi từ vỏ cây và quả của Elaeagnus umbellata Thunb, năm 2015, Aziz S

và các cộng sự đã nghiên cứu được hoạt tính kháng khuẩn, chống nấm, diệt côn trùng và các hoạt động gây độc tế bào [9]

- Năm 2007, nhóm nhà khoa học người Hàn Quốc đã phân tích các chất chống oxy hóa, chống ngưng kết tiểu cầu, chống viêm, và hoạt tính ức chế tyrosinase của một loạt các chiết xuất dung môi của Elaeagnus multiflora Thunb Nhóm nhà khoa học này đã kết luận rằng

Elaeagnus multiflora Thunb có tác dụng tổng hợp chống oxy hóa và kháng

tiểu cầu một mức độ nào, chiết xuất chloroform và etyl axetat của nó có tác dụng ức chế mạnh sự sản xuất oxit nitric và hoạt động tyrosinase [19]

-Năm 2014, trong một nghiên cứu thực hiện trên các hoạt động chống oxy hóa của methanol từ lá của Elaeagnus kologa bằng phương pháp 1-1-

diphenyl-2-picrylhydrazyl Nhà khoa học Zoe Merculieffa và cộng sự đã có kết quả, tổng phenol, flavonoids được tìm thấy trong petroleum ether là khá cao so với dung môi khác Giá trị IC50 của cặn chiết methanol là 62,20 mg /

ml cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng kể chống lại vi khuẩn Bacillus

subtilis (Gram dương)

Qua nghiên cứu này, họ đã kết luận rằng trong cặn chiết Methanol từ lá

của Elaeagnuskologa sở hữu đặc tính chống oxy hóa và kháng khuẩn Đặc

tính này có thể được sử dụng rất nhiều trong việc giảm thiểu những tác động bất lợi của stress gây ra oxy hóa và làm giảm sự nhạy cảm với vi khuẩn [25]

1.5 Cây Nhót (Elaeagnus loureiri Champ.)

1.5.1 Tên gọi, đặc điểm thực vật, phân bố của cây Nhót [36]

Cây Nhót loureiro, tên khoa học là Elaeagnus loureiri Champ thuộcchi

Elaeagnus, họ Elaeagnaceae

Cây Nhót loureiro thuộc loại cây bụi, có cành trườn, cây nhỏ mọc thẳng

hay leo cao khoảng 2 đến 3 mét, nhánh có lông hình khiên sát

Lá có phiến xoan ngược, dài 9-10cm, rộng 4-5cm, mặt dưới đầy lông hình khiên nâu, gân phụ có 7 cặp, cuống dài 1cm

Hoa to, gồm 3 đến 4 ở nách lá; cuống dài 4-6mm; đài cao 1,5cm, có lông hình sao dây ở mặt ngoài Hoa Nhót thường nở vào cuối xuân, khi có nắng

ấm

Quả Nhót hình bầu dục cỡ khoảng 1,5cm, ngoài mặt có nhiều vảy, lớp vảy này thường bám dày và chắc khi quả còn non và khi quả càng già lớp vảy càng mỏng, dễ bong khi bị chà xát, bên trong có hạt Nhót có thể ăn được khi

cả xanh và chín, khi xanh có vị chua và có vị ngọt khi chín đỏ

Nơi sống và thu hái: Loài của Nam Trung Quốc và Bắc Việt Nam Ở nước ta, cây mọc ở các savan cây gỗ ở Lào Cai

Hình 1.1: Cây Nhót (Elaeagnus Loureiri Champ.)

1.5.2 Thành phần hóa học của cây Nhót loureiro

Theo Đỗ Tất Lợi, thành phần hóa học trong quả nhót có chứa axit hữu

cơ, lá nhót chứa tanin, saponozit và polyphenol [1]

Tanin có tính chất làm tủa protit, tổ chức của da, niêm mạc, vết loét tiếp xúc với tanin sẽ tủa và đanh lại, tạo thành một lớp cứng làm máu đông lại, ngừng chảy, do đó có tác dụng cầm máu, tế bào của các hạch nhân tiết cũng

bị đông lại và làm giảm sự bài tiết của các dịch, niêm mạc được khô ráo Đầu dây thần kinh cũng bị cứng lại, do đó hơi có tác dụng gây tê

Tanin còn có tác dụng tủa với các chất ancaloit, làm giảm sự hấp thụ, do

đó có thể làm thuốc giải độc [1]

1.5.3 Tác dụng dược lý của cây Nhót và một số bài thuốc dân gian

Tác dụng kháng khuẩn: theo các thực nghiệm về sinh học, lá nhót có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều chủng vi khuẩn gram dương và gram âm, đặc

biệt đối với các chủng trực khuẩn lỵ: Shigella dysenteria, Shigella shiga, Shigella flexneri, Shigella sonnei

Tác dụng trừ ho, chống hen: Sách Bản thảo cương mục của Lý Thời Trân đã viết: “Ngay cả đối với người bị hen suyễn rất nặng cũng kiến hiệu, có người mắc bệnh đã 30 năm, uống lá Nhót bỗng nhiên khỏi bệnh”

Tác dụng chữa đau dạ dày, cầm ỉa chảy [38]

Tác dụng chống viêm gan cấp và mạn tính [38]

Tác dụng làm săn da

Tác dụng chống viêm xương tuỷ

Rễ Nhót có tác dụng cầm máu, giảm đau

Các bộ phận của Nhót như rễ, lá, quả được dùng làm thuốc thường dùng dưới dạng nước sắc hoặc dùng dưới dạng bột khô

Trị ho, nhiều đờm, hen suyễn: Dùng 20 - 30g lá nhót tươi hoặc 6 - 12g lá nhót khô, sao vàng lên, sắc với 400ml nước đến khi còn lại 100ml, chia 2 lần uống trong ngày, uống trước các bữa ăn 1,5 giờ Có thể uống liền 1 - 2 tuần đến khi hết các triệu chứng Hoặc dùng dưới dạng bột khô lá nhót, ngày 2 - 3 lần, mỗi lần 8 - 12g, uống với nước cơm hoặc phối hợp đồng lượng với bột của vỏ cây đỗ trọng nam

Có thể dùng quả nhót 6 - 12g/ngày, dưới dạng thuốc sắc, thuốc hãm, hay thuốc bột Uống nhiều ngày, tới khi các triệu chứng thuyên giảm Trong khi uống cần kiêng các thức ăn tanh, lạnh: cá cua, ốc, ếch

Trị ho ra máu, hoặc nôn ra máu, chảy máu cam: Dùng 16g rễ nhót sao đen, sắc uống ngày một thang Có thể phối hợp với cỏ nhọ nồi, ngải diệp, trắc bách diệp Tất cả đều sao đen, sắc uống ngày một thang, chia 3 lần uống trước bữa ăn 1,5 giờ Trong khi uống thuốc, cần kiêng các thứ cay nóng: rượu, bia,

Hiện nay ở Việt Nam cũng như trên thế giới chưa thấy có các nghiên cứu

về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Nhót Elaeagnus loureiri

Champ

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là lá cây Nhót (Elaeagnus loureiri Champ) Phần

lá cây E loureiri được thu hái tại Nhổn, Từ Liêm, Hà Nội vào tháng 2 năm

2015 Tên khoa học được Tiến sĩ Nguyễn Quốc Bình – Viện Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam định loại Mẫu tiêu bản số EL 02/2013 được lưu tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp chiết

2.2.1 Đặc điểm chung của chiết

Khái niệm: chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào khả năng

chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hòa tan với nó

Mục đích của chiết:

+ Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu

+ Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên

2.2.2 Cơ sở của quá trình chiết

Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hòa tan lẫn với nhau Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng

Quá trình chiết dựa trên đinh luật Nerst:

KA: hằng số phân bố

CA, CB: nồng độ các chất hòa tan trong chất lỏng

A, B không hòa tan lẫn vào nhau

2.2.3 Quá trình chiết thực vật

2.2.3.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng cho quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận Nó cần hòa tan các chất đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy Các dung môi này nên được chưng cất trước khi sử dụng cho quá trình chiết để không làm ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết

Trong các dung môi chiết công nghiệp thường có lẫn một số chất bảo quản như các diankylphtalat, tri-n-butyl-axetylcitrat và tributylphosphat Methanol và clorofoc thường chứa dioctylphtalat, di-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etyhexyl-phtalat Chất này làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật Chất này còn làm sai lệch kết quả hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Clorofoc, metylen clorit và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào, nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào

Ngược lại, khả năng phân cực của clorofoc thấp hơn, có thể rửa các chất nằm ngoài tế bào

Các ancol hoà tan phần lớn các chất phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết với ancol thì các chất này sẽ bị

KA= CA/CB

hoà tan đồng thời Thường dung môi cồn trong nước, dường như có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ, và thường dùng dung dịch nước của metanol

Sau khi chiết, dung môi được tách ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt thì có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

2.2.3.2 Quá trình chiết

Có thể thực hiện một trong ba phương pháp sau:

a/ Chiết Soxhlet: đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi

lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và tiết kiệm dung môi

b/ Chiết ngâm: Ngâm mẫu vào dung môi trong một thời gian rồi

chiết dung môi ra (chiết nguội) Chiết nguội được áp dụng trong việc chiết các hợp chất kém bền nhiệt và thường được sử dụng trong các bể siêu âm để làm giảm thời gian chiết

c/ Chiết hồi lưu: Đun hồi lưu mẫu trong dung môi chiết trong một

thời gian nhất định Phương pháp này được áp dụng để chiết các hợp chất ít phân hủy bởi nhiệt

Việc kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một số cách như:

- Với các ancaloit: có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp

chất này bằng sự tạo kết tủa với những thuốc thử đặc trưng như: Dragendorff, Mayer

- Với các flavonoit: thường là những chất màu, nên khi dịch chảy

ra mà không có màu thì cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết

- Với các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim: phản ứng

Kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat, sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ

đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy tuỳ thuộc đối tượng nghiên cứu và mục đích cần thiết lấy chất

gì mà lựa chọn dung môi cho thích hợp, và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt hiệu quả cao

2.3 Phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký (chromatorgaphy) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

2.3.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký [4]

Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân

bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh

Các chất khác nhau có ái lực khác nhau đối với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ

Hệ quả là các chất có ái lực lớn đối với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn Chính nhờ đặc điểm này mà người ta tách chất qua quá trình sắc ký

2.3.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí [4]

Cơ sở của phương pháp sắc ký chủ yếu chính là hiện tượng hấp phụ – phản hấp phụ của các chất khi pha động chuyển động qua pha tĩnh Đó là nguyên nhân dẫn đến sự phân bố khác nhau của các chất đối với pha động và pha tĩnh

Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là

áp suất riêng phần) được gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

n=n∞bC/(1+bC)

n: lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n∞: lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

b: hằng số

C: nồng độ

2.3.3 Phân loại các phương pháp sắc kí [5]

Có nhiều cách phân loại các phương pháp sắc ký:

- Theo cơ chế hoạt động của sắc ký: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion…

- Theo tính chất của pha tĩnh và pha động cũng như phương pháp thể hiện sắc ký: sắc ký lỏng – rắn trên cột, sắc ký lỏng – lỏng trên bản phẳng hai chiều…

Cơ chế sắc ký có nhiều nhưng để thực hiện các quá trình sắc ký thì chỉ có

2 dạng: dạng cột và dạng bản phẳng

2.3.3.1 Sắc ký cột

Cột sắc ký thường là những ống thủy tinh đường kính d = 0,5 – 5cm và

có độ dài l = 20 - 100cm nạp đầy chất hấp phụ và pha động Pha động dịch chuyển dưới tác dụng của trọng lực Tốc độ chuyển động của pha động được điều chỉnh nhờ van lắp phía dưới cột [4]

Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion

- Silicagel pha thường có công thức hóa học SiO2 xH2O, đây chính là axit silixic, do đó silicagel có tính axit (pH = 3 - 5) nên hấp phụ tốt các chất

có tính bazơ hơn là các hợp chất có tính axit Sự hấp phụ các chất lên bề mặt các hạt silicagel do sự xuất hiện liên kết hidro giữa phân tử các chất nghiên cứu và bề mặt các hạt silicagel với nhóm ≡ SiOH Nếu liên kết hidro xuất hiện càng nhiều thì các phân tử bị giữ vào các chất hấp phụ càng mạnh Đối với sắc ký cột pha thường, các chất ít phân cực ra trước còn các chất phân cực hơn ra sau

- Silicagel pha đảo thường là silicagel được ankyl hóa, tạo ra các gốc

pha đảo, các chất phân cực hơn ra trước còn các chất ít phân cực ra sau (ngược với pha thường)

Chất hấp phụ được nhồi vào cột (phổ biến nhất là cột thủy tinh) Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Độ mịn của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất (áp suất trung bình - MPC, hoặc áp suất cao - HPLC)

Tỉ lệ chiều cao cột (L) so với đường kính cột (D), L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách tức là phụ thuộc vào lượng chất và chất cụ thể

Tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi là Rf , với mỗi một chất sẽ có Rf khác nhau Nhờ sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp

Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng phương pháp khác nhau:

- Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất với silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột

- Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực

tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để đưa chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để rửa giải

- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hòa tan trong dung

môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết

 Những lưu ý:

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để có bọt khí trong cột (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt, gẫy, dò Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

2.3.3.2 Sắc kí lớp mỏng

Về bản chất, đây là loại sắc ký lỏng – rắn mà pha tĩnh rắn được trải thành lớp mỏng trên bản kính, nhựa hay kim loại Các bản phẳng này có đặc điểm là trong suốt với tia tử ngoại (đến 320nm) Giọt dung dịch mẫu nghiên cứu được nhỏ trên đường xuất phát cách rìa bản 3 – 8mm, còn rìa bản được nhúng vào dung môi thích hợp Dung môi này đóng vai trò như pha động trong sắc ký cột Dưới tác dụng của lực mao quản, dung môi sẽ chuyển động dọc theo lớp hấp phụ và chuyển vận các chất với các vận tốc khác nhau đưa đến việc tách các cấu tử Sự khuếch tán các chất trong lớp hấp phụ vừa theo chiều dọc vừa theo chiều ngang Vì các đặc điểm kỹ thuật đó mà phương pháp sắc ký lớp mỏng còn có các tên gọi khác: phương pháp giọt, phương pháp sắc ký dải, phương pháp sắc ký bề mặt, phương pháp sắc ký cột mở… [4]

Đại lượng đặc trưng của sắc ký lớp mỏng là Rf: Rf = Xl / Xf Trong đó:

- Xl là khoảng cách từ đường xuất phát đến tâm của vết sắc ký

- Xf là khoảng cách từ đường xuất phát đến mức dung môi sau cùng Theo định nghĩa, Rf là đại lượng đặc trưng cho hệ sắc ký lớp mỏng Rf phải không phụ thuộc vào nồng độ và các yếu tố khác Tuy nhiên thực nghiệm chứng minh Rf đo được không đủ lặp lại Nó chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như: chất lượng và tính hoạt động của chất hấp phụ, độ ẩm chất hấp phụ, chất lượng dung môi và các yếu tố khác… đó là những yếu tố rất khó kiểm soát

Thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc kí cột Ngoài

ra SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp bằng sử dụng bản SKLM điều chế (bảng được tráng sẵn silicagel dày hơn) Sau khi chạy sắc kí người ta cạo riêng phần silicagel có chứa chất tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt

Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10% trong cồn

2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với các phương pháp sắc kí so sánh

2.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại được được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong nhóm hyroxyl

là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl trong khoảng 1700-1750cm-1

2.4.2Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học của các hợp chất Hiện nay có rất nhiều các loại phổ khối lượng, phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây:

2.4.3 Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy)

Phổ này gọi là phổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu

là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

2.4.4 Phổcộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy, NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là công cụ phân tích cấu tạo các hợp chất hữu cơ cũng như vô cơ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Bằng việc sử dụng

kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có

thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân

tử

Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân dựa vào tính chất hạt nhân tự quay xung quanh trục của nó Hạt nhân tích điện dương nên sẽ tạo ra từ trường Hạt nhân có từ tính đặt trong từ trường ngoài sẽ xảy ra hiện tượng cộng hưởng Tần số cộng hưởng của 1 loại hạt nhân có ít nhiều thay đổi do ảnh hưởng của 2 yếu tố:

- Lớp vỏ điện tử

- Các hạt nhân của các nguyên tử bên cạnh

Do đó, có 2 dữ kiện đặc trưng cho phổ cộng hưởng từ hạt nhân, làm dữ kiện khảo sát cấu tạo của chất là: Độ chuyển dịch hóa học đặc trưng cho ảnh hưởng của lớp vỏ điện tử và hằng số tương tác spin-spin đặc trưng cho ảnh hưởng của các hạt nhân bên cạnh

Có hai loại phổ cộng hưởng từ hạt nhân phổ biến là phổ cộng hưởng từ

proton (PMR, 1 H-NMR) và phổ cộng hưởng từ cacbon ( 13 C-NMR)

Phổ 13 C-NMR có 1 dữ kiện đặc trưng để khảo sát cấu tạo là độ chuyển

dịch hóa học (do tương tác spin-spin giữa các hạt nhân 13 C không đáng kể)

Nó là loại phổ hỗ trợ đắc lực cho phổ 1 H-NMR (do trong trường hợp chất

nghiên cứu có 1 số lượng lớn các hạt nhân từ th́ phổ 1 H-NMR trở nên phức

tạp) Một số kỹ thuật nâng cao của phổ 13 C-NMR là:

- Phổ DEPT 90: cho tín hiệu của 1 nhóm duy nhất CH

- Phổ DEPT 135: cho tín hiệu của C liên kết với H: tín hiệu dương (quay

lên trên) bao gồm tín hiệu của nhóm CH và CH3, tín hiệu âm (quay xuống dưới) là tín hiệu của nhóm CH2

- Phổ APT: cho tín hiệu âm (CH và CH3), tín hiệu dương (C bậc 4 và nhóm CH2)

- Các loại phổ 2 chiều hiện đại như: phổ COSY, phổ HETCOR, phổ

HMBC, phổ HMQC

2.5 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

- Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá

hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên các phiến vi lượng

96 giếng theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991),

và McKane, L., & Kandel (1996)

- Hoạt tính chống oxi hóa được tiến hành theo phương pháp của Shela G., Olga, M B., Elena, K., và cs (2003)

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM

3.1 Thu hái và xử lý mẫu

Lá Nhót được thu hái tại Nhổn, Từ Liêm, Hà Nội vào tháng 2 năm

2015 Sau khi thu hái, mẫu được thái nhỏ và phơi khô ở chỗ mát sau đó sấy khô ở 40oC – 50oC, nghiền nhỏ và bảo quản nơi khô ráo Tên khoa học được Tiến sĩ Nguyễn Quốc Bình – Viện Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam định loại Mẫu tiêu bản số EL 02/2015 được lưu trữ tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.2 Thiết bị và hóa chất dùng cho chiết tách và phân lập hợp chất

3.2.1 Thiết bị

- Máy chiết siêu âm gia nhiệt Memmert GmbH + Co.KG D-91126

Schwabach FRG (Đức)

- Máy cất quay Rotavapor R-114, Buchi (Đức) được sử dụng để cất

loại dung môi

- Máy BOTIUS (Heiztisch Mikroskop) - Đức sử dụng để đo điểm nóng

chảy

- Máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap spectrometer sử dụng đo phổ

khối ESI-MS

- Máy Bruker Avance 500, sử dụng TMS làm chất nội chuẩn để đo phổ

cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1 H-NMR (500MHz) và 13 C-NMR

(125MHz), DEPT

3.2.2 Hóa chất

Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn Silica gel

60 F254 (Merck) độ dày 0.2 mm

Dung môi chiết tách: Dung môi được sử dụng để chiết tách là loại sản

xuất công nghiệp, được cất lại trước khi sử dụng, gồm n-hexan, etyl axetat, clorofom, metanol, nước cất

Phát hiện vết chất: đèn UV 254nm và 368nm, thuốc hiện màu axit

sunfuric 10% trong etanol sấy trên bếp điện từ từ đến khi hiện mầu

3.3 Điều chế các cặn chiết

Bột mẫu khô lá Nhót (2kg) được ngâm chiết với MeOH, quá trình chiết được thực hiện gián đoạn ở nhiệt độ 50°C trong thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt 3 lần, mỗi lần khoảng 4-5 h Dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc

và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng metanol ký

hiệu là EL/MeOH (220g) Cặn metanol sau đó được bổ sung 500 ml nước cất

rồi tiến hành chiết phân bố ở nhiệt độ phòng lần lượt với dung môi n-hexan và etyl axetat, với mỗi dung môi chiết lặp lại 3 lần rồi gom các dịch chiết lại, thu được ba dịch chiết tương ứng Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được

các cặn chiết tương ứng là EL/n-hexan (64,7g), EL/etyl axetat (55,8g),

EL/nước (99,2g)

Dưới đây là sơ đồ điều chế các cặn chiết

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ điều chế các cặn chiết

Chiết phân bố với EtOAc, 3 lần Cất loại dung môi

Cất loại dung môi

Cặn EL/nước

(99,2g)

Cặn EL/EtOAc

(55,8g)